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Methodenartikel

Empirische, metagenomischen und Computertechniken beleuchten die Mechanismen, durch welche Fungizide Kompromiss Bienengesundheit

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DOI:

10.3791/54631

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9. Oktober 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Vegetable Crop Research Unit, USDA-ARS, 2Department of Entomology, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Horticulture, University of Wisconsin-Madison, 4Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agricolas y Pecuarias, 5Department of Bacteriology, University of Wisconsin-Madison, 6Laboratory of Genetics, Genome Center of Wisconsin, 7DOE Great Lakes Bioenergy Research Center, Wisconsin Energy Institute, 8J.F. Crow Institute for the Study of Evolution, University of Wisconsin-Madison

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Mikrobielle Konsortien innerhalb von Bumble Bee Hives bereichern und Pollen für Bienenlarven bewahren. Sequenzierung der nächsten Generation, zusammen mit Labor und Feld-basierte Experimente mit beschreibt diesem Manuskript Protokolle verwendet, um die Hypothese zu testen, dass Fungizid Rückstände der Pollen Mikrobiom und Kolonie Demographie, letztlich zu Kolonie verändern Verlust.

Zusammenfassung

Züchter verwenden oft Fungizid Sprays während der Blüte Pflanzen gegen Krankheit, schützen die Bienen Fungizid Rückstände anführt. Obwohl als "Biene-Safe", gibt es Anzeichen dafür, dass Fungizid Rückstände Pollen Biene Rückgänge (für Honig und Bumble Bee Arten) zugeordnet sind. Während die Mechanismen relativ unbekannt bleiben, haben Forscher spekulierten, daß Biene-Mikrobe Symbiosen beteiligt sind. Mikroorganismen spielen eine entscheidende Rolle bei der Erhaltung und/oder Verarbeitung von Pollen, die als Nahrung für die Larven Bienen dient. Durch die Veränderung der mikrobiellen Gemeinschaft, ist es wahrscheinlich, dass Fungizide diese Mikrobe-vermittelten Leistungen stören und damit Gesundheit der Bienen gefährden. Dieses Manuskript beschreibt die Protokolle verwendet, um die indirekte Mechanismen zu untersuchen, durch die Fungizide Kolonie Rückgang verursachen können. Käfig Experimenten auszusetzen Bienen, Blumen Fungizid behandelt haben bereits die ersten belegt, dass Fungizide Tiefe Völkerverluste in eine native Hummel (Bombus Impatiens) verursachen. Mit Feld-relevanten Dosen von Fungiziden, eine Reihe von Experimenten wurden entwickelt, um eine feinere Beschreibung der mikrobiellen Gemeinschaft Dynamik der Fungizid-exponierten Pollen zu bieten. Verschiebungen in der strukturellen Zusammensetzung der Pilz- und bakterielle Assemblagen innerhalb der Pollen Microbiome sind von Next Generation Sequencing und metagenomischen Analyse untersucht. Experimente, die hierin entwickelt wurden so bieten ein mechanistisches Verständnis wie Fungizide Microbiome Pollen-Bestimmungen auswirken. Letztendlich sollten diese Erkenntnisse auf dem indirekten Weg Licht durch die Fungizide Kolonie Rückgänge verursachen können.

Einleitung

Verwaltet und Wildbienenarten sind weit verbreitete Rückgänge, mit großen Auswirkungen auf die beiden natürlichen und landwirtschaftlichen Systemen1erleben. Trotz konzertierte Anstrengungen, die Ursachen des Problems zu verstehen sind die Faktoren, die Honig Biene Rückgänge noch nicht gut verstanden,2,3,4. Für bestimmte Arten von wild, native Bienen ist die Situation dringend5,6geworden. Wenn Bienenvölker nicht aufrechterhalten werden können, wenn sie mit der industriellen Landwirtschaft schneiden, ihre Bevölkerungen werden weiter sinken und die Pflanzen erfordert Bestäuber (35 % der Weltproduktion7) ertragen werden verringert ernten.

