Methodenartikel

Ein In Vitro Modell der Blut-Hirn-Schranke Mit Impedanzspektroskopie: Ein Fokus auf T-Zell-Endothelzellinteraktion

DOI:

10.3791/54592

⸱

8. Dezember 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University Hospital Münster, 2Institute of Biochemistry, University of Münster

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier beschreiben wir ein in vitro Mausmodell der Blut-Hirn-Schranke, das Impedanzzellspektroskopie verwendet, mit einem Schwerpunkt auf den Auswirkungen auf die Integrität und Permeabilität von Endothelzellen bei Interaktion mit aktivierten T-Zellen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Abbau der Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist ein kritischer Schritt in der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen wie Multiple Sklerose (MS) und ihrer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) im Tiermodell. Dieser Prozess ist gekennzeichnet durch die Transmigration von aktivierten T-Zellen durch Endothelzellen (ECs) des Gehirns, die Hauptbestandteile der BHS. Die Auswirkungen auf die EC-Funktion des Gehirns durch die Interaktion mit solchen T-Zellen sind jedoch weitgehend unbekannt. Hier beschreiben wir einen Assay, der es ermöglicht, die Funktion der primären mikrovaskulären EC (MBMEC) des Mausgehirns (MBMEC) und die Barriereintegrität während der Interaktion mit T-Zellen im Laufe der Zeit zu bewerten. Der Assay nutzt die Impedanz-Zellspektroskopie, ein leistungsstarkes Werkzeug zur Untersuchung der Integrität und Permeabilität von EC-Monolagen, indem Änderungen des transendothelialen elektrischen Widerstands (TEER) und der Zellschichtkapazität (Ccl) gemessen werden. In direktem Kontakt mit ECs sind stimulierte, aber nicht naive T-Zellen in der Lage, eine EC-Monolayer-Dysfunktion zu induzieren, was durch eine Abnahme der TEER und eine Erhöhung der CCL sichtbar wird. Der Assay zeichnet Veränderungen der Integrität der EC-Monoschicht kontinuierlich und automatisiert auf. Es ist sensitiv genug, um zwischen unterschiedlichen Reizstärken und T-Zell-Aktivierungsgraden zu unterscheiden, und es ermöglicht die Untersuchung der Folgen einer gezielten Modulation der T-Zell-EC-Interaktion mit Hilfe einer Vielzahl von Substanzen wie Antikörpern, pharmakologischen Reagenzien und Zytokinen. Die Technik kann auch als Qualitätskontrolle für die EC-Integrität in In-vitro-T-Zell-Transmigrationsassays verwendet werden. Diese Anwendungen machen es zu einem vielseitigen Werkzeug für die Untersuchung von BHS-Eigenschaften unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen.

Einleitung

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Die Blut-Hirn - Schranke trennt den systemischen Kreislauf aus dem zentralen Nervensystem (ZNS) von 1 bis 3. Es stellt eine physikalische Barriere, die die freie Bewegung von Zellen und die Diffusion von wasserlöslichen Molekülen und schützt das Gehirn vor Krankheitserregern und potenziell schädlichen Substanzen hemmt. Zusätzlich zu seiner Barrierefunktion ermöglicht die BBB die Abgabe von Sauerstoff und Nährstoffen an das Hirnparenchym, das einwandfreie Funktionieren des neuronalen Gewebes gewährleistet. Funktionelle Eigenschaften der BHS durch ihre zellulären und azellulären Komponenten stark reguliert, mit hochspezialisierten ECs sein Hauptstrukturelement zu sein. ECs der BBB sind durch die Anwesenheit von tight junction (TJ) -Komplexe, der Mangel an fenestrations, extrem niedrige pinocytic Aktivität und permanent aktive Transportmechanismen aus. Andere Komponenten des BBB die EG Basalmembran, pericytes Einbetten des Endothels, astrozytären Ende Füße und = zugehöriges parenchymal Basalmembran tragen auch zur Entwicklung, Wartung und Funktion der BHS 2,4 - 6 und zusammen mit Neuronen und Mikroglia, bilden die neurovaskuläre Einheit (NVU), das reibungslose Funktionieren des ZNS 7 ermöglicht - 9.

