Methodenartikel

Automatische Robotic Dosiertechnik für Oberflächen Ausrichtungs- und Bioprinting von Zellen

DOI:

10.3791/54604

⸱

18. November 2016

 ,  ,  , 
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt eine Bioprinting-Methodik, die ein automatisiertes robotergestütztes Abscheidesystem verwendet, das geätzte topographische Leitfäden mit der präzisen Abscheidung einer Zelle mit Hydrogel-Biotinte verbindet. Die gedruckten Zellen werden direkt auf die geätzten Merkmale aufgebracht und sind in der Lage, diese zu erfassen und sich daran zu orientieren.

Zusammenfassung

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Dieses Manuskript beschreibt die Einführung von Zell Führung Merkmale durch die direkte Lieferung von Zellen auf diese Funktionen in einem Hydrogel bioink unter Verwendung eines automatisierten Roboter-Abgabesystem verfolgt wird. Die besondere bioink ausgewählt wurde, wie es Zellen erlaubt, in Richtung zu sedimentieren und die Merkmale erfassen. Das Abgabesystem bioprints lebenden Zellen in Hydrogel bioinks einen Gegendruck unterstützt Druckkopf verwendet wird. Doch durch den Druckkopf mit einem geschärften Stift oder Skalpell ersetzt wurde, kann das Abgabesystem auch topographische Hinweise durch Anätzen zu erstellen verwendet werden. Der Taststift Bewegung kann in Schritten von 10 & mgr; m in der X, Y und Z-Richtung programmiert werden. Die gemusterte Nuten konnten mesenchymalen Stammzellen zu orientieren, beeinflussen sie eine längliche Morphologie in Ausrichtung mit den Nuten 'Richtung zu übernehmen. Die Strukturierung könnte entworfen werden unter Verwendung von Software zur grafischen Darstellung in geraden Linien, konzentrischen Kreisen und Sinuswellen. In einem nachfolgenden Verfahren, FibroBlasten und mesenchymalen Stammzellen wurden in einer 2% igen Gelatine bioink suspendiert, in einem Gegendruck angetrieben Extrusionsdruckkopf Bioprinting. Die Zellenlager bioink wurde dann gedruckt die gleichen programmierten Koordinaten für das Ätzen verwendet. Die bioprinted Zellen waren in der Lage zu den geätzten Merkmalen zu erfassen und darauf zu reagieren, wie durch ihre gedehnten Orientierung entlang der Richtung der geätzten Rillen gezeigt.

Einleitung

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Die gezielte Strukturierung von Zell Platzierung ermöglicht die Bildung von Kulturen , die 1 in vivo zellulären Organisation zu imitieren. Tatsächlich Erforschung der Interaktionen zwischen mehreren Zelltypen können durch die Organisation ihrer räumlichen Anordnung 2,3- unterstützt. Die meisten Strukturierungssysteme beruhen auf Oberflächenmodifikation Verfahren zur Förderung oder Zelladhäsion mit anschließender passiver Zellaufbringeinrichtung zu verhindern. Bioprinting bietet räumliche und zeitliche Kontrolle über Zellverteilungen 1. Zusätzlich zu diesen Funktionen, Bioprinting wurde zur Erzeugung von geometrisch komplexen Gerüsten 4 als eine technisch einfache, schnelle und kostengünstige Methode beschrieben. Es nutzt Design - Software - Computer und ermöglicht die Einführung von Zellen in dem Herstellungsverfahren 4.

Bioprinting Systeme kategorisiert auf der Grundlage ihrer Arbeitsprinzipien als laserbasierte, Inkjet-basierten oder Extrusionsbasis 4. Extrusion Bioprinting wurde als der vielversprechendste beschrieben , da sie die Herstellung von Konstrukten organisiert klinisch relevanter Größen innerhalb eines realistischen Zeitrahmen 4-6 ermöglicht. Es wird entweder durch mechanische oder Gegendruck unterstützt Extrusion einer Zelle Lager Hydrogel bioink durchgeführt. In dem hier vorgestellten Verfahren wurde Gegendruck eingesetzt. Wie erwähnt, werden die Zellen in einem cytocompatible bioink geliefert. Eine solche bioink sollte die Lieferung von Zellen ohne Erzeugung schädlicher Scherspannung unterstützen, und sein einer ausreichenden Viskosität , die Integrität der gedruckten Bahn zu halten, ohne zu kollabieren oder Spreiz (bezeichnet als "Ausbluten") , 7-10.

