Wir schlagen ein Protokoll zur Reprogrammierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) in induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) vor. Durch das Plattieren der transduzierten Blutzellen auf matrixbeschichtete Platten mit Zentrifugation werden iPS-Zellen erfolgreich aus schwimmenden Zellen induziert. Diese Technik schlägt ein einfaches und effektives Reprogrammierungsprotokoll für Zellen wie PBMCs und CBMCs vor.
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Methodenartikel
Induzierte pluripotente Stammzellen Erzeugung von Blutzellen mit Sendai-Virus und Zentrifugation
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die jüngste Entwicklung der menschlichen induzierten erwies sich pluripotente Stammzellen (hiPSCs), dass reife somatische Zellen zu einem undifferenzierten, pluripotenten Zustand zurückkehren kann. Nun Umprogrammierung ist mit verschiedenen Arten von adulten somatischen Zellen durchgeführt: Keratinozyten, Urin - Zellen, Fibroblasten usw. Frühe Experimente wurden in der Regel mit dermalen Fibroblasten durchgeführt. Jedoch benötigt dies eine invasive chirurgische Verfahren Fibroblasten von Patienten zu erhalten. Daher Suspensionszellen, wie Blut und Urin-Zellen wurden für eine Neuprogrammierung ideal angesehen wegen der Bequemlichkeit die primären Zellen zu erhalten. Hier berichten wir ein effizientes Protokoll zur iPSC Erzeugung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs). Durch Plattieren der transduzierten PBMCs seriell zu einer neuen, matrix-beschichtete Platte unter Verwendung von Zentrifugation kann dieses Protokoll leicht iPSC Kolonien bereitzustellen. Dieses Verfahren ist auch anwendbar auf Nabelschnurblut mononukleäre Zellen (CBMC). Diese Studie stellt eine einfache und effiziente ProtOcol für die Reprogrammierung von PBMCs und CBMC.
Einleitung
Stammzellen haben in den letzten Jahrzehnten ein in der klinischen Therapie einer der attraktivsten Materialien gewesen. Die attraktiven Eigenschaften von Stammzellen sind pluripotent und die Fähigkeit zur Selbsterneuerung. 1981 wurden die ersten embryonalen Stammzellen ( ES- Zellen) von der Maus - Embryo isoliert 2. Wenn jedoch die Technik, um menschliche Embryonen angewendet wurde, stand es mehreren ethische Fragen.
Im Jahr 2006, als Dr. Yamanaka und sein Team die erste pluripotenten Zelle aus der Maus somatischen Zellen umprogrammiert, wieder die Stammzellfeld seine Möglichkeit und Interesse wurde 3 neu....
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Protokoll
Ethik-Erklärung: Diese Studienprotokoll vom Institutional Review Board der Katholischen Universität von Korea (KC12TISI0861) genehmigt wurde.
1. Isolierung von monozytären Zellen aus Blut
- Isolierung von Monozyten (Tag -5)
- Erhalten Sie mindestens 10 ml frisches Blut aus einer Blutabnahme in einer Zellpräparation Röhre (CPT).
- Übertragen, um das Blut zu einem neuen 50-ml konischen Röhrchen und verdünnte es mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei einem 1: 4-Verhältnis.
HINWEIS: Ein höheres Verhältnis von Verdünnungs für höhere Reinheit verwendet werden. - 10 ml Dichtegradientenmedien auf eine neue 50-....
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Ergebnisse
Dieses Protokoll stellt eine einfache Methode PBMCs aus dem Blut isoliert neu zu programmieren. Mit der Kombination von seriellen Plattierung und Zentrifugation wurden iPSCs erfolgreich generiert. Mit dieser Methode konnte iPSCs mit einer geringen Menge an Vollblutzellen erzeugt werden ohne Isolierung oder einen bestimmten Zelltyp zu erweitern. Wir erzielten erfolgreich iPSCs von nur 1x10 4 Zellen in einer kleinen Zellkulturplatte.
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Diskussion
Da embryonale Stammzellen (ES-Zellen) mehrere Mängel zeigte, wurde die Notwendigkeit eines alternativen Werkzeug erforderlich. Daher kam die Entwicklung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) von Yamanaka im Rahmen des internationalen Rampenlicht. Es ist schon seit fast einem Jahrzehnt Yamanaka entdeckt, dass Pluripotenz, indem nur vier Gene in adulten somatischen Zellen induziert werden kann. Da iPSCs "induziert" von reifen somatischen Zellen sind, können sie ethische Fragen ausweichen, die ei.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des Basic Science Research Program durch die National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, finanziert vom Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunftsplanung (2013R1A1A1076125).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
PBMC Isolation Materials
td colspan="4"> zum Ablösen von Kolonien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Plasticware | |||
| >100 mm Schüssel | TPP | 93100 | |
| 6-Well-Platte | TPP | 92006 | |
| 50 ml Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 ml Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 ml Einwegpipette | Falcon | 7551 | |
| 5 ml Einwegpipette | Falcon | 7543 | |
| 12-Well-Platte | TPP | 92012 | |
| 24-Well-Platte | TPP | 92024< | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| StemSpan | STEMCELL Technologies | 9805 | Blutzellmedien |
| CC110 | STEMCELL Technologies | 8697 | Blut Zellmedienergänzung (100x) |
| iPSC Generations- und Kulturmaterialien | |||
| CytoTune-iPSC Sendai Reprogrammierungskit | Life Technologies | A16518 | |
| TeSR-E8 Medien | STEMCELL Technologies | 5940 | iPSC Medien |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TrypLE express (TrypLE) | Life Technologies | 12604-039 | |
| ReleSR | STEMCELL Technologies | 12604-039 | Lösung |
| Quality Control Materials | |||
| 18 mm Deckglas | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Rinderserumalbumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antikörper | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antikörper | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antikörper | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-SOX2 Antikörper | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antikörper | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antikörper | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 Anti-Maus Anti-Maus IgG (H+L) Antikörper | Molekulare Sonde | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 Kaninchen Anti-Kaninchen IgG (H+L) Antikörper | Molekulare Sonde | A11037 | |
| DAPI | Molekulare Sonde | D1306 | |
| Prolong Gold Antifade Reagenz | Invitrogen | P36934 | |
| Objektträgerglas, beschichtet | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalkohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid Erststrang-cDNA-Synthesekit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA-Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Puffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| Ladestern | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA-Leitermarker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkalische Phosphatase | Millipore | SCR004 | |
| Tris-Base | Fisher Scientific | BP152-1 | Spülpuffer |
| Natriumchlorid | Duchefa Biochemie | S0520.1000 | Spülpuffer |
| Tween-20 | BIOSESANG | T1027 | Spülpuffer |
| Salzsäure | Duksan | 1129 | Spülpuffer |
Referenzen
- Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).
- Martin, G. R. Isolation of a plur....
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Nachdrucke und Genehmigungen
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