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Sustained Verabreichung von β-Zellen-Mitogene zu Intact Maus Inselchen

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DOI:

10.3791/54664

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5. November 2016

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 2School of Engineering, Vanderbilt University, 3Department of Veterans Affairs, Tennessee Valley Health Authority

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine Methodik zur Erzeugung und Verabreichung von Verbindungen aus zinsgeladenen Poly(milchsäure-co-glykolsäure) (PLGA)-Mikrosphären an intakte Mausinseln in Kultur mit anschließender Immunfluoreszenzanalyse der β-Zellproliferation vor. Diese Methode eignet sich zur Bestimmung der Wirksamkeit von Kandidaten-β-Zell-Mitogenen.

Zusammenfassung

Die Entwicklung von Biomaterialien erhöht signifikant das Potential für eine gezielte Arzneimittelabgabe an eine Vielzahl von Zell- und Gewebetypen, einschließlich den pankreatischen β-Zellen. Darüber hinaus Biomaterial Partikel, Hydrogele und Gerüste bieten auch eine einzigartige Gelegenheit, steuerbaren Medikamentenabgabe aufrechterhalten, zu verabreichen zu ß-Zellen in Kultur und transplantierte Gewebe-Modelle. Diese Technologien ermöglichen die Untersuchung der Kandidaten β-Zell-Proliferation Faktoren intakte Inseln und translational relevanten System. Außerdem β-Zell - Proliferation in einem Kultursystem die Wirksamkeit und Durchführbarkeit der Kandidatenbestimmungsfaktoren für die Stimulierung ist von entscheidender Bedeutung vor uns auf in - vivo - Modellen zu bewegen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Zusammenarbeit Kultur intakte Maus Inselchen mit biologisch abbaubaren Verbindung von Interesse (COI) beladene Poly (Milch-co-Glykolsäure) (PLGA) Mikrokugeln für die Zwecke der die Auswirkungen der anhaltenden Bewertung der in - situ - Freisetzung of mitogenen Faktoren auf β-Zellproliferation. Diese Technik beschreibt im Detail, wie PLGA-Mikrokügelchen zu erzeugen, um eine gewünschte Ladung unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reagenzien enthält. Während die beschriebene Technik rekombinantes menschliches Bindegewebe-Wachstumsfaktor (rhCTGF) als Beispiel verwendet wird, könnte eine Vielzahl von COI ohne weiteres verwendet werden. Zusätzlich verwendet dieses Verfahren 96-Well-Platten, die Menge der Reagenzien zu minimieren, notwendig, β-Zellproliferation zu beurteilen. Dieses Protokoll kann ohne weiteres auf die Verwendung des alternativen Biomaterialien und anderen endokrinen Zelleigenschaften angepasst werden, wie das Überleben von Zellen und Differenzierungsstatus.

Einleitung

Pancreatic β-Zellen sind die einzigen Insulin-produzierenden Zellen im Körper und sind kritisch Blutzucker Homöostase aufrechtzuerhalten. Während gesunde Individuen ausreichend β-Zellmasse aufweisen und Funktion richtig Blutzucker, Personen mit Diabetes durch unzureichende β-Zellmasse charakterisiert und / oder Funktions 1,2 regulieren. Es ist vorgeschlagen worden , dass β-Zell - Proliferation induzierende letztlich β-Zellmasse erhöhen und Glukose - Homöostase bei Patienten mit Diabetes 3 wieder herzustellen. Allerdings Evaluierung und Validierung von potentiellen β-Zell-proliferative Verbindungen in intakten Inseln ist notwendig, bevor wirksame Therapien entwickelt werden können. Die Transplantation von menschlichen Kadaver Inseln in Personen mit Diabetes stellt Blutzucker-Homöostase für einige Zeit, aber die Verfügbarkeit und den Erfolg dieses experimentellen Verfahrens wird durch einen Mangel an menschlichen Inselchen für Transplantation und von ß-Zelltod in den kleinen Inseln achtern behinderter Transplantation 4. Selbst mit der Entdeckung von Faktoren , die die Vermehrung von Insulin-produzierenden Zellen zu induzieren, eine große Herausforderung noch existiert , diese Faktoren zu den relevanten Stellen in vivo zu liefern. Eine Strategie für eine nachhaltige lokale Auslieferung von β-Zellen-proliferative Verbindungen ist Poly (Milch-co-Glykolsäure) (PLGA). PLGA hat eine Geschichte der Verwendung in FDA Drug - Delivery - Produkte zugelassen seiner hohen Sicherheit durch, die biologische Abbaubarkeit und erweiterte Freisetzungskinetik 5. Insbesondere ist PLGA ein Copolymer aus Lactid und Glycolid , das mit Wasser durch Hydrolyse abgebaut wird entweder in vivo oder in Kultur zu Milchsäure und Glykolsäure, die natürlich Metaboliten im Körper auftreten. Die verkapselte Wirkstoff-Verbindung kann sowohl durch Diffusion und / oder Abbau gesteuerte Freisetzungsmechanismen in die Umgebung freigesetzt werden. Verkapselung von COI bietet Schutz vor enzymatischem Abbau, die Verbesserung der Bioverfügbarkeit des Reagens gegenüber unencapsulated COI 5. Wir schlagen vor , dass PLGA - Mikrokügelchen verwendet werden können Kandidatenverbindungen auf intakte Inseln in Kultur zu verabreichen, und letztlich in vivo. Testen der Wirksamkeit von PLGA β-Zell - Mitogene zu verabreichen vivo zu Inselchen ex ist kritisch , vor der Transplantation Protokolle untersucht werden.