Die Wechselwirkung von Zellen mit ihrer Haftfläche ist bekannt, Zellverhalten zu beeinflussen. Die Topographie Oberfläche kann steuern die Zellform, Orientierung 11 und auch den Phänotyp. Insbesondere haben die Herstellung von Nuten und Kanälen gezeigt, zu induziereneine gestreckte, längliche Morphologie auf mehreren Zelltypen. Die Annahme dieser Morphologie wurde mit dem Phänotyp von multi- und pluripotenten Zellen zu beeinflussen gefunden. Wenn zum Beispiel auf Rillen ausgerichtet sind , zeigen mesenchymalen Stammzellen (MSC) den Nachweis der Differenzierung zu Kardiomyozyten 12,13 und glatten Gefäßmuskelzellen übernehmen die Kontraktions Phänotyp über den synthetischen 10,14-17.

Die Zellkanäle oder Nuten ausrichten können über eine Anzahl von Verfahren auf einer Polymeroberfläche erzeugt werden, beispielsweise tiefes reaktives Ionenätzen, Elektronenstrahllithographie, Laserdirektdruck, Femtosekundenlaser, Photolithographie und Trockenätzen im Plasma 18. Diese Ansätze sind oft zeitaufwendig, erfordern eine komplexe Vorrichtung und kann in der Form des Musters erzeugt werden, zu begrenzen. Darüber hinaus synchronisiert sie nicht Musterung mit Bioprinting und nicht für den sofortigen Zellularisierung ermöglichen. Die koordinativ kontrollierte Bewegung eines automatisiertenAbgabesystem kann für die Abscheidung von Lösungen komplexer Muster folgen. Hier zeigen wir, wie die mikroskaligen gesteuerte Bewegung genutzt werden können Kanäle für die Zell Orientierung zu schaffen. Ein geschärfte Stift oder Skalpell wird an den Druckkopf anstelle der Extrusions Spritze befestigt und das Gerät kann dann die Polymeroberfläche unter der Anleitung der Software zur grafischen Darstellung ätzen. Das Verfahren bietet Vielseitigkeit in Musterentwurf und ist anwendbar auf polymere Materialien, die üblicherweise in Bioengineering verwendet, wie Polystyrol, PTFE, und Polycaprolacton. Als weiteren Schritt zum Ätzen können die Zellen auf die zerkratzte Nuten bioprinted direkt. Die Gelatine bioink hier verwendete konnte sowohl die Spur halten und die abgeschiedenen Zellen ermöglichen, die geätzten Strukturen zu erfassen. Mesenchymalen Stammzellen auf die geätzten Nuten bioprinted wurden an ihnen entlang in verschiedene Linien zu verlängern demonstriert.

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Protokoll

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Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines Rückdruck unterstützt Roboter - Dispensorsystem (1A) als Oberflächenätzung (1B) und Extrusionsbasis bioprinter (1C) 10.

1. Änderung eines Polystyrol-Oberfläche

  1. Verwenden Sie 1 mm Polystyrolplatten, da Polystyrol-Gewebekulturplatten neigen dazu, nach oben in der Mitte zu beugen, ruinieren die Höhe Konsistenz beider Ätzen und Drucken.
    Hinweis: Da die Polystyrolplatten nicht für Zelladhäsion modifiziert sind, eine Plasmabehandlung durchgeführt wird.
  2. Sauerstoffplasmabehandlung.
    1. Wählen Sie zunächst einen Druck von 2 bar auf den Regulator des Sauerstoffflasche auf dem Plasma-Maschine angeschlossen. Dann schalten Sie den Plasma-Maschine auf und geben Sie die folgenden Bedingungen in das Bedienfeld der Maschine: 150 W, 30 SSCM Sauerstoff, 10 min (für Strom, Gasströmung und Zeit beziehungsweise).
    2. Legen Sie das Polystyrol substrate in die Plasmakammer, die Tür verschließen und den Startknopf auf dem Bedienfeld drücken. Einweichen des Sauerstoffplasma behandelt Polystyrolsubstrat in fötalem Rinderserum und inkubieren bei 37 ° C für 2 h vor dreimal 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen (PBS).