In einer Vielzahl von neurologischen Erkrankungen, wie von neurodegenerativen, entzündlichen oder Infektionskrankheiten wird die Funktion der BBB 2,5,10 kompromittiert. Dysregulation von TJ Komplexe und molekulare Transportmechanismen führt BHS-Permeabilität, Leukozytenextravasation, Entzündungen und neuronaler Schädigung erhöht. Um BBB Eigenschaften unter solchen pathophysiologischen Bedingungen, verschiedene in vitro BBB Modelle wurden 9,11,12 etabliert haben zu studieren. Gemeinsam haben sie wertvolle Einblicke in die Veränderungen der Integrität der Barriere, Permeabilität sowie Transportmechanismen zur Verfügung gestellt. Diese Modelle beschäftigen Endothelzellen von Mensch, Maus, Ratte, Schwein oder bSchafen Ursprung 13-18; primären endothelialen Zellen oder Zelllinien kultiviert werden entweder als Monokultur oder zusammen mit Perizyten und / oder Astrozyten , um genauer die BBB in vivo 19 nachzuahmen - 25. In den letzten Jahren Messung der transendothelialen elektrische Widerstand (TEER) hat Eigenschaften 26,27 ein weithin akzeptiertes Werkzeug zur Beurteilung Endothelbarriere werden.

TEER reflektiert die Impedanz für den Ionenfluss durch die Zellmonoschicht und die Abnahme ein empfindliches Maß für kompromittiert endothelialen Integrität der Barriere und damit eine erhöhte Durchlässigkeit. Verschiedene TEER Messsysteme wurden entwickelt, darunter Epithelial Cell (Evom), E - Zell-Substrat - Impedanz - Mess (ECIS) und Echtzeit - Zellanalyse 15,28 - 30. TEER reflektiert den Widerstand gegenüber der Ionenfluss zwischen benachbarten ECs (parazellulärer Weg) und ist direkt proportional zu derBarriere Integrität. In der Impedanzspektroskopie 27,31, komplexe Gesamtimpedanz (Z) gemessen wird , die durch die Messung Ccl zusätzliche Informationen über die Integrität der Barriere zur Verfügung stellt. CCL bezieht sich durch die Zellmembran (transzelluläre Route) mit dem kapazitiven Strom: die Zellschicht wirkt wie ein Kondensator in der elektrischen Ersatzschaltung, die Ladungen auf beiden Seiten der Membran trennt und ist umgekehrt proportional zu der Barrierenintegrität. Wenn auf durchlässigen Einsätzen gewachsen, haften ECs, vermehren und die mikroporöse Membran verteilt. Dies widersteht dem Hintergrund kapazitive Strom des Einsatzes (das sich wie ein Kondensator wirkt), und führt zu einer Abnahme in der Kapazität, bis er seinen minimalen Pegel erreicht. Dies wird durch die Errichtung von TJ gefolgt Komplexe, die Dichtung aus dem Raum zwischen benachbarten ECs. Dies beschränkt den Ionenfluss durch den parazellulären Weg und TEER erhöht, bis es seine Plateau erreicht. Unter entzündlichen Bedingungen wird jedoch die endothelial Barriere beeinträchtigt: TEER abnimmt, wenn TJ erhalten gestört Komplexen und Ccl zunimmt, wenn die kapazitive Komponente des Einsatzes wieder ansteigt.

Unsere TEER Messung nutzt die automatisierte Zellenüberwachung 32 System: Es folgt dem Prinzip der Impedanzspektroskopie und erweitert seine bisherigen Anwendungen. Hier beschreiben wir ein in vitro BBB Modell, das die Untersuchung der Barriereeigenschaften ermöglicht, einschließlich der Interaktion von Hirn Endothel mit Immunzellen; insbesondere aktivierte T-Zellen. 37 - solche pathophysiologischen Bedingungen sind bei Autoimmunerkrankungen des ZNS, wie Multiple Sklerose und seine Tiermodell experimenteller Autoimmun - Enzephalomyelitis 33 beobachtet. Hierbei ist ein entscheidender Schritt ist die Transmigration von enzephalitogenen, Myelin-spezifischen T-Zellen über die BBB. Dies wird durch die Reaktivierung im perivaskulären Raum und den Eintritt in das Hirnparenchym gefolgt, wo sie rekrutieren andere Immunzellen und mirschen Entzündung und anschließender Demyelinisierung 1,35,38. Jedoch molekularen Mechanismen der Wechselwirkung zwischen diesen T-Zellen und Endothelzellen, die wichtigsten Bestandteile der BBB, sind nicht gut verstanden. Unser Protokoll zielt darauf ab , diese Lücke zu füllen und neue Erkenntnisse über die Auswirkungen auf die Endothelzellen (dh Barriere Integrität und Permeabilität) auf ihren direkten Kontakt und komplexe Zusammenspiel mit aktivierten T - Zellen geben.