Derzeit gibt es keine Technik, β-Zellproliferation in lebenden Tieren zu messen. Experimente Wirksamkeit potenzieller proliferative Verbindungen in vivo zu beurteilen , daher Verabreichung dieser Verbindungen erfordern Tiere zu leben, mit anschließender Trennung und Verarbeitung von Bauchspeicheldrüsen für Immunmarkierung. Solche Protokolle sind teuer und mühsam, und erfordern die Verbindung systemisch verabreicht werden, ohne Garantie, dass sie die Inseln zu erreichen. Umgekehrt sind einige immortalisierte β-Zelllinien für die Untersuchung von Insulin-produzierenden Zellen in Kultur zur Verfügung, aber diese Zellinien fehlt das islet Architektur und environment gefunden in lebenden Organismen 6. Immortalisierte β-Zelllinien sind auch als mit einem viel höheren Grad an Replikations als endogene β-Zellen in vivo charakterisiert, wodurch Analyse von Verbindungen komplizieren die Proliferation induzieren. In dieser Studie beschreiben wir ein Protokoll, das intakte Inseln, isoliert aus erwachsenen Mäusen verwendet. Im Gegensatz zu β-Zelllinien behalten intakte Inseln normale Inselarchitektur. Ebenso reduziert im Gegensatz zu Experimenten in vivo durchgeführt, Verabreichen proliferative Verbindungen direkt mit kultivierten intakte Inseln signifikant die Menge an Reagenzien , die genau erforderlich ist , um β-Zell - Proliferation zu messen.

Die vorliegende Studie verwendet PLGA ein COI, in diesem Beispiel rekombinantes menschliches Bindegewebe-Wachstumsfaktor (rhCTGF) zu verabreichen. Das hier beschriebene Verfahren verleiht einen signifikanten Vorteil gegenüber der Verabreichung von rohen Verbindung zu kultivierten Inseln, wie es für eine kontinuierliche Freisetzung der Verbindung in th erlaubte Medien. Bemerkenswert ist, kann dieser Assay eine Vielzahl von Proteinen und Antikörpern von Interesse intakte Inseln zu verabreichen, werden modifiziert. Auswirkungen auf andere endokrine Zelltypen, einschließlich α-Zellen, ebenfalls analysiert werden.

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Protokoll

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Vanderbilt Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt und durchgeführt.