2. Programmierung Print Patterns

  1. Verwenden Sie das Programm zunächst Etch die Oberfläche mit einem Stylus oder Skalpell.
    1. Wenn Sie einen Stift verwenden, legen Sie einen Durchmesser von 1,5 mm Textil-Nadel (von innen mit großer Sorgfalt) in die Düse einer Abgabespritze (entweder 5 oder 10 ml), bis er eingeklemmt und gesichert wird. Bei Verwendung eines Skalpells, wählen Sie eine Runde behandelt Skalpell so dass er in den Klemmmechanismus des Druckarmes befestigt werden kann.
      HINWEIS: Der Stift gekrümmte Muster besser als die Skalpellklinge ätzt.
    2. Wenn zuerst eine bioprinted Anordnung zu schaffen versucht, skizzieren das gewünschte Muster auf Millimeterpapier mit nummerierten Achsen der XY-Koordinaten zu erzeugen. Dann input die Koordinaten des geätzten / bioprinted Muster in das Tabellenkalkulationsprogramm (Abbildung 2).
      HINWEIS: Die "gewünschte Muster" kann in vielen verschiedenen Formen sein, wie beispielsweise linear, S-förmig oder kreisförmig. Die Wahl hängt von dem experimentellen Modell erforderlich ist, wie beispielsweise parallele lineare Linien für die Differenzierung von MSCs zu Cardiomyozyten wie hier demonstriert. Die Streudiagramm-Funktion ermöglicht die Visualisierung der vorgeschlagenen Handlung Muster.
    3. Öffnen Sie die Druck / Ausgabe-Software. Wählen Sie "Programm> Programm hinzufügen", gefolgt von "Bearbeiten> Punkt hinzufügen", um das Programm einzurichten. Exportieren Sie die x- und y-Koordinatenwerte aus der Tabelle in den erhaltenen Druck / Spende Software die Verwendung von "Copy and Paste" Funktion.
    4. Kalibrieren Sie die "z" Höhe des Roboters vor jedem Lauf, um den Stift / print Düse auf die Oberfläche zu platzieren.
      1. In der Druck- / Spende Software, wählen Sie die "Robot" Option, klicken Sie auf "Ändern Mode &# 34; und aktivieren Sie die "Lernmodus" -Option. Einmal ausgewählt, ermöglicht die Software die Funktion "Tippen" des Roboters.
      2. Joggen, initialisieren zuerst den Roboter in seine Standardposition, indem Sie die folgenden Befehle in der Menüleiste ausgewählt wird; "Robot> Meca initialisieren", und wählen Sie "Robot> Jog". Eingabe der numerischen Werte (in mm) in den "X und Y Slots" erforderlich, um den Stift genau auf den Ursprung des Musters zu platzieren.
      3. Als nächstes Eingang in der "Z-Slot" ein Zahlenwert (in mm) mit der Oberfläche mit dem Stift oder Druckdüse in Kontakt zu bringen, aber nicht biegen oder die Oberfläche einrücken. Dieser Punkt wird als "Z" Startwert bezeichnet.
        HINWEIS: Die Tiefe jeder Rille kann leicht die Z-Höhe des Systems unter Verwendung variiert werden. Nuten 40, 80 und 170 & mgr; m gezeigt , in die Oberfläche von 1 mm dicke Polystyrolplatten (4 und Tabelle 1) zu schneiden.
    5. Wählen Sie die prucken Anweisung für jede der Koordinatenpunkte, das heißt "Start of Line Dispense" den ersten Punkt und Druck Einleitung zu definieren "Linie , die" die Zwischenpunkte zu bestimmen und "End of Line Dispense" an den Roboter zu signalisieren , das zu beenden Druckauflage.
    6. Kommunizieren Sie das Programm an den Roboter durch die Folgebefehle in der oberen Menüleiste auswählen: "Robot> Senden C & T Data".
    7. Starten Sie die Radierung / Druckauflage durch den Roboter in die Betriebsart "Run" zu ändern. Tun Sie dies, indem Sie "Robot> Ändern Modus> Run-Modus" in der oberen Menüleiste.
    8. Starten Sie den Druckvorgang mit der grünen "Start-Taste" auf dem Roboter Spender Konsole drücken.