Das hier beschriebene Protokoll nutzt primäre Mausgehirn mikrovaskulären Endothelzellen, als eine Monoschicht auf durchlässigen Einsätzen mit mikroporösen Membranen gewachsen. Endotheliale Zellen co-kultiviert mit CD4 + T - Zellen, die voraktiviert entweder polyklonal oder in einer Antigen-spezifischen Art und Weise werden kann. Co-Kultur von MBMECs mit voraktivierten, aber nicht naiver T-Zellen induziert eine Abnahme der TEER und eine Zunahme in CCl, die ein quantitatives Maß für die Störung MBMEC Dysfunktion und Barriere bereitstellt. Die Technikist nicht-invasiv: es statt chopstick Elektroden Einbau-Anwendungen, die große Störung der EC-Monoschicht zu verhindern; es kann Barrierefunktion zu überwachen, ohne die Verwendung von Zellmarker verwendet werden. Es macht kontinuierliche Messungen in einer automatisierten Weise und ermöglicht eine unabhängige Beurteilung der beiden Sperrparameter (TEER und CCL) gleichzeitig über die Zeit. Das Verfahren ist auch empfindlich genug, um zwischen verschiedenen Ebenen der T-Zellaktivierung und Wirkungen solcher T-Zellen auf ECs zu unterscheiden.

Es kann in einem weiten Bereich von funktionellen Assays verwendet werden: verschiedene Cytokine und / oder bei entzündlichen Prozessen beteiligt Chemokine können zur Kokultur von MBMECs und T-Zellen hinzugefügt werden; Antikörper gegen Zelladhäsionsmoleküle entweder auf der EC oder T-Zellenseite Blockierung kann verwendet werden; und Inhibitoren der T-Zellaktivierungsmarker oder ihrer zytolytischen Eigenschaften können während der T-Zell-Priming oder deren Co-Kultur mit ECs hinzugefügt werden. Der Test ist auch nützlich für die T-Zell-TransmigrationsAssays, da es als Qualitätskontrolle der MBMEC einschichtigen Integrität vor der Zugabe von T-Zellen dienen kann. All dies macht diese Methode ein vielseitiges und zuverlässiges Werkzeug , um die BBB in vitro zu studieren, mit einem Fokus auf die Wirkung von aktivierten T - Zellen , die auf EC einschichtigen Integrität. Dies ist von besonderer Bedeutung für das Verständnis der Mechanismen der BBB Störung in der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise MS und ihre EAE-Tiermodell, wo selbstreaktive, enzephalitogenen T-Zellen, die BBB durchqueren und Entzündungen und neuronalen Schäden führen.

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Protokoll

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Für alle Versuche wurden die Mäuse gezüchtet und unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen in der zentralen Tieranlage an der Universität Münster, nach den deutschen Richtlinien für die Tierpflege gehalten. Alle Versuche wurden nach den Richtlinien des Tierversuchsethikkommission durchgeführt und von den örtlichen Behörden des Landes Nordrhein-Westfalen, Deutschland (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217) zugelassen.

1. MBMEC Isolierung und Kultur

HINWEIS: Isolieren MBMECs wie zuvor im Detail 14 mit den folgenden Modifizierungen beschrieben:

  1. Sacrifice 20 erwachsenen C57BL / 6 - Mäuse (6-8 Wochen alt) durch CO 2 Inhalation und bestätigen ihr Tod durch Herz- und Atemstillstand festzustellen.
  2. Spülen Sie die Maus mit 70% Ethanol und enthaupten es Schere; Entfernen Sie die Kopfhaut einer Pinzette und Schere. Machen Einschnitte auf der linken und rechten Seite des Schädels, vom Foramen Magnum beginnen. Heben Sie den Schädel von seinem Schwanz Seite und takE das Gehirn mit einer Pinzette aus.
  3. Unter einem Laminar-Flow-Haube, sterile Pinzette das Gehirn in einer Petrischale zu legen und den Hirnstamm, Kleinhirn und Thalamus, halten nur die Rinde entfernen.
    HINWEIS: Die Verwendung eines Mikroskops ist nicht erforderlich, für jeden dieser Schritte.
  4. Legen Sie die Rinde auf ein Stück sterile Western-Blot-Papier und rollen Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette bis Meningen sind nicht mehr sichtbar.
  5. Nach der mechanischen und enzymatischen Verdau (nach dem Protokoll 14) sammeln Endothelzellen aus der Dichtegradient durch einen langen, sterile Nadel und einen 5 ml Kolben verwendet wird . Endothelial Zellen erscheinen als eine trübe Schicht über dem roten Ring mit Erythrozyten. Transfer 20-25 ml dieser Schicht in ein neues 50 ml Zentrifugenröhrchen; ganz oben auf der Röhre mit DMEM auf.
  6. Nach zwei Runden der Wasch 14, Resuspendieren der Zellen in 6 ml MBMEC Medium , das Puromycin (4 & mgr; g / ml) und sie auf sechs beschichteten Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen Samen; lassen Sie sie in einem GewebeKulturbrutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2 (bezeichnet als "Inkubator" von hier an) für drei Tage.
    HINWEIS: Details der MBMEC Beschichtungslösung, siehe Materialien Tabelle.
  7. Ändern Sie das Medium durch Zugabe von 1 ml zu jeder Vertiefung von frischem MBMEC Medium ohne Puromycin; legte die Platte wieder bei 37 ° C und 5% CO 2 für zwei weitere Tage.