1. Labeling COI mit Fluorophore (Optional)

  1. Wähle einen fluoreszierenden Farbstoff, der mit einer freien primären Amin (beispielsweise auf einem Protein), wie beispielsweise Succinimidylester oder Fluorescein - Derivate reagieren, Mikrokügelchen Ladung zu visualisieren. Auflösen 8x molarer Überschuß (bezogen auf Mol COI) von Fluorophor in 200 ul Dimethylsulfoxid (DMSO).
  2. Resuspendieren von 50 mg COI bis zu einem Endvolumen von 800 ul in einem Fahrzeug-Lösung (Endkonzentration von 62,5 ng / ul). Die Trägerlösung wird in Abhängigkeit von der Quelle des COI variieren.
    HINWEIS: Typische Fahrzeuglösungen umfassen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder DMSO.
  3. Fügen Sie alle Fluorophor / DMSO-Lösung aus Schritt 1.1 und resuspendieren COI. Vortex über Nacht bei 4 ° C. Alternativ vortexen der Reaktionsmischung bei Raumtemperatur(RT) für 4 Stunden.
  4. Im Anschluss an die Markierungsreaktion überschüssiges Fluorophor eine Entsalzungs Spalte.
    1. Drain-Speicherpuffer von Entsalzungssäule und spüle mit 16 ml deionisiertem Wasser hergestellt. Entsorgen Sie durch alle fließen.
    2. Fügen Sie die fluoreszenzmarkierten COI an die Entsalzungssäule. Eluieren mit 1,2 ml VE-Wasser und sammeln durch den Fluss.
    3. Wiederholen Sie Elutionsschritt zusätzlich viermal, das Hinzufügen jedes Mal 1,2 ml VE-Wasser und die Strömung durch als getrennte Probe zu sammeln.
    4. Gefriert alle gesammelten Strömung durch Proben bei -80 ° C lyophilisieren und gemäß den Anweisungen des Herstellers für 24 Std.

2. COI belasteten Microsphere Herstellung über die Wasser-in-Öl-in-Wasser - Emulsion Solvent Evaporation Method

  1. 1 mg des fluoreszenzmarkierten COI zu 100 ul entionisiertem Wasser die erste Wasserphase (W1) zu bilden.
  2. Man löst 65 mg Poly (milch-co-glykol acid) (50:50 Lactid: Glycolid, Molekulargewicht 54.000 - 69.000) in 750 & mgr; l Dichlormethan in einem Reaktionsgefäß. Ultrasonicate für 10 bis 30 s (bei 160 W), um vollständig den PLGA aufzulösen. Dies bildet die Ölphase (O).
  3. In allen der W1-Phase erzeugt in Schritt 2.1 auf die O-Phase in einer tropfenweise Art und Weise. Verwendung eines handgehaltenen Homogenisator bei 20.000 rpm für 30 sec Emulgieren der W1 / O-Phase zu bilden.
  4. Fügen alle der W1 / O-Phase in eine tropfenweise Art und Weise zu 15 ml einer 1% (Gewicht / Volumen) wässrigen Poly (vinylalkohol) (PVA) -Lösung und Emulgieren für 30 sec unter Verwendung eines handgehaltenen Homogenisator bei 20.000 rpm .
  5. Übertragen die Emulsion erzeugt in Schritt 2.4 in einen 200-ml-Rundkolben und unterliegen einer 635 mm Hg Vakuum am Rotationsverdampfer für 1 Stunde unter Verwendung des Lösungsmittels und erzeugen die wässrige Phase zu entfernen.
  6. Aliquot 1 ml der wässrigen Phase erzeugt, in Schritt 2,5 bis vierzehn Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren der wässrigen Lösung in die Mikrozentrifugenröhrchen bei 7.500xg für 8 min.
    HINWEIS: Bei diesem Schritt werden die Mikrokügelchen in der verbleibenden wäßrigen Lösung und sind mit dem Boden des Mikrozentrifugenröhrchens eingeengt.
  7. Vorsichtig 900 ul der wässrigen Lösung aus den mit einer Mikropipette Mikrozentrifugenröhrchen zu entfernen, Pipettieren, um nicht die Mikrokugeln am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu stören.
    1. Waschen Sie die Mikrokügelchen von überschüssigem PVA durch Zugabe von 1 ml Wasser in jedes Mikrozentrifugenröhrchen entionisiert. Zentrifuge bei 7.500 × g für 8 min und wieder vorsichtig 900 ul einer wässrigen Lösung von den Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Mikropipette, Pipettieren zu entfernen, um nicht die Mikrokugeln am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu stören.
      ANMERKUNG: Die restlichen 100 & mgr; l wässrige Lösung enthält, die erzeugten Mikrokugeln.
  8. Fixieren Sie die wässrigen Mikrokügelchen Lösung erzeugt in Schritt 2.7 bei -80 ° C.
  9. Lyophilisieren Mikrokugeln mit einem Lyophilisator Verwendung nach HerstellerAnweisungen und bei -20 ° C.
    HINWEIS: Messen Beladungseffizienz des COI durch vollständiges Auflösen von PLGA - Mikrokügelchen und die Proteinkonzentration relativ zu einer Standardkurve des freien Proteins 7 zu bestimmen.
  10. Als negative Kontrolle, eine Charge von "leeren" Mikrokugeln erzeugen (im Folgenden als Steuermikrokugeln bezeichnet).
    HINWEIS: Die Erzeugung von Steuermikrokugeln ist identisch zu der Erzeugung von hydrophilen COI-beladenen Mikrosphären, ohne COI zusätzlich zu 800 ul der Trägerlösung in Schritt 1.2. Spiel Steuer Partikel in Massenkonzentration von PLGA in Bezug auf COI belasteten PLGA-Mikrokügelchen für β-Zellen-Mitogen-Assay.