Während viele mögliche Faktoren wie Schädlingsbekämpfungsmittelbelichtung Krankheit und Lebensraum Verlust1,4,8,9,10 in Honig Biene Rückgang verwickelt, über die interaktive Wirkung von diesen Stressoren auf heimischen Bienen Gesundheit, innerhalb oder in der Nähe von landwirtschaftlichen Systemen ist relativ wenig bekannt. Viele aktuelle Forschungsbemühungen weiterhin Insektizide (z.B., Neonicotinoide11,12), obwohl die letzten Forschung zeigt, dass Fungizide auch ein Rückgang der Biene Rolle können durch Beeinträchtigung der Gedächtnisbildung konzentrieren, olfaktorische Rezeption13, Nest Anerkennung14, Enzymaktivität und Stoffwechselfunktionen15,16,17. Fungizide weiterhin weltweit, während der Blüte zu blühenden Pflanzen angewendet werden. Neuere Studien belegen, dass Bienen bringen häufig Fungizid Rückstände zurück in den Bienenstock18, in der Tat, einen Großteil der getesteten Nesselsucht enthaltenen Fungizid Rückstände19,20Studien. Weiterarbeit hat ergeben, dass Fungizid Rückstände ist verbunden mit hohen Honig Biene Larven Mortalität21,22,23 und das Vorhandensein von "begraben Pollen" innerhalb der Kolonien, die zwar ungiftig, ist frei von mikrobielle Aktivität und ernährungsphysiologisch kompromittierten24. Trotz der Tatsache, dass Fungizide lange "Biene-Safe" gegolten haben, gibt es jetzt beweisen, dass die Exposition zu Fungizid allein in einer nativen Bumble Bee Spezies, Bombus Impatiens25schwere Kolonie Verluste verursachen kann.

Um Kausalität zwischen Fungizid-Exposition und Kolonie zu etablieren Sterblichkeit, die Arbeitsweise dieser Chemikalien müssen bestimmt werden. Wie in den Böden26, Sedimente27und aquatischen Umwelt28, belegt durch die Ausrichtung auf Pilze, Fungizide am ehesten verändern Pilz Fülle und Vielfalt im Rahmen der Pollen-Vorgaben damit Aufrufen einer großen Gemeinschaft zu verlagern, die Bakterien können stark begünstigen. Ohne Pilz Konkurrenten oder Antagonisten können bestimmte pathogenen Bakterien relativ ungeprüft, erleichtern das Verderben von Pollen-Bestimmungen vermehren. Frühere Forschung hat gezeigt, dass Mikroorganismen, insbesondere Hefen und filamentöse Pilze dienen als Nahrungsergänzung Symbionten für Bienen29,30,31, Schutz gegen Parasiten und Krankheitserreger32 ,33, und Langzeitarchivierung von Pollen Läden bieten. Fungizide, können deshalb, unreife Bienen indirekt Schaden, durch Unterbrechung der mikrobiellen Gemeinschaft, die benötigt wird, um diese Leistungen zu erbringen und/oder durch eine Erhöhung der Anfälligkeit für opportunistische Krankheitserreger und Parasiten12. Mit zunehmender Anforderungen an die Herstellung von Lebensmitteln, sind Kulturen weltweit jedes Jahr mit Fungiziden während der Blüte, unterstreicht die Notwendigkeit zu verstehen, das Ausmaß der Fungizid-induzierte Effekte besprüht.