2. Ernte MBMECs

  1. Am Tag fünf nach MBMEC Isolation Lösung Precoat-durchlässige Einsätze mit MBMEC Beschichtung: 80 ul Lösung pro Einsatz hinzufügen und bei 37 ° C und 5% CO 2 für 3 Stunden verlassen.
  2. Pipette vorsichtig die Beschichtungslösung und die Einsätze der Luft trocknen für 30 Minuten lassen. 2 ml Raumtemperatur (RT) PBS in jede Vertiefung der Platte, MBMECs mit dem Medium zu waschen; Wiederholen Sie diesen Schritt. In 0,05% Trypsin-EDTA (300 & mgr; l pro Vertiefung) und lassen Sie die Platte in den Inkubator für 5-10 min.
  3. 2 ml MBMEC Medium zu jeder Vertiefung zu stoppenTrypsinierung. Übertragung der gesammelten Zellen auf eine 15 ml Zentrifugenröhrchen und zentrifugiere sie bei 700 × g für 8 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 1 ml MBMEC Medium ohne Puromycin.
  4. Zählen Sie die Zellen; 10 ul der Zellsuspension mischen mit 90 & mgr; l 0,04% Trypan-Blau (10x Verdünnung der Zellen). Je 10 ul dieser Mischung zwischen der Glasabdeckung und die Zellzählung Kammer (Hämozytometer). Zählen Trypan Blau-freien Zellen in allen vier Quadranten der Kammer (N) und bestimmen die durchschnittliche Anzahl der gezählten Zellen (N ') wie folgt: N' = N / 4 ist.
  5. Berechnen der Zellkonzentration (in 10 & sup6 ; Zellen / ml) mit der folgenden Formel: C = N 'x 10 4 x 10, wobei 10 4 durch die Abmessungen des Hämozytometer gegeben und 10 ist der Verdünnungsfaktor aus Schritt 2.4.
  6. Seed 2 x 10 4 Zellen in einem Volumen von 260 & mgr; l pro Platte. In 810 ul MBMEC mittleren bis unteren Fach jeder Vertiefung. Legen Sie die Platte mit Einsätzen in den Inkubator, bis sie bereit mit Abschnitt 4 fortzufahren.
    HINWEIS: Die Volumina für die obere und untere Fach sind einsatzspezifisch und funktionieren nicht für alle 24-Well-Formate.

