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Methodenartikel

Ein Facile und umweltfreundliche Weg zu fabrizieren Poly (Milchsäure) Scaffolds mit Graded Porengröße

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DOI:

10.3791/54595

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17. Oktober 2016

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1Department of civil, environmental, aerospace, and materials engineering (DICAM), RU INSTM, University of Palermo

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wurden Gerüste aus Poly(milchsäure)/Polyethylenglykol (PLA/PEG) mit einer Kombination aus Schmelzemischen und selektiver Laugung hergestellt. Das hierin diskutierte Verfahren ermöglichte die Entwicklung von dreischichtigen Gerüsten durch hochgradige Kontrolle sowohl der Porosität als auch der Porengröße. Die mechanischen Eigenschaften wurden auch in einer physiologischen Umgebung bewertet.

Zusammenfassung

In den letzten Jahren haben funktionell abgestufte Gerüste (FGS) eine entscheidende Rolle bei der Herstellung von Geräten für das Tissue Engineering übernommen. Die Bedeutung dieses neuen Bereichs der Biomaterialforschung beruht auf der Notwendigkeit, Implantate zu entwickeln, die in der Lage sind, die komplexe Funktionalität der verschiedenen Gewebe nachzuahmen, einschließlich eines kontinuierlichen Wechsels von einer Struktur oder Zusammensetzung zur anderen. In diesem Zusammenhang ist ein Hauptthema von Interesse die Gestaltung geeigneter Gerüste für Knochen-Knorpel-Grenzflächengewebe. In dieser Studie wurden dreischichtige Gerüste mit abgestufter Porengröße durch Schmelzmischen von Poly(milchsäure) (PLA), Natriumchlorid (NaCl) und Polyethylenglykol (PEG) hergestellt. Die Porengrößenverteilungen wurden durch NaCl-Granulometrie und PEG-Solvatation kontrolliert. Die Gerüste wurden aus morphologischer und mechanischer Sicht charakterisiert. Es wurde ein Zusammenhang zwischen der Präparationsmethode, der Porenarchitektur und dem druckmechanischen Verhalten festgestellt. Die Grenzflächenhaftfestigkeit wurde quantitativ mit Hilfe eines speziell entwickelten Grenzflächenfestigkeitstests bewertet. Um die menschliche Physiologie nachzuahmen, wurden darüber hinaus auch mechanische Tests in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei 37 °C durchgeführt. Das hier vorgestellte Verfahren bietet eine hohe Kontrolle der Porosität, der Porengrößenverteilung und der mechanischen Leistung und bietet somit die Möglichkeit, dreischichtige Gerüste mit maßgeschneiderten Eigenschaften herzustellen, indem ein einfacher und umweltfreundlicher Weg verfolgt wird.

Einleitung

Das Interesse an biologisch abbaubaren Polymeren hat in den letzten Jahren sowohl in der akademischen Welt als auch in der Industrie an Bedeutung gewonnen, aufgrund der zunehmenden Besorgnis über Plastikmüll und der Reduzierung der Verwendung nicht erneuerbarer Quellen1-7. Insbesondere biokompatible und biologisch abbaubare synthetische Polymere sind in mehreren biomedizinischen Anwendungsbereichen weit verbreitet, wie z. B. in der arzneimittelkontrollierten Freisetzung8,9, in resorbierbaren Nahtfäden8,10, in der Bioprozessintensivierung11 und im Tissue Engineering12.

Tissue Engineering konzentriert sich auf die Entwicklung von Geräten, die in der Lage sind, die normale Funktion in erkranktem oder verletztem Gewebe wiederherzustellen und aufrechtzuerhalten. Die meisten nativen Gewebe bestehen aus verschiedenen Zelltypen und extrazellulären Matrizen (ECMs) in spezifischen räumlichen Hierarchien. Zum Beispiel besteht der Gelenkknorpel (AC) aus verschiedenen Zonen mit unterschiedlichen Arten und Orientierungen von Kollagenfasern und kollagenbindenden Proteinen. Darüber hinaus weisen Knorpel und Knochen deutlich unterschiedliche hierarchische Strukturen auf. In diesem Zusammenhang könnte die Herstellung von mehrschichtigen Gerüsten mit technischen Eigenschaften in jeder Schicht den Ersatz heterogener Gewebe ermöglichen, indem alle lokalen Mikroumgebungen dieser komplexen Systeme berücksichtigtwerden 13,14.