Bis dato, die primäre Wissenslücken in Bezug auf einheimische Biene mikrobielle Ökologie kann durch die folgenden Fragen dargestellt werden: , inwieweit ändert Fungizid die mikrobielle Gemeinschaft im Rahmen der Biene Blütenstaub-Vorgaben? Was sind die nachgelagerten Auswirkungen des Verzehrs von Pollen mit einer grundlegend veränderten mikrobiellen Gemeinschaft? Im Einklang mit dieser ökologisch germane Fragen, wurden Experimente mit den primären Zielen der Enthüllung 1 entwickelt), Fungizid Rückstände allein kann schwere Kolonie Rückgang verursachen, in einem heimischen Bienenarten; (2) der Grad, mikrobielle Gemeinschaften in Pollen-Bestimmungen sind durch Fungizide und 3 verändert) wie Bienengesundheit von einer stark veränderten mikrobiellen Gemeinschaft betroffen ist. Die experimentelle Ziele wurden definiert, um die oben genannten Fragen mit einer Kombination aus Labor und Feld-basierten Experimente. Mit State-of-the-Art metagenomische und Molekulare Techniken neben traditionellen Methoden der Bereich Beobachtung, diese Forschung zielt darauf ab, die möglichen Auswirkungen von Fungiziden auf die Bienengesundheit zusammenzusetzen.

Das erste Ziel der vorliegenden Studie soll zeigen, dass Fungizid Exposition allein dazu führen, erhebliche Völkerverluste unter einheimischen Bienenarten dass kann. Eine Studie mit Grossfeld Käfige wurde verwendet, um die Auswirkungen einer Fungizid auf das Koloniewachstum von Bombus Impatiens, eine allgegenwärtige, reichlich einheimische Biene in den USA (Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3) untersuchen. Es wurde vermutet, dass Fungizid behandelt Nesselsucht geringer Fitness und atypische Demografie im Vergleich zu nicht-exponierten Nesselsucht präsentieren würde. Dieses Experiment gewonnene Daten unterstützt diese Hypothese, zeigen, dass Fungizid Rückstände im Pollen die alleinige Ursache für tiefe Völkerverluste in einer nativen Bumble Bee Arten25sein können. Das zweite Ziel dieser Studie ist, die Reaktion der Pollen Microbiome Fungizid Exposition zu untersuchen. Es wird vermutet, dass die Gemeinschaft Zusammensetzung der Mikroben im Rahmen der Pollen-Vorgaben ausgesetzt, Fungizide anders als die der unbehandelten Pollen werden. Während Pilz Fülle und Vielfalt deutlich zurückgehen voraussichtlich werden, werden Bakterien und/oder einer einzigen dominanten Pilzarten wahrscheinlich unkontrolliert in der Abwesenheit von anderen konkurrierenden Pilze wachsen. Durch eine Reihe von in-Vivo -Studien werden diese Verschiebungen in der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft mit Metagenomik analysiert werden.

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Protokoll

1. untersuchen die Wirkung von Fungizid Belichtung auf Bumble Bee Colony Erfolg mittels Cage Feldexperimente

  1. Satz bis zehn Gitter Käfige in einem Feld mit Hafer gepflanzt. Graben Sie einen Graben um jeden Käfig und graben Sie alle vier Kanten des Käfigs Netz in den Boden um sicherzustellen, dass die Bienen nicht entziehen können. Lager der Käfige, blühende Topfpflanzen, die bekannt sind für Bienen (z.B. Buchweizen, Borretsch, Alyssum, Kosmos und Sonnenblumen) attraktiv sein ( Abbildung 2).
  2. Ergänzen die Käfige mit einem einzigen Tablett (36 x 42 cm)-Blüte Klee. Cluster-florale Ressourcen innerhalb einer Ecke des Käfigs, besetzen einen Raum ca. 2,5 m x 1 m vegetieren die Restfläche Käfig durch die Hafer.
  3. Nach dem Zufallsprinzip die Hummel zuzuweisen, Kolonien, jedes mit Arbeiter und eine einzelne Dame, eine Behandlung (Fungizid Gegenwart/abwesend, N = 5 Kolonien pro Behandlung, insgesamt 10 Kolonien), dann legen Sie sie in einem Feld Käfig (N = 1/Käfig) für 29 Tage (23. Juni -21 Juli 2014).
  4. Orientieren die Kolonie Felder so, dass die Kolonie ' s Öffnungen zeigen nach Süden, die Bienen Navigations optimale Bedingungen bieten. Subventionieren die Kolonien mit Zucker Wasser Blase, platziert in den Bienenstock Boxen Ergänzung Nektarverfügbarkeit.
  5. Anwenden Chlorothalonil basierende Fungizid auf Feld-relevanten Ebene (20 g/L), blühende Pflanzen in den fünf Fungizid-Behandlung-Käfigen, statt mit einem Hand-Pestizid-Sprüher, zweimal während des Studiums (Tag 0 und 13). Die Blumen gleichmäßig zu beschichten, so dass keine weitere Flüssigkeit hält sich an floralen Oberflächen ( Abbildung 3).
  6. Zum Abschluss der Käfig Feldstudie B. Impatiens Kolonien aus den Käfigen von hand zu entfernen, die Bienenstöcke durch die Platzierung im Gefrierschrank-20 ° C für 20 min. abkühlen
  7. Bienen mit steriler Pinzette entfernen und notieren Sie die Anzahl der Larven, Puppen, adulte Weibchen (Ich. e. Sammlerinnen), und Männchen. Das trocken-Gewicht der Mutter Königin, Larven, Puppen, adulte Weibchen (d.h. Sammlerinnen) und Erwachsenen Männern aufnehmen mit einer Analysenwaage.