3. CD4 + T - Zell - Isolierung und Stimulation

  1. CD4 + T - Zell - Isolation
    1. Sacrifice einer erwachsenen Maus (6-8 Wochen alt) durch CO 2 Inhalation und bestätigen seinen Tod durch Herz- und Atemstillstand festzustellen.
    2. Platzieren Sie die Maus auf dem Rücken auf einer sauberen Dissektion Bord und spülen Sie ihn mit 70% Ethanol; Verwenden einer sterilen Schere und Pinzette das Peritoneum zu öffnen und die Milz und Lymphknoten (Leisten, Achsel, brachial und Gebärmutterhalskrebs) zu entfernen; Schließlich übertragen die Gewebe in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen, die 5 ml PBS auf Eis.
    3. Unter laminaren Strömungshaube, übertragen das Gewebe durch PBS mit dem Gewebe in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 70 & mgr; m Zellsieb auf Dekantierung; homogenisierendas Gewebe durch sie mit einer 1 ml Kolben durch das Sieb zu drücken.
    4. 30 ml FACS-Puffer und Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 10 ml FACS-Puffer. Filtern Sie die Suspension durch eine 40 um Zelle Sieb, fügen Sie eine weitere 20 ml FACS-Puffer auf das Rohr.
    5. Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 500 & mgr; l FACS-Puffer.
    6. In 20 ul Maus-CD4 magnetischen Mikrokügelchen, gut mischen und Inkubation für 15 min bei 4 ° C. 25 ml FACS-Puffer und Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C.
    7. In der Zwischenzeit legen Sie eine LS-Trennsäule in den Magneten und spülen Sie ihn mit 3 ml FACS-Puffer. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 3 ml FACS-Puffer.
    8. Hinzufügen von Zellen an die Säule. Die Säule wird mit 3 ml FACS dreimal puffern. Entfernen Sie die Säule aus dem Magneten und legen Sie es auf eine neue 15 ml centrifugation Rohr. 5 ml FACS-Puffer, spülen Sie die markierten Zellen mit dem Säulenkolben und Zentrifuge bei 500 xg für 5 min 4 ° C.
    9. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 3 ml T-Zellmedium. Zählen Sie die Zellen wie in 2.4 und Samen 1 x 10 5 Zellen in 100 ul Medium pro Vertiefung.
  2. CD4 + T - Zell - Stimulation
    1. Polyklonale CD4 + T - Zell - Stimulation
      1. Pre-coat eine Rundboden 96-Napf-Platte mit gereinigtem anti-Maus-CD3-Antikörper (Klon 145-2C11) in PBS, bei einer gewünschten Endkonzentration. Zum Beispiel, vor der Beschichtung der volle Platte mit α-CD3 bei 1 & mgr; g / ml, mischen 10 ul der Antikörper (Stammkonzentration = 0,5 mg / ml) mit 5 ml PBS, Wirbel und 50 ul der Mischung jede Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette.
      2. Lassen Sie die Platte in den Inkubator für 3 Stunden. Nachdem die T-Zellen zu isolieren, waschen Sie die vorgezogene Platte zweimal mit PBS. Hinzufügen gereinigter anti-CD28-Antikörper (Clon37,51) auf isolierte T - Zellen in einer Endkonzentration gewünschte (beispielsweise bei 1 & mgr; g / ml); gut mischen. Samen der T-Zellen und lassen sie in den Inkubator für zwei bis drei Tage.
    2. Antigen-spezifische CD4 + T - Zell - Stimulation mit dendritischen Zellen (DCs)
      HINWEIS: Wenn DCs als Antigen-präsentierende Zellen (APCs) verwendet werden, folgen Sie dem Protokoll für die T-Zell-Isolierung, mit folgenden Ausnahmen:
      1. Bevor die Milz Homogenisieren, injizieren sie mit 1 ml Kollagenase Typ IA in PBS bei 0,5 mg / ml und übertragen sie in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen.
      2. Inkubieren im Wasserbad bei 37 ° C für 15 min. Nach Waschen mit PBS, das Pellet in FACS-Puffer resuspendiert und 20 ul Maus CD11c magnetische Microbeads, anstelle von CD4 Microbeads hinzuzufügen.
      3. Verwenden Sie eine MS Trennsäule und die entsprechenden Volumina: Spülen der Säule mit 1 ml FACS-Puffer; Die Zellen in 1 ml FACS-Puffer und wasche die Säule mit 1 ml FACS-Puffer dreimal.
      4. Anzeiged Antigen der Wahl zu DCs (zB Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) aa 35-55 bei 20 ug / ml), gut mischen und Samen 5 x 10 4 Zellen in 100 & mgr; l der T - Zellkulturmedium pro 96-Runden-Bottom Gut.
      5. 1 x 10 5 T - Zellen in 100 & mgr; l der T - Zellkulturmedium pro 96-Rundboden-gut am Ende, wie es in dem Protokoll für T - Zell - Isolierung beschrieben.
    3. Antigen-spezifische CD4 + T - Zell - Stimulation mit B - Zellen
      HINWEIS: Wenn B-Zellen als APCs verwendet werden, folgen Sie dem Protokoll für die T-Zell-Isolierung, mit folgenden Ausnahmen:
      1. Verwenden Milzen aus transgenen Mäusen , deren B - Zellen sind Antigen-spezifische ( zum Beispiel IgH MOG (Th) Mäuse, deren B - Zellen spezifisch erkennen MOG 35-55).
      2. Verwenden antigen-spezifischen T - Zellen (zB von TCR MOG (2D2) -Mäuse). In 20 ul Maus CD19 magnetischen Mikrokügelchen anstelle von CD4-Mikrokügelchen.
      3. Fügen Sie das Antigen der Wahl an die B cells (zB MOG 35-55 bei 20 ug / ml), gut mischen und Samen 5 x 10 4 Zellen in 100 & mgr; l der B - Zellkulturmedium pro 96-Runden-bottom-gut.
      4. 1 x 10 5 T - Zellen in 100 & mgr; l der T - Zellkulturmedium pro 96-Runden-bottom-gut, wie es in dem Protokoll für T - Zell - Isolierung beschrieben.