3. Herstellung und Druck von zellhaltigen Gelatine Bioink

  1. Löse 2% Gelatine in Minimum Essential Medium Alpha Medium (& agr; MEM) (mit 10% FBS ergänzt und 2% Antibiotikum / antimycotic) bei 60 ° C für 2 Stunden die bioink Lösungen herzustellen.
  2. Vorkultur der Red Fluorescent Protein exprimieren mesenchymalen Stammzellen (RFP-MSCs) bis 70% Konfluenz in 10 cm Gewebekulturschalen mit & agr; MEM / 10% FBS. Lösen der anhaftenden Zellen in Suspension durch Entfernen des Mediums und Beschichtung mit 1x Trypsin-EDTA-Lösung für 5 min bei 37 ° C.
  3. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 1000 × g für 5 min und entfernen Sie den Überstand. Zellpellet in 0,5 ml 1x PBS und die Zelldichte zählen eine Zählkammer.
  4. Nachdem man die bioink auf Raumtemperatur abkühlen, sanft in einem ausreichenden Volumen , um die Aussetzung der RFP-MSCs in den bioink mischen , um eine Endkonzentration von 5 x 10 6 Zellen ml -1 zu erreichen.
  5. Gießen Sie die Zelle Lager bioink in eine Druckspritze mit der Düse verschlossen. Kühlen Sie das geladene Spritze auf 4 ° C, um eine druckbare Viskosität zu erreichen.
  6. Legen Sie die geladene Spritze auf dem automatisiertenRoboter-Abgabesystem und befestigen Sie die Luftdruckleitungen. Entfernen Sie die Spritze Luer Dichtung und befestigen Sie die Druckdüsen.
  7. Auspressen cellularized bioinks in dünne Linien unter Verwendung von 0,05 MPa Rückdruck, bei 5 mm / sec Schreibgeschwindigkeit von 10 ml Spritze über eine 27 G-Nadel / Düse (konisch über zylindrische empfohlen) auf eine Polystyrolfolienoberfläche nach dem vorprogrammierten Ablagerung Muster in Schritt 2.1 beschrieben, um die cellularized bioink auf die vorgeätzten Rillen zu platzieren.
  8. Nach 1 Stunde Inkubation bei Raumtemperatur, mit 10 ml Wachstumsmedium (mit 10% FBS ergänzt und Antibiotika) und Inkubieren der Zellen für 24 h (die Zellen zu erlauben, auf die geätzten Merkmale zu erfassen und reagieren) vor der Anzeige unter Verwendung eines invertierten Fluoreszenzmikroskop bei 10-facher Vergrößerung.

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Ergebnisse

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Die repräsentativen Ergebnisse zeigen , dass der Gegendruck unterstützt Roboterabgabesystem kann sowohl Oberfläche als Extrusionsbasis bioprinter verwendet werden Ätzen für die Durchführung und bioink Druck (Abbildung 1 A). Es kann für die Erzeugung von geätzten Rillen in Polymeroberflächen verwendet werden, und anschließend zu den Merkmalen (1 B und C) eine Zelle Lager bioink direkt zu drucken.

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Diskussion

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Der entscheidende Schritt dieses Verfahrens ist die tatsächliche Bioprinting Lieferung der Stammzellen, da der Prozess zu den Merkmalen Zellsedimentation erlauben müssen, drucken, ohne bioink Verbreitung / Blutungen, liefern Zellen, ohne den Tod Schubspannung Zelle und nicht die Differenzierung gegenüber unerwünschten Linie auslösen.

Wenn die erwartete Zellenausrichtung ausbleibt, dann sollte die bioink Viskosität für ihre Eignung für den Druck beurteilt werden. Es ist wichtig, dass die bioi...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

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Die hier vorgestellte Arbeit wird unterstützt von der Singapore National Research Foundation im Rahmen des CREATE-Programms (NRF-Technion): Die Regenerative Medicine Initiative in Cardiac Restoration Therapy Research Program und durch die Public Sector Funding (PSF) 2012 des Science and Engineering Research Council (SERC) unter der Agency for Science, Technology and Research (A*STAR).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ausrüstung
Roboter-DosiersystemJanome2300N
PlasmagerätFemto ScienceCovance
USB-Mikroskop
Optisches MikroskopOlympusIX71
Name UnternehmenKatalognummerKommentare
Software
SpreadsheetExcelExcel
Drucken KoordinatensoftwareJanomeJR C-Points
Imaging SoftwareNational Institutes of Health (NIH)ImageJ
Name<>UnternehmenKatalognummer<strong>Kommentare<
strong>Ausrüstung
Stylus (Klinge)OLFAAK-5
5 ml DruckspritzeSan-ei TechSH10LL-B
30 G DrucknadelSan-ei TechSH30-0.25-B
1 mm PolystyrolplattenVor Ort
Fötales RinderserumInvitrogen 10270-098
Phosphatgepufferte KochsalzlösungInvitrogen
Gelatine aus Schweinehaut, Gelstärke 300, Typ ASigma Aldrich9000-70-8
α MEMInvitrogen41061-029
Antibiotc AntimykotikumSigma AldrichA5955-100ML
Mesenchymale Stammzellen mit rotem fluoreszierendem Protein (RFP-MSCs)Cyagen Biosciences IncorporationRASMX-01201
gekauft

Referenzen

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