2. Untersuchen Sie die Auswirkungen von Fungizid Belichtung auf mikrobieller Gemeinschaften in den Pollen-Bestimmungen von Bumble Bee Nester mit Labor-basierte In Vivo Studien

  1. pulverisieren kommerziell erworben Pollen zu einem feinen Pulver mit einem Standard- Labor-Kugelmühle. Sterilisieren Sie pulverisierte Pollen durch Einweichen in 70 % igem Ethanol, ermöglicht es, über Nacht unter UV-Licht zu verdampfen. Sterilität der Pollen durch Ausplattieren ~0.5 mg auf Allzweck Agar Medien überprüfen.
    1. Sterilisiert Pollen, mit sterilisierten Pipetten, Hinzufügen der trockenen Bereich relevanten Dosierung von Fungizid: propiconazolhaltige bei 14,3 %; Azoxystrobin bei 22,9 % für Behandlungen (0,74 µL und 0,65 µL bzw. / Tag / hive). Mischen Sie nun mit sterilisierten Holzstäbchen.
  2. Platz 6 experimentelle Nesselsucht (n = 3 Stück für die Kontrolle und Behandlung) in eine saubere, hygienische Labor Benchtop auf Raumtemperatur gehalten. Jeden Tag wiegen 4,27 g Pollen 34 , 35 gemischt mit Fungiziden (für Behandlungen) oder sterilem Wasser (zur Kontrolle) in eine Kapuze mit standard aseptische Technik.
    1. Die Falltüren zur Verfügung gestellt von der Seite des Kartons umschließt die Nesselsucht, führen die Pollen in die Bienenstöcke. Ergänzung der Bienenstöcke mit sterilisierten Zuckerlösung pro Woche. Futterregime für vier Wochen weiter.
  3. Zum Abschluss der Labor-basierte Studie, kühlen die Bienenstöcke indem man in Gefrierschrank-20 ° C für 20 min. kratzen die Pollen-Bestimmungen enthaltenen Brut Kammern mit sterilisierten Pinzette und Spachteln und in sterile Lagerung Rohre statt. Shop bei-80 ° C. Graf und Datensatz das Gewicht der Arbeitnehmer und der Königin-Mutter am Anfang und Ende des Experiments (Schritt 1.7).
  4. Isolieren DNA von Pollen-Bestimmung Probe mit im Handel erhältlichen DNA-Isolierung-kits (siehe Materialtabelle für Details).
    1. Fügen Sie 0,25 g Pollen-Bestimmung zur Extraktion Rohre kurz Vortex mischen.
    2. Machen eine 200 mg/mL Lysozym Lösung in entionisiertem destilliertem Wasser, genug für 50 µL/Probe. Kräftig schütteln, um völlig Formularlösung.
    3. Die Extraktion Rohre mit Probe in es 50 µL der Lysozym-Lösung hinzu und mischen Sie gut durch invertieren mehrmals. Inkubieren Sie das Rohr für 10 min bei 37 ° C im Wasserbad. Wenn Niederschlag gebildet hat, Wärme Lösung auf 60 ° C bis vor Gebrauch aufgelöst.
    4. Hinzufügen 70 µL wässrigen Lyse Lösung zur Extraktion Rohre, horizontal auf einem Flachbett-Wirbel-Pad mit Klebeband sichern und Wirbel für 10 min. Zentrifuge Rohre bei 10.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur.
    5. Übertragen den Überstand auf eine saubere 2 mL Sammelröhrchen. Fügen Sie 250 µL Niederschlag Proteinlösung und Vortex für 5 S. Inkubation bei 4 ° C für 5 min in ein Eisbad.
      Hinweis: Erwarten Sie zwischen 400 µL, 500 µL überstand. Überstand kann noch einige Partikel enthalten.