Basierend auf den zellulären/biologischen und/oder physikalisch-chemischen Eigenschaften der Gerüste können die Hauptstrategien des Tissue Engineering in monophasisch, biphasisch und triphasisch unterteilt werden. Biphasische und triphasische Ansätze (BTA) verwenden zwei oder drei verschiedene Porenarchitekturen, Materialien oder Füllstoffe, um mehrschichtige funktionale Bauelemente herzustellen. Darüber hinaus kann ein einzelnes Material verwendet werden, um biphasische oder triphasische Bauelemente zu erzielen, solange es möglich ist, einen Gradienten in seinen physikalischen Eigenschaftenzu erzeugen 12.

Die Zellmigration spielt eine Schlüsselrolle bei der Morphogenese, Entzündung, Wundheilung und Tumormetastasierung. Die Zellbewegung wird durch das Vorhandensein eines Gradienten chemisch-physikalischer Eigenschaften von der Oberfläche bis zum Kern des Geräts gefördert. Daher können Biomaterialien, die die oben diskutierten Anforderungen erfüllen, bei der Untersuchung der Zellmigration hilfreich sein. Neben chemischen Gradienten, die die Zellmigration (Chemotaxis) auslösen, können auch mechanische Eigenschaften des Zellkultursubstrats zu Zellbewegungen (Mechanotaxis) führen15.

Die Mehrschichtstruktur kann auch die einstellbare Freisetzung spezifischer Wirkstoffe ermöglichen, die in die Polymermatrix eingebaut sind, indem der spezifische Bereich der Schicht oder die Menge der geladenen Wirkstoffe geändert wird.

In den letzten zehn Jahren wurden zur Entwicklung von Gerüsten, die einen diskreten oder kontinuierlichen Gradienten morphologischer Eigenschaften, wie Porosität oder Porengröße, besitzen, mehrere Ansätze vorgestellt16-31. Die jüngsten Arbeiten konzentrierten sich auf die Herstellung von BTA unter Verwendung von: Partikellaugung 12,28,32, Gasschäumtechnik16, Elektrospinnen17-19, Schicht-für-Schicht-Gießtechnik20, Rapid Prototyping21,22, thermisch induzierte Phasentrennung (TIPS)22, Zentrifugation Gefriertrocknung24,25, dreifach periodische minimale Oberflächen (TPMS)26, Gefrierguss27-30.

Im Rahmen dieser Arbeit präsentieren wir einen schnellen und einfachen Weg, um dreischichtige poröse Gerüste (TLS) auf PLA-Basis zu erzielen, indem wir Schmelzmischen, Formpressen und Salzlaugung kombinieren. Im Gegensatz zu den meisten Technologien, die üblicherweise für die Gerüstherstellung verwendet werden, kann die hier gewählte Strategie als vollständig umweltfreundlich angesehen werden, da sie kein giftiges Lösungsmittel benötigt, das für die Umwelt und für lebende Zellen und Gewebe potenziell gefährlich ist32. Die grundlegenden Verarbeitungs-Struktur-Eigenschaftsbeziehungen, die in dieser Studie durch die Analyse sowohl morphologischer Merkmale als auch des mechanischen Verhaltens von hergestellten Bauelementen festgestellt wurden, bieten eine Orientierungshilfe für zukünftige Fortschritte bei der Konstruktion multifunktionaler abgestufter Gerüste mit spezifischen Zieleigenschaften.