4. Einrichten und Durchführen TEER Mess

  1. Legen Sie die 24-Well-Modul des TEER Instrument unter der Laminar-Flow-Haube. Entfernen Sie die Deckel und Platz Einsätze mit MBMECs im Gerät mit einer Pinzette.
  2. Pipette 810 ml frisches Medium zu der unteren Kammer des Moduls Brunnen: fügen Sie es sorgfältig zwischen dem Einsatz und der Wand des Moduls gut.
  3. Schließen Sie den Deckel und legen Sie das Gerät in den Inkubator. Schließen Sie das Gerät an seinem Computer; schalten Sie die Gerätesteuerung und die Software öffnen.
  4. Wählen Sie "neue Messung" im Pop-up-Fenster. Check 'show TEER "und" show CCL-Boxen; und drücken Sie dann "Start". Nach der ersten Messung abgeschlossen, wählen Sie "überprüfen Sie alle Brunnen" in der Registerkarte "Ergebnisse" alle TEER und Ccl Werte zu sehen.
  5. Speichern Sie die Datei: Datei> Speichern unter> 'den Namen der Datei'.
    HINWEIS: Als TEER und Ccl kontinuierlich in einer automatisierten Weise gemessen werden, deren Werte über einen Zeitraum von drei bis fünf Tagen zu überwachen. Mediumwechsel ist nicht erforderlich, es sei denn, die Lebensfähigkeit der Zellen suboptimal ist, wie durch eine fehlende Zunahme in TEER visualisiert.
  6. Wählen Sie den Zeitpunkt zu Kokultur MBMECs mit Zellen T , wenn Ccl stabil ist und weniger als 1 & mgr; F / cm 2 und TEER seinen Maximalpegel erreicht.
  7. inspizieren sorgfältig absolute TEER und Ccl Werte und schließen Sie die Vertiefungen, in denen MBMECs nicht konfluent genug Monolayern von unchecking solche Brunnen entwickelt haben.
  8. Gruppe der Rest aus den Brunnen der rechten Maustaste auf ein gut und wählen Sie "Add gut an neue durchschnittlich gut". Name es in dem Pop-up-Fenster; das gleiche für alle einzelnen Vertiefungen zu gruppieren.
  9. Überprüfen Sie alle durchschnittlichen Brunnen, um zu bestätigen, dass sie alle haben die gleichen Ausgangsbedingungen vor der Co-Kultur. Wenn einige signifikant unterschiedliche absolute TEER-Werte haben oder TEER abfällt, oder die Standardfehler zu groß sind, wiederholen Sie die Gruppierung.
    HINWEIS: Die optimale Gruppierung von Brunnen bietet minimale Variation in TEER-Werte, sowohl innerhalb als auch zwischen den Versuchsgruppen.
  10. Im "Experiment" Registerkarte, drücken Sie "Pause", trennen Sie das Gerät und nehmen Sie es aus dem Inkubator. Entfernen Sie die Deckel unter der Laminar-Flow-Haube.
  11. Vorbereitung voraktiviert und / oder naiven T-Zellen, mit oder ohne spezifische Cytokine, Antikörper oder andere Substanzen, wie gewünscht: Zum Beispiel: gereinigtes mischen NA / LE Ratten-anti-Maus-IFN-γ-Antikörper (Klon XGM1.2) mit vorbereiteten T Zellen bei 20 & mgr; g / ml pro Vertiefung des TEER Instruments.
    HINWEIS: Wenn Substanzen wie Granzym B-Inhibitor verwendet werden, sind sie einzu T Zellkultur dded zu Beginn der T - Zell - Stimulation: zB Granzyme B Inhibitor II (Calbiochem) in einer Endkonzentration von 10 uM in DMSO mit isolierten T - Zellen gemischt. Siehe Materialien und Geräte für weitere Details.
  12. Entfernen einen Teil des Mediums aus dem Einsatz (das obere Fach gut): zB vorsichtig pipettiert aus 150 ul (Entfernen all das Medium vermieden werden sollten , da sie die MBMEC einschichtigen stören könnte).
  13. Hinzufügen T - Zellen zu MBMECs durch vorsichtiges Pipettieren von 150 ul Medium , enthaltend 2 x 10 5 Zellen / Insert.
    HINWEIS: Bei der Pre-aktivierte T-Zellen zu ernten, zählen nur Strahlen, Trypanblau-freien Zellen.
  14. Schließen Sie den Deckel und legen Sie das Gerät wieder in den Inkubator. Schließen Sie das Gerät ein und drücken Sie "Resume Messung". Nach 24 Stunden, drücken Sie "Stop" in der "Experiment" Registerkarte und speichern Sie die Datei (Datei> Speichern).