    6. Die Rohre bei Raumtemperatur für 1 min bei 10.000 x g Zentrifugieren und bis zu 600 µL Überstand auf eine saubere 2 mL Sammelrohr übertragen. Fügen Sie 200 µL der wässrigen Inhibitor Haarentfernung Lösung, kurz, Wirbel und inkubieren Sie bei 4 ° C für 5 min. Zentrifuge die Rohre bei Raumtemperatur für 1 min bei 10.000 x g. bis zu 750 µL Überstand in ein sauberes 2 mL Sammelröhrchen übertragen.
    7. Fügen Sie 1200 µL wässrigen Bind Lösung des Überstandes und Wirbel für 5 s. Laden ca. 675 µL des Überstands auf ein Spin Filter und Zentrifuge bei 10.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur. Verwerfen die Durchströmung.
    8. Wiederholen 2.4.7. zweimal.
      Hinweis: Insgesamt drei Lasten für jede Probe verarbeitet sind erforderlich.
    9. Hinzufügen 500 µL Ethanol und Zentrifuge bei Raumtemperatur für 30 s bei 10.000 x g. die Durchströmung zu verwerfen und erneut Zentrifugieren, bei Raumtemperatur für 1 min bei 10.000 x g. Ort Spin Filter in einer sauberen 2 mL Sammelröhrchen.
    10. Elution hinzufügen 100 µL Puffer in die Mitte der Filtermembran. Zentrifuge bei Raumtemperatur für 30 s bei 10.000 x g. verwerfen den Spin-Filter. Store gesammelten DNA-20 ° C bis-80 ° C
  5. Verwendung isolierte DNA Sequenzierung.
    1. Quantify, und isolierte DNA auf 2 ng/µL fluorometrisch Analyse zu normalisieren.
      1. Prepare Reaktionen in dreifacher Ausfertigung für jede extrahierte Probe, die relativen Mengen der 28 s zu vergleichen (Pflanze), seine (Pilze), zu analysieren und 16 s (bakterielle) Komponenten der einzelnen Pollen-Bestimmung Probe 36. Stellen Sie sicher, dass jede Reaktion 10 enthält ng der Gesamt-DNA, 2 X asymmetrische Cyanin-Farbstoff basierend-master-Mix und 2,5 µL von forward und reverse Primer Paare 28KJ/28 b 37 für Anlage und ITS1/ITS5.8R für Pilz DNA 38 .
    2. Verstärken DNA mit den folgenden Parametern: 2 min vor Denaturierung bei 50 ° C, 2 min erste Denaturierung bei 95 ° C, 40 Zyklen (15 s bei 98 ° C, 15 s 58 ° c, 60 s bei 72 ° C), gefolgt von einer Schmelze Kurve.
    3. Bereiten Sie eine 2-stufige, verschachtelten PCR-Protokoll Next Generation Sequencing-Bibliotheken für die 16 s rRNA V3/V4 Variable Region und ITS / 5.8s rRNA Abstandhalter Region.
      1. Hinzufügen 12,5 µL DNA bis 5 Pmol jedes Grundierung und 2 x master-Mix. Stellen Sie separate Reaktionen für jede Region (16 s oder ITS; siehe Tabelle 1). Region spezifische Primer zu ändern, wie zuvor beschrieben 39 , 40 gen-spezifische Sequenzen Sequenzer-spezifische Adapter Überhang Nukleotidsequenzen hinzu.
      2. Erste Verstärkung mit den folgenden Parametern ausführen: 3 min erste Denaturierung bei 95 ° C, 25 Zyklen (30 s bei 95 ° C, 30 s bei 55 ° C, 30 s bei 72 ° C), letzte Verlängerung 5 min bei 72 ° c
