Lymphozyten sind die Hauptakteure bei adaptiven Immunantworten. Hier stellen wir ein Lymphozytenreinigungsprotokoll vor, um die physiologischen Funktionen der gewünschten Moleküle bei der Lymphozytenaktivierung in vitro und in vivo zu bestimmen. Die beschriebenen experimentellen Verfahren eignen sich zum Vergleich der Funktionsfähigkeit von Kontroll- und genetisch veränderten Lymphozyten.
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Methodenartikel
Isolation und Aktivierung von murinen Lymphozyten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
B- und T-Zellen haben mit ihrem extrem vielfältigen Antigen-Rezeptor-Repertoire die Fähigkeit, spezifische Immunantworten gegen fast jeden eindringenden Krankheitserreger zu starten1,2. Verständlicherweise werden solche komplexen Fähigkeiten von einer großen Anzahl von Molekülen gesteuert, die an verschiedenen zellulären Prozessen beteiligt sind, um eine rechtzeitige und räumlich regulierte Immunantwort zu gewährleisten3. Hier beschreiben wir experimentelle Verfahren, die eine schnelle Isolierung von hochreinen murinen Lymphozyten mittels magnetischer Zellsortiertechnologie ermöglichen. Die resultierenden gereinigten Lymphozyten können dann verschiedenen in vitro oder in vivo funktionellen Assays unterzogen werden, wie z. B. der Bestimmung der Lymphozytensignalkapazität nach Stimulation durch Immunblotting4 und der Untersuchung der proliferativen Fähigkeiten durch3-H-Thymidin-Inkorporation oder Carboxyfluoresceindiacetat-Succinimidylester (CFSE)-Markierung5-7. Neben dem Vergleich der funktionellen Fähigkeiten von Kontroll- und genetisch veränderten Lymphozyten können wir auch die T-Zell-Stimulationskapazität von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) in vivo bestimmen, wie unsere repräsentativen Ergebnisse an transplantierten CFSE-markierten OT-I-T-Zellen zeigen.
Einleitung
Reife Lymphozyten existieren im Allgemeinen im Ruhezustand, wenn bei dem Individuum keine vorbestehende Infektion oder Entzündung vorliegt. Daher ist es wichtig, den naiven Status der Lymphozyten während des Isolierungsprozesses beizubehalten, bevor in vitro oder in vivo funktionelle Assays durchgeführt werden. Der Schlüssel zur Gewährleistung konsistenter und reproduzierbarer Ergebnisse besteht darin, unnötige Manipulationen an den Zellen zu begrenzen.
Bei der magnetischen Zellsortierung werden Antikörper und Mikrokügelchen verwendet, um Zellen zu markieren und so die interessierende Zellpopulation anzureichern. Bei dies....
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Protokoll
Alle Mäuse gezüchtet und unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen und alle Maus-Protokolle werden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Institutional Animal Care und Use Committee geführt gehalten.
1. Herstellung von Puffer und Reagenzien
- Bereiten vollständige Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium (10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, Penicillin (100 IU / ml) / Streptomycin (100 ug / ml), 55 uM 2-Mercaptoethanol ).
- Bereiten Sie 20x Balanced Salt Solution (BSS) Lager 1 und Lager 2, getrennt.
- Bereiten Sie 20x BSS Lager 1 (111 mM Dextrose, 8,8 mM Kaliumphosphat, 26....
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Ergebnisse
Magnetzellreinigung von Lymphozyten erlaubt Benutzern, eine Zielzellpopulation in einer relativ kurzen Zeit zu reinigen. Mit unserem Verarmungs Protokoll konnten wir den Prozentsatz der CD8-T-Zellen (OT-I in Rekombinations-aktivierendes Gen-1 (RAG-1) -defiziente Mäuse) von 72,8% (vor Reinigung) auf 94,2% (nach der Reinigung zu erhöhen; 1A) 4,5. Diese gereinigten Lymphozyten können dann für die nachfolgende funktionelle Assays verwendet werden , um die Lymphozy.......
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Diskussion
In diesem Protokoll zeigen wir ein Verfahren für die Lymphozyten aus lymphoiden Organen zu reinigen. Zellreinigung magnetischen Kügelchen Sortieranlage verwendet, ist eine schnelle und einfache Methode, die lebensfähige, hochgereinigten Zielzellen ergibt.
Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls
Die Lebensfähigkeit der Zellen und Zellausbeute
Die Aufrechterhaltung Lebensfähigkeit von hämatopoetischen.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Die Studie wird durch das Ministerium für Bildung, Singapur (ACRF Tier1-RG40 / 13 und Tier2-MOE2013-T2-2-038) unterstützt. Das Manuskript wurde von Amy Sullivan aus Obrizus Kommunikation bearbeitet.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| RPMI 1640 (ohne L-Glutamin) | Gibco | 31870025 | |
| Fötales Rinderserum | Hitzeinaktiviert | ||
| L-Glutamin | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140114 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Anti-CD43 magnetische Mikrokügelchen | Miltenyi Biotec | 130-049-801 | Gut mischen vor Gebrauch |
| Streptavidin Mikrokügelchen | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | mischen vor Gebrauch |
| Anti-Annexin V Magnetkügelchen | Miltenyi Biotec | 130-090-201 | Vor Gebrauch |
| MACS LD | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| 96-Well-Sterilkulturplatte mit U-Boden | Greiner Bio-one | 650180 | |
| 96-Well-Sterilkulturplatte mit F-Boden | Greiner Bio-one | 655180 | |
| 100 μ m cell Siebnetz | Zur Sterilisation mit UV-Strahlung vor Gebrauch | ||
| 0,2 μ M sterile Einwegfiltereinheiten | Nalgene | 567-0020 | Kann durch jedes sterile Filtergerät |
| ersetzt werden CellTrace Violet | Invitrogen | C34557 | CTV, kurz; Alternative zu CFSE |
| CellTrace Yellow | Invitrogen | C34567 | CTY, kurz; Alternative zu CFSE |
| CellTrace Far Red | Invitrogen | C34564 | CTFR, kurz; Alternative zu CFSE |
| Cell Proliferation Dye eFluor 670 | eBioscience | 65-0840 | CPD670 kurz; Alternative zu CFSE |
| PKH26 | Sigma Aldrich | PKH26GL | PKH26, Alternative zu CFSE |
| strong>Name | Company | <>Katalognummer | Comments |
| Chemicals | |||
| Dextrose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Kaliumphosphat monobasisch | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Natriumphosphat zweibasisch | Sigma Aldrich | S5136 | |
| Phenolrot | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Calciumchlorid-Dihydrat | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Kaliumchlorid | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Natriumchlorid | Merck Millipore | S7653 | Kann aus anderen Quellen verwendet |
| werden Magnesiumchloridhexahydrat | Sigma Aldrich | M2393 | |
| Magnesiumsulfat | Sigma Aldrich | M2643 | |
| Ammoniumchlorid | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Tris-Base | |||
| Dimethylsulfoxid | Sigma Aldbsp; | D8418 | |
| (5-(und 6-)-Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidylester (CFSE) | Molekulare Sonden | C-1157 | Rekonstitution in DMSO |
| Phorbol 12,13-dibutyrat (PBDU, Phorbolester) | Sigma Aldrich | P1269 | |
| A23187 (Calciumionophor) | Sigma Aldrich | C7522 | |
| Name | Company | Katalognummer | Kommentare |
| >Antikörper und rekombinantes Protein | |||
| CD11b Biotin (Klon m1/70) | Biolegend | 101204 | T-Zell-Depletionscocktail |
| CD11c-Biotin (Klon N418) | Biolegend | 117304 | T-Zell-Depletionscocktail |
| Gr-1 Biotin (Klon RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | T-Zell-Depletionscocktail |
| Ter119 Biotin (Klon Ter119) | Biolegend | 116204 | T-Zell-Depletionscocktail |
| TCR-& gamma; Δ Biotin (Klon GL-3) | Biolegend | 118103 | T-Zell-Depletionscocktail |
| CD19 Biotin (Klon 6D5) | Biolegend | 115504 | T-Zell-Depletionscocktail |
| B220 Biotin (Klon RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | T-Zell-Depletionscocktail |
| CD49b Biotin (Klon DX5) | Biolegend | 108904 | T-Zell-Depletionscocktail |
| CD4 Biotin (Klon GK1.5) | Biolegend | 100404 | T-Zell-Depletionscocktail |
| CD8-Biotin (Klon 53-6.7) | Biolegend | 100704 | T-Zell-Depletionscocktail |
| F(ab')2 Anti-Maus-IgM für Ziegen (plattenbeschichtet) | Jackson ImmunoResearch | 115-006-075 | 50 &Mikro; l/Well zum Beschichten (96 Well) |
| Anti-Maus CD40 mAb (plattenbeschichtet) | Pharmingen | 553722 | 50 µ l/Well für die Beschichtung (96 Well) |
| Rekombinant IL-4 | ProSpec | Cyt-282 | |
| LPS aus E. coli Serotyp 055:B5 | Sigma Aldrich | L-4005 | |
| Anti-CD3 (Klonklon OKT3) (plattenbeschichtet) | eBioscience | 16-0037-85 | 50 µ l/Well für die Beschichtung (96 Well) |
| Anti-CD28 (Klonklon 37.51) (plattenbeschichtet) | eBioscience | 16-0281-85 | 50 &Mikro; l/well zum Beschichten (96-well) |
| Rekombinant IL-2 | ProSpec | Cyt-370 | |
| Albumin aus Hühnereiweiß, Ovalbumin | Sigma Aldrich | A7641 |
Referenzen
- Nikolich-Žugich, J., Slifka, M. K., Messaoudi, I. The many important facets of T-cell repertoire diversity. Nat. Rev. Immunol. 4 (2), 123-132 (2004).
- LeBien, T. W., Tedder, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Brownlie, R., Zamoy....
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Nachdrucke und Genehmigungen