5. Datenexport und statistische Analyse

  1. Exportieren Sie die Ergebnisse, indem Sie Datei> Exportieren.
  2. In der Registerkarte "Einstellungen" des Pop-up-Fenster, wählen Sie ".dot" in der "Dezimaltrennzeichen" -Option und "Tabulator" in der "Feldtrennzeichen" -Option.
  3. In der "Exportergebnisse" Registerkarte benennen Sie die Datei, überprüfen Sie alle Brunnen exportiert werden, und überprüfen Sie die "TEER" und "Ccl" Boxen im "wählen Daten" aus.
  4. Drücken Sie auf "Exportieren von Daten", öffnen Sie die exportierte Datei, und die Daten in eine Tabelle kopieren.
  5. Normalisieren die exportierten Daten (durch jede Wiederholung sortiert, mit TEER und Ccl Werte für jeden Lauf (Messung gegeben)): Set TEER und Ccl Werte der letzten Zeitpunkt vor der Co-Kultur zu 100% und ändern entsprechend die Werte für alle anderen Läufe, bezogen auf die '100%' laufen.
  6. Kopieren normalisierten Daten in eine Software der Wahl eines Graphen zu generieren, indem die einzelnen Vertiefungen und der Standardfehler des Mittelwerts für jede Behandlungsgruppe anzeigt.
  7. Perform Zwei-Wege-ANOVA statistischen Test mit Bonferroni-Korrektur für multiple Vergleiche, die Statistik-Software der Wahl.

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Ergebnisse

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Abbildung 1 gibt eine allgemeine Übersicht über die in vitro - Modell BBB die Wechselwirkung zwischen T - Zellen und Endothel - Zellen zu untersuchen verwendet. Das Experiment besteht aus drei Hauptschritten. Der erste Schritt ist die Isolierung von primären MBMECs aus Gehirnrinden, und ihre Kultur für fünf Tage. Wenn sie Konfluenz in der Zellkulturplatte zu erreichen, werden auf MBMECs permeablen Einsätzen trypsinisiert und reseeded, die in der TEER Instrument ...