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Protokoll

1. Scaffold Fabrication

  1. Mahlen NaCl in einem Labormischer für 20 min trocknen und es auf einem Erhitzer auf 100 ° C.
  2. Setzen Sie den getrockneten NaCl (45 g zum Zeitpunkt) in einer Siebmaschine 30 Minuten bei der höchsten verfügbaren Frequenz ohne in Resonanz auftritt. Sammeln sechs Salzfraktionen, im Bereich von 500 um bis 1000 um (M 500); von 300 um bis 500 um (M 300); von 100 um bis 200 um (M 100); von 90 um bis 100 (M 90); von 45 & mgr; m bis 65 & mgr; m (M 45) und schließlich 10 M mit Salzpartikel Größe kleiner als 45 um , wie in Abbildung 1 schematisch dargestellt.
  3. Vakuum-Trocknen über Nacht alle Materialien, um hydrolytische Spaltung bei der Verarbeitung zu vermeiden. Für jedes Material wählen, die Temperatur, um den Trocknungsgrad ohne Überwindung zu maximieren - im Falle von Polymeren, - die Glasübergangs. Daher T = 90 ° C für PLA und T = 25 ° C für PEG, T = 105 ° C für NaCl wählen.
  4. FütternPLA, PEG und NaCl, mit einem Gewichtsprozentzusammensetzung 20/5/75 jeweils zu einem Chargenmischer Betriebs bei T = 190 ° C, und n = 60 rpm und dann verarbeiten, bis ein konstanter Wert des Drehmoments zu erreichen, in der Regel nach ca. 10 Minuten. Danach sammeln schnell das erhaltene Material.
  5. Bereiten Sie die Monoschichten durch eine Laborpresse bei 210 ° C betrieben wird, legen Sie die Mischungen in geeigneten zylindrischen Formen mit einem Durchmesser von 10 mm und einer Höhe von 3 mm und halten sie für 60 Sekunden bei Umgebungsdruck und 3 Minuten bei 180 bar . Danach kühlen die Mischungen bei Raumtemperatur, um den Druck von 180 bar gehalten wurde.
  6. Versammlung der Drei-Schichten über Formpressen
    1. Bereiten Sie jede einzelne Schicht in der gleichen Weise wie in (1.5), aber unter Verwendung unterschiedlicher Formen, dh einen Durchmesser von 10 mm und einer Höhe von 1 mm. Schließlich erhalten 6 Scheiben mit einem Durchmesser von 10 mm und einer Höhe von 1 mm, mit sechs unterschiedlichen Teilchengrößen: M 500, M 300, M 100,
    2. for Montage dreischichtige Gerüst A (TLS A), häufen sich M 500, M 300 und M 100 innerhalb der zylindrischen Form und kompressions formen sie in einer Laborpresse für 60 Sekunden bei Umgebungsdruck und 3 Minuten bei 210 ° C, der bei 180 bar und abgekühlt, dann bei Raumtemperatur, um den Druck von 180 bar gehalten wurde.
      HINWEIS: Bereiten Sie die TSL B von M aufeinander stapeln 90, M 45 und M 10 in den gleichen Formen und führen die Formpressen Betrieb durch das gleiche Verfahren wie für die TLS-A verwendet folgende
  7. Entfernen Sie die Platten aus den zylindrischen Formen und steckte sie in einem siedenden Wasserbad entmineralisiert, ohne sich zu rühren. 3 Stunden nach, entfernen Sie die erhaltenen porösen Strukturen aus dem Bad und lassen Sie sie für 12 Stunden bei Raumtemperatur in einer chemischen Haube trocken.

2. Morphologische Analyse

  1. Werten die Morphologien der Gerüste durch Rasterelektronenmikroskopie.
    1. Überwinden Sie die Proben unter flüssigem Stickstoff und befestigen Sie dann dieProben auf einem Aluminium Stub einen Klebstoff Kohlenstoffband verwendet wird. Schließlich Sputter-coate mit Gold für 90 s unter Argonatmosphäre vor der Abbildung, um während der Prüfung elektrostatische Entladungen zu vermeiden.

3. Scaffold Porengröße

  1. Aufwendige die durch SEM-Analyse erhaltenen Bilder mit einer Bildverarbeitungssoftware können die Porengrößenverteilung des Gerüsts zu erkennen.
    HINWEIS: In dieser Arbeit wird die Verteilungsanalyse Porengröße wurde zuvor eine MATLAB-basierte Software durchgeführt 33 beschrieben

4. Porösität

  1. Wiegen der Proben vor dem Auslaugen und bewerten die theoretische Porosität nach dem folgenden Ausdruck:
    figure-protocol-1
    HINWEIS: M NaCl, m und m PEG PLA, sind jeweils die theoretische Masse von NaCl, PEG und PLA, durch homogene Mischungen übernehmen. Ter Dichten (ρ) von NaCl, PEG und PLA jeweils 2,16 g / cm 3, 1,12 g / cm 3 e 1,24 g / cm 3.
  2. Wiegen Sie die Proben nach dem Auslaugen und Trocknen, um die scheinbare Dichte der Proben (ρ Gerüst) zu beurteilen, und dann auszuwerten die reale Porosität als der Kehrwert des Verhältnisses zwischen der scheinbaren Dichte des Gerüsts und die Dichte des nicht-porösen PLA durch Verwendung von Ausdruck (2).
    HINWEIS: Es drückt das Verhältnis zwischen dem Leervolumen des Gerüsts und das volle Volumen des Gerüsts (leer + voll).
    figure-protocol-2