3. Herstellung von Islet Kultur, Medien und Pre-Test Medien

  1. Bereiten 200 ml Medium für die Kultur von intakten Maus Inselchen: RPMI 1640 Medium mit 11 mM Glukose supplementiert, 10% Pferdeserum, 100 U / ml Penicillin G und 100 ug / ml Streptomycin (nachstehend als istlassen Kulturmedien).
    Anmerkung 1: Im Gegensatz zu fötalem Rinderserum (FBS), Pferdeserum fehlt Plazentalaktogen, ein Induktor von β-Zellproliferation, die Analyse in dem Proliferationsassay confounds.
    ANMERKUNG 2: Wenn die PLGA-Mikrokugeln nicht sterilisiert werden vor der Verwendung, die Zugabe von Antibiotika zu den Kulturmedien von entscheidender Bedeutung mikrobiologische Verunreinigungen zu vermeiden.
  2. Entfernen 25 ml islet Kulturmedien mit einer elektronischen Pipettiervorrichtung und in einem 50 ml konischen Röhrchen. Ergänzen die 25 ml islet Kulturmedien in der 50 ml konischen Röhrchen mit einer Endkonzentration von 0,2 mM EGTA die Vorassay-Medien zu erzeugen.
    HINWEIS: Die Zugabe von EGTA leicht lockert Zell-Zell-Kontakte in den kleinen Inseln ohne Inselarchitektur zu verändern. Dies hilft, die COI sicherstellen können, die inneren Zellen der Insel zu erreichen und hilft Nekrose der zentralen Insel zu verhindern.

4. Die Anzucht von Intact Maus Inselchen

  1. Isolieren intakter Inseln aus einem vorher ausgewählten Stamm, Geschlecht, age und Genotyp der Mäuse nach einer Routine Kollagenaseverdau des Pankreas 8,9. Pool zusammen Inseln aus wie Proben.
  2. Aliquot 40 Inselchen in eine Vertiefung einer 96-Well-Gewebekulturplatte in 200 ul islet Kulturmedien. Optisch Größe-Spiel Inseln pro Vertiefung (eine genaue Beurteilung der Insel equivalency (IEQ) zwischen den Proben ist nicht erforderlich). Füllen Sie leere Brunnen unmittelbar neben Brunnen mit kleinen Inseln mit 200 & mgr; l sterilem Wasser eine Verdampfungspuffer zur Verfügung zu stellen. Kultur Inselchen in Medien über Nacht bei 37 ° C unter einer Atmosphäre von 95% Luft und 5% CO 2.