      3. Folgende erste Verstärkung, Bibliotheksgröße und Menge durch elektrophoretische Mobilität überprüfen und reinigen Sie mit einer 1 x Volume Festphase reversible ImmObilization Perlen, passives Grundierungen und Reaktion Reagenzien zu entfernen. Pool-16 s und seine Amplifikate quantitativ erstelle ich einen einzigen Amplikons Pool für jede Probe.
      4. Sequenzer bestimmte Adapter hinzufügen und probieren Sie spezifische doppelte Indizes verwenden die folgenden Primer (siehe Tabelle 1). 2.5 µL der amplifizierten DNA zu 5 Pmol jedes Grundierung und 2 x master-Mix hinzufügen. Bibliothek Verstärkung mit den folgenden Parametern ausführen: 3 min erste Denaturierung bei 95 ° C, 8 Zyklen (30 s bei 95 ° C, 30 s bei 55 ° C, 30 s bei 72 ° C), letzte Erweiterung 5 min bei 72 ° c
    4. Folgende PCR, sauber fertige Bibliotheken mit einem 1 X Volume der Festphase reversible Immobilisierung Perlen. Bewerten Sie Qualität und Quantität der fertige Bibliotheken mit elektrophoretische Mobilität und Fluorometry, bzw.. Bibliotheken, 2 µM und Pool vor der Sequenzierung zu standardisieren.
    5. Next Generation Sequencing durchführen, auf einer Plattform, die analog zu den Adaptern in der sekundären PCR mit einer entsprechenden Länge zur Deckung der gesamten Amplikons 41 hinzugefügt.
  6. Sequenz, Annotation und Analyse der mikrobiellen Zusammensetzung.
    1. Kombinieren paar-End Sequenzierungsdaten (R1 und R2) in einzelne Contigs für alle sequenzierten Bibliotheken. Nach dem Zusammenführen von R1 und R2 Dateien, wird eine einzelne Fasta-Datei für jeden der Bibliotheken produziert.
      Hinweis: Dieser Schritt und die Prozesse beschrieben (sofern nicht anders angegeben) erfolgt in Mothur Version 1.38.0 38.
    2. Bildschirm jede Fasta-Datei entfernen Sie mehrdeutige Basen, unerwartet lange Sequenzen und lange Homopolymere.
      Hinweis: Die Parameter für das Screening und Sequenz Entfernung sind Maxambig = 0, Maxlength = 600 und Maxhomop = 8 für beide Gene. Entfernen Sie identische Sequenzen, aber halten Sie eine Kontingenz Tabelle separat für alle Bibliotheken (aka Zahlentabelle in Mothur).
    3. Richten Sie einzigartige Sequenzen der 16 s gen Bibliothek gegen SILVA Datenbankversion 123 und gen ITS Bibliothek gegen den vereinen ihre Datenbank 42.
      Hinweis: Sequenzen müssen von der Königreich-Ebene auf die Ebene der Gattung annotiert werden.
      1. Anschließend Cluster ausgerichtet Sequenzen mit der Funktion pre.cluster mit Diff = 5, und entfernen Sie Chimären.
    4. Klassifizieren Sequenzen mit der Methode Wang 43 anhand der SILVA (für 16 s-gen) und vereinen ITS (für gen ITS) Taxonomie Dateien (cutoff-Wert von 80 %).
    5. In R 44 laden die Kontingenz Tabellen (eine pro gen) während der Klassifizierungsprozess in Mothur erzeugt. Auf jeder taxonomischen Ebene, relative Häufigkeit pro Bibliothek zur weiteren Analyse der mikrobiellen Gemeinschaft Änderungen zu erhalten.
      Hinweis: Auf jeder taxonomischen Ebene zusammenführen taxonomische Gruppen als relative Häufigkeit weniger als 2 % für die experimentelle Wiederholungen ist.