5. Mechanische Eigenschaften

  1. Testen Sie die Proben unter Druckmodus einen Zug-Maschine, ausgerüstet mit einer 1 kN Lastzelle. Stellen Sie einen konstanten Verformungsgeschwindigkeit von 1 mm min -1.
  2. Um die mechanische Leistung der Proben in physiologischer Umgebung zu untersuchen, statten die dynamometer mit einem Bad mit (PBS) (pH = 7,4) bei 37 ° C und den Test mit dem gleichen Aufbau wie in Punkt 5.1 beschrieben durchführen.
    1. Vor jeder Messung in feuchter Umgebung, genießen Sie die Proben mit PBS in einem Vakuumflasche für 5 Minuten, um PBS zu lassen alle Poren füllen. Danach ermöglichen es die Gerüste für 15 min bei 37 ° C in PBS zu bleiben, um die Solltemperatur zu erreichen.
  3. Bestimmung der Grenzflächenhaftfestigkeit (IAS) zwischen den Schichten von TL und TL A B durch eine anwendungsspezifische Grenzflächenfestigkeit Testausrüstung verwendet, die mit einer mechanischen Prüfmaschine nach einem Verfahren in der Literatur beschrieben 32,34.
    1. Befestigen Sie das Gerüst auf der Anlage und sorgen für die korrekte Ausrichtung mit der Wägezelle und Grundplatte der Maschine. Bringen Sie die Gerüst Proben auf Aluminiumtest Stubs durch eine hohe Viskosität Klebstoff und legen Sie sie in das Gerät zum Testen.
    2. Für den nassen Zustand Test, Hydrat die Proben in PBS für 1 Stunde prioder zum Testen. Verwenden einer 1 kN Lastzelle unter einer Zugbelastung bei einer Dehnungsgeschwindigkeit von 1 mm aufgetragen min -1.
      Hinweis: Berücksichtigen Sie, dass der Ausfall entweder bei der Zugfestigkeit von einer der Schichten oder wegen der Ablösung an den Schnittstellen auftreten können. Bewerten Sie die IAS als die maximale Stärke der Spannungs-Dehnungs-Kurve.

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Ergebnisse

Der Einfluss von NaCl Partikelgröße auf der Porenarchitektur der Gerüste wurde qualitativ und quantitativ bewertet , indem die Morphologie der Proben untersucht und die Porengrößenverteilung durch Bildanalyse zu berechnen, jeweils 2a Figur -. F zeigt SEM - Aufnahmen von einschichtigen Gerüste resultierende von Salz-Auslaugung von Materialien mit unterschiedlichen NaCl Partikelgrößen enthält.

M...

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Diskussion

Der erste wichtige Schritt ist die Optimierung der Effizienz Siebung. Die hohe Kontrolle der NaCl-Partikelgröße ist von grundlegender Bedeutung für die Herstellung Gerüst mit gewünschten Porengrößenverteilung. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Vermeidung der Bruch der dünnen PLA Monolayern während der Probenentnahme aus der Form. Die Bildverarbeitungs Analyse möglicherweise nicht repräsentativ für das gesamte Gerät.

Während Zugversuche kann die Probe losreißen von dem Gerät.

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt von INSTM.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Poly(milchsäure)NatureWorksPLA 2002D
Poly(ethylenglykol)Sigma83797-1KG-F
NatriumcloridSigma793566-5KG-D
PhosfatpufferlösungSigmaP5368-10PAK
LabormischerBrabenderPLE 330 - Plasticorder
LaborpresseCarver
RasterelektronenmikroskopiePhenom-worldProX
UniversalprüfmaschineInstron3365 (UK)
BioPuls BathInstron, Norwood
SiebmaschineEndecottsE.V.F.1.
VakuumschrankISCONSV9035
PräzisionswaageSartoriusAX224

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