5. Wieder Suspension von COI-geladen und die Kontrolle von PLGA Microspheres

  1. Nachdem über Nacht islet Erholung resuspendieren Mikrokügelchen durch Zugabe Vorassay-Medien zu einem Aliquot von lyophilisiertem COI belasteten PLGA-Mikrokügelchen, so dass die Endkonzentration von COI in dem Reaktionsgefäß beträgt 10 ng / & mgr; l (die Menge des COI in einer gegebenen Menge an die erzeugten microssphäre wurde in Schritt 2.9) bestimmt. Beschallen die resuspendierten COI-beladenen Mikrokügelchen in einem Eiswasserbad für 10 min bei 160 W mit 10 sec langen Pulsen bei 4 ° C.
  2. Resuspendieren Steuer PLGA-Mikrokugeln durch Zugabe des gleichen Volumens Vorassay-Medien zu einer gleichen Masse von lyophilisierten Kontroll PLGA-Mikrokügelchen. Beschallen die resuspendierten Steuer PLGA-Mikrokügelchen in einem Eiswasserbad für 10 min bei 160 W mit 10 sec langen Pulsen bei 4 ° C.
  3. Optisch bestätigen Mikrokugeln durch Pipettieren von 2 ul resuspendiert Mikrokugeln zwischen zwei Glasplättchen verteilt sind. Visualisieren Mikrokugeln mit einem 40X-Objektiv auf einem Epifluoreszenz oder Hellfeldmikroskop verwendet wird.
  4. Wenn eine nennenswerte Aggregation von Mikrosphären ist noch sichtbar, beschallen in einem Eiswasserbad für weitere 10 min bei 160 W mit 10 sec langen Pulsen bei 4 ° C und repeat Visualisierung resuspendiertes Mikrokugeln.

6. Behandlung von Inselchen mit COI-geladen oder Steuer PLGA Microspheres

  1. Für jede Vertiefung mit COI-beladenen Mikrosphären behandelt werden, Assaymedium herzustellen, indem man die 10 ng / & mgr; l der resuspendierten COI-Mikrokügelchen mit bereits Testmedium auf ein Endvolumen von 100 & mgr; l und einer vorbestimmten Endkonzentration verdünnt wird.
    HINWEIS: Die optimale Endkonzentration des Proteins wird für jeden COI für diesen Assay verwendet, variieren. Idealerweise werden eine Reihe von Endkonzentrationen getestet.
  2. Für jede Vertiefung als Kontrolle verwendet werden, Steuerassaymedium herzustellen, indem die resuspendierten Steuer PLGA-Mikrokügelchen Verdünnung in Schritt 5.2 mit dem gleichen Verdünnungsvolumen erzeugten verwendet 6.1 Die COI-beladenen Mikrosphären in Schritt zu verdünnen.
    HINWEIS: Islets behandelt mit Kontrollassaymedium wird als negative Kontrolle dienen Erfassung irgendeiner Wirkung zu ermöglichen, die leere Mikrokugeln auf die experimentellen Ergebnisse haben können.
  3. Entfernen Sie vorsichtig 100 ul der Inselkulturmedien aus jeder Vertiefung mit einer Mikropipette, so dass keine kleinen Inseln aus den Vertiefungen verdrängt werden. fügen Sie vorsichtig 100 μl Assaymedium oder 100 & mgr; l Kontrollassaymedium zu jeder Vertiefung.
  4. Inkubieren Inselchen bei 37 ° C unter einer Atmosphäre von 95% Luft und 5% CO 2 für drei Tage.

7. Dispergierwerkzeuge Intact Inselchen auf Objektträger

  1. Nach drei Tagen mit einer Mikro verwenden, um sorgfältig Testmedien aus allen Vertiefungen entfernen und zu entsorgen, um nicht-Inseln zu entfernen. fügen Sie vorsichtig 200 ul PBS zu Inselchen sie der Testmedien zu waschen. Entfernen Sie vorsichtig und PBS mit einer Mikropipette zu verwerfen und sanft Inseln wieder mit einem zusätzlichen 200 & mgr; l PBS waschen.
  2. Entfernen und entsorgen PBS mit einer Mikropipette und fügen 100 ul 0,025% Trypsin, 2 mM EDTA-Lösung. 3 min bei RT inkubieren. Pipettieren Inselchen in der Trypsin-EDTA-Lösung nach oben und unten je 2 min bis Inseln werden visuell in einzelne Zellen dispergiert und bestätigt werden (beachten Sie, dass einige kleine Klumpen von Zellen noch vorhanden sein können) mit einem Lichtmikroskop. Übertragen Sie das gesamte Volumen jeder Vertiefung einzelnerly in labeled- Mikrozentrifugenröhrchen.
  3. In 400 ul der Inselkulturmedien zu jedem Mikrozentrifugenröhrchen, die Trypsin-vermittelte Zell-Dissoziation zu stoppen.
  4. Zentrifuge Proben für 5 min bei 100 × g bei 4 ° C Inselzellen auf den Boden des Mikrozentrifugenröhrchen zu pelletieren.
  5. Entfernen Sie vorsichtig Überstand einer Mikropipette und Pellet in 200 ul frische Inselkultur-Medien.
  6. Unter Verwendung eines Zyto-Zentrifuge, distanzierte Zentrifuge Inseln bei 140 × g für 3 min auf geladene Objektträger.
  7. Luft trocknen Dias bei RT für 10 min, ziehen dann einen Rahmen um die dissoziierte Inselchen mit einem hydrophoben Markierungsstift.
  8. Fix-Zellen mit 75 & mgr; l 4% Paraformaldehyd (PFA) bei RT für 10 min. Entfernen Sie die 4% PFA und vorsichtig waschen Zellen in 75 & mgr; l PBS zweimal. Nach dem Waschen permeabilisieren Zellen mit 75 & mgr; l 0,2% Triton X-100 in PBS für 10 min. Dann waschen Sie die Zellen mit 75 & mgr; l PBS.
    Achtung: PFA ist bekannt, allergen, krebserregend und giftig.