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Ergebnisse

Feldstudie Käfig:

Den Käfig Experimenten gewonnene Daten zeigte, dass die Hummeln Bienenvölker eine deutliche Reaktion auf Fungizid Exposition. Das Fungizid behandelt Nesselsucht produziert deutlich weniger Arbeiter (12,2 ± 3,8, Mittelwert ± SE) als Kontrolle Nesselsucht (43,2 ± 11,2, F1,9= 6,8, p = 0,03) (Abbildung 4). Darüber hinaus war die Biene Biomasse der Fun...

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Diskussion

Untersuchungen über die Auswirkungen der Fungizide auf die Bienengesundheit blieben ein erforschten Aspekt des Schädlings-Management-Strategien. Unsere Studie zielt darauf ab, diese Wissenslücke zu überbrücken, mithilfe einer Reihe von ergänzenden Techniken, die explizit die potenziellen Faktoren Biene Rückgänge zu isolieren. Planung, Begründung und Darstellung dieser Experimente sind nachfolgend aufgeführt.

Es ist darauf zu achten, dass keine Bienen erlaubt sind, um das Netz der Käfig Experim...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren danken der University of Wisconsin Biotechnologie Center DNA Sequenzierung Anlage für Bereitstellung Amplifikation und Sequenzierung Einrichtungen und Dienstleistungen, Caitlin Carlson, Jennifer Knack, Jake Otto und Max Haase für die Bereitstellung technischen Hilfe molekulare Analyse. Diese Arbeit wurde von USDA-Agricultural Research Service angeeignet Mittel (aktuelle Research Information System #3655-21220-001) unterstützt. Weiterer Unterstützung wurde von der National Science Foundation (unter Grant Nr. bereitgestellt. Deb-1442148), DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE Office of Science BER DE-FC02-07ER64494), und der USDA National Institute of Food und Landwirtschaft (Luke Projekt 1003258). C.T.H. ist ein Pew Gelehrter in den biomedizinischen Wissenschaften und ein Alfred Toepfer Faculty Fellow, bzw. von der Pew Charitable Trusts und der Alexander von Humboldt-Stiftung unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Natupol BienenstockKoppertUSRESM116 Bienenstöcke
Propiconazol 14,3Quali-Ppro60207-90-1Propiconazol 14,3%
Abound Syngenta4033540Azoxystrobin 22,9%
ChlorothalonilSyngenta3452Fungizid für Versuche
verwendet PollengranulatBiene gerettetB004D5650C3X 16oz Flaschen, Pollen für Versuche
Bakterienstämme für die InokulationCurrie Lab
Hefestämme für die InokulationHittinger Lab
Primer PaareUW Biotech Center
DNA Isolation KitMo Bio12830-50Commercial DNA Isolation Kit
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo FisherQ32851DNA Quantifizierungstool
Select Master Mix für CFXThermo Fisher4472952Wird zur Durchführung von Echtzeit-PCR mit SYBR GreenER-Farbstoff verwendet.
Real-Time PCR Detection SystemBio Rad1855196Instrument für die PCR-Amplifikation
PCR Clean-Up Kit,Axygen10159-696Wird für die effiziente Entfernung von nicht eingebauten dNTPs, Salzen und Enzymen
verwendet DNA 1000 Kit Agilent5067-1504Wird für die Größenbestimmung und Analyse von DNA-Fragmenten
verwendet MiSeq SequencerIlluminaWird für die nächste Generation verwendet Sequenzierung
Verschiedene Glaswaren (Becher, Kolben, Pipetten, Reagenzgläser, Repietten)VWR

Referenzen

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