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Diskussion

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Mehrere Schritte des beschriebenen Protokolls sind unerlässlich für ein erfolgreiches Experiment. Während der anfänglichen MBMEC Isolierung und Kultur, ist es entscheidend, dass Arbeiten unter sterilen Bedingungen, so viel wie möglich durchgeführt, um die Kontamination der Zellkultur mit Pilzsporen oder Bakterien zu verhindern. Um eine reine Kultur von ECs zu erhalten, wird empfohlen , ein Medium , das Puromycin für die ersten drei Tage zu verwenden, die das Überleben von ECs ermöglicht, nicht aber andere Zelltypen (vor...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I. Kuzmanov, A. M. Herrmann, S. G. Meuth, H. Wiendl und L. Klotz haben nichts offenzulegen. H.-J. Galla ist wissenschaftlicher Berater der nanoAnalytics GmbH, dem Hersteller des automatisierten Zellmonitors.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir sind dankbar, dass Annika Engbers und Frank Kurth für ihre hervorragende technische Unterstützung und Dr. Markus Schäfer (nanoanalytics GmbH) für hilfreiche Diskussionen über TEER-Messungen. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) unterstützt wird, SFB1009 Projekt A03 bis HW und LK, CRC TR128, Projekte A08; Z1 und B01 bis LK und HW, und das Interdisziplinäre Zentrum für Klinische Forschung (Medizinische Fakultät Münster) Gewährungsnummer Kl2 / 2015/14 bis LK.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
cellZscopenanoAnalytics GmbHwww.nanoanalytics.combestehend aus: 24-Well-Zellmodul, Controller, PC mit cellZscope Software v2.2.2 
UltrazentrifugeThermo Scientificwww.thermoscientific.comSORVALL RC 6+; Rotor F21S-8x50y; für MBMEC Isolations-Durchflusszytometer
Beckman Coulterwww.beckmancoulter.comfür die Analyse der T-Zell-Transmigration
FlowJo7.6.5 SoftwareTree Starwww.flowjo.comfür die Analyse der T-Zell-Transmigration
Oak Ridge Zentrifugenröhrchen, PCThermo Fisher Scientific3118-005050 ml; für MBMEC-Isolierung
Transwell-Membraneinsätze - Porengröße 0,4 & Mikro; mCorning3470für die TEER-Messung als Hauptanzeige
Transwell-Membraneinsätze - Porengröße 3 & Mikro; mCorning3472für die TEER-Messung als Qualitätskontrolle vor dem T-Zell-Transmigrationsassay
24-Well-ZellkulturplatteGreiner650 180mit flachem Boden; für MBMEC-Kultur
96-Well-ZellkulturplatteCostar3526mit rundem Boden; für Immunzellkultur
QuadroMACS-SeparatorMiltenyi Biotec130-090-976für T-Zell- und B-Zellisolierung; unterstützt MACS LS Säulen
OctoMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-109für die Isolierung dendritischer Zellen; unterstützt MACS MS Säulen
Neubauer ZählkammerMarienfeldMF-0640010für die Zellzählung
Zellsieb, 70 & Mikro; mCorning352350für die Isolierung von Immunzellen
Zellsieb, 40 & Mikro; mCorning352340für die Isolierung von Immunzellen
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303für die Isolierung von Immunzellen
MACS LS TrennsäulenMiltenyi Biotec130-042-401für die Isolierung von T-Zellen und B-Zellen
MACS MS TrennsäulenMiltenyi Biotec130-042-201für die Isolierung dendritischer Zellen
Maus CD4 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-049-201für CD4+ T-Zell-Isolierung
Maus CD19 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-052-201für B-Zell-Isolierung
Maus CD11c MicroBeadsMiltenyi Biotec130-052-001für die Isolierung dendritischer Zellen
Kollagen Typ IV aus menschlicher PlazentaSigmaC5533für MBMEC-Beschichtungslösung
Fibronektin aus RinderplasmaSigmaF1141-5MGfür MBMEC-Beschichtungslösung
Collagenase 2 (CSL2)WorthingtonLS004176für MBMEC-Isolierung
Kollagenase/Dispase (C/D)Roche11097113001für MBMEC-Isolierung
DNase ISigmaDN25für MBMEC-Isolierung
Fötales Rinderserum (FBS)SigmaF7524für MBMEC-Isolierung
Rinderserumalbumin (BSA)Amresco0332-100Gfür die MBMEC-Isolierung
PercollSigmaP1644-1Lfür die MBMEC-Isolierung
DMEM (+ GlutaMAX)Gibco31966-021für die MBMEC-Isolierung und MBMEC-Kulturmedium
Penicillin/StreptomycinSigmaP4333für die MBMEC-Isolierung und MBMEC-Kulturmedium
Phosphatgepuffert Kochsalzlösung (PBS)SigmaD8537für MBMEC und Immunzellisolierung
HeparinSigmaH3393für MBMEC-Kulturmedium
Humaner basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF)PeproTech100-18Bfür MBMEC-Kulturmedium
PuromycinSigmaP8833für MBMEC-Kulturmedium; nur für die ersten drei Tage
0,05 % Trypsin-EDTAGibco25300-054für die Gewinnung von MBMECs
Kollagenase Typ IASigmaC9891für die Isolierung dendritischer Zellen
Trypanblau-Lösung, 0,4 %ThermoFisher Scientific15250061für die Zellzählung
EDTASigmaE5134für die Isolierung von Immunzellen
IMDM + 1 % L-GlutaminGibco21980-032für T-Zellkulturmedium
X-VIVO 15LonzaBE04-418QSchutz vor Licht; für B-Zell-Kulturmedium
&Beta-MercaptoethanolGibco31350-010für B-Zell-Kulturmedium
L-Glutamin (100x Glutamax)Gibco35050-061für B-Zell-Kulturmedium
Maus MOG35— 55 PeptidBiotrendBP0328für die antigenspezifische T-Zell-Aktivierung
gereinigter Anti-Maus-CD3 AbBioLegend100302-Klon 145-2C11; für die Aktivierung polyklonaler T-Zellen
gereinigter NA/LE-Anti-Maus-CD28 AbBD Pharmingen553294-Klon 37.51; für die Aktivierung polyklonaler T-Zellen
Rekombinantes murines IFN-& gamma;PeproTech315-05für T-Zell-Transmigrationsassays
Rekombinantes murines TNF-αPeproTech315-01Afür T-Zell-Transmigrationsassays
NA/LE gereinigter Anti-Maus-IFN- & Gamma-AntikörperBD Biosciences554408Klon XMG1.2; empfohlene Endkonzentration: 20 &Mikro; g/ml
Granzyme B Inhibitor IICalbiochem368055empfohlene Endkonzentration: 10 µ M
PE Anti-Maus-CD4-AntikörperBiolegend116005Klon RM4-4; zur Analyse der T-Zell-Transmigration

Referenzen

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