8. Immunofluoreszenz Kennzeichnung von Dissociated Inselchen für Insulin und die Zellproliferation Marker, Ki67

  1. Bereiten Sie eine feuchte Kammer durch zwei nasse Handtücher in den Boden einer 100 Dia Kapazität Objektträger Box platzieren.
  2. Die Objektträger flach nach unten (Zellen nach oben) in der feuchten Kammer. Vorbereiten Proben für die Markierung durch die PBS aus dem vorhergehenden Waschschritt Aspirieren einer Mikropipette und Zugabe von 75 & mgr; l Blockierlösung (5% normalem Eselserum (NDS) in PBS) zu jeder Folie zu blockieren unspezifische Bindung von Antikörpern an den Proben. Inkubiere Objektträger in Lösung für 1 Stunde bei RT blockiert.
  3. enthält Meerschweinchen-anti-Insulin und Kaninchen-Anti-Ki67-Antikörpern, verdünnt auf 1 & mgr; g / ml in 5% NDS in PBS vorsichtig absaugen Lösung unter Verwendung einer Mikropipette blockieren und 75 & mgr; l primärer Antikörper-Lösung hinzu. für 1 h bei RT inkubiert.
    HINWEIS: Alternative Marker der Zellproliferation umfassen wuchernden cell nuclear antigen (PCNA) und Phosphohistone H3 (PH 3),
  4. vorsichtig absaugen primären Antikörper-Lösung mit einer Mikropipette und spülen Sie die Zellen mit 75 & mgr; l PBS. Absaugen PBS mit einer Mikropipette und spülen Zellen zwei Mal mit je 75 & mgr; l PBS. Inkubieren jede Probe mit 75 & mgr; l anti-Meerschweinchen-Cy5 sekundären Antikörper und Anti-Kaninchen sekundären Antikörpers Cy3 bis 2 & mgr; g / ml verdünnte Lösung für 1 h bei RT in blockieren.
    HINWEIS: Verwenden Sie mit dem gleichen oder spektral überlappende Fluorophore markierte Antikörper verwenden, die bereits verwendet wurde, um die Mikrokugeln beschriften nicht zweitrangig.
  5. Absaugen sekundären Antikörper-Lösung mit einer Mikropipette und Inkubation in 75 & mgr; l von 300 nM DAPI in PBS für 3 min bei RT mit. Absaugen DAPI mit einer Mikropipette und spülen Sie in VE-Wasser für 5 min.
  6. Vorsichtig absaugen Wasser aus Proben mit einer Mikropipette. Spot eine Tropfen (etwa 100 ul) von schnelltrocknend Befestigungslösung verblassungshemmenden Reagenz auf einem Deckglas enthält. Kehren Sie die Mikroskop-Objektträger Probenseite nach unten, onde Montagelösung. Drücken Sie vorsichtig das Deckglas gegen den Schieber eine Pipettenspitze mit Blasen zu entfernen und überschüssige Flüssigkeit mit einem weichen Reinigungstuch abwischen. Erlauben Deck über Nacht bei RT trocknen.

9. Bildaufnahme und Analyse

  1. Verwenden Sie ein Epifluoreszenz-Mikroskop mit einer angeschlossenen Kamera zur Bildaufnahme. Für jeden Fluorophor, bestimmen die optimale Belichtungszeit (in der Regel 20 msec für DAPI, 40-80 msec für Insulin und 250 msec für Ki67). Sicherzustellen Bildaufnahmeparameter für alle Proben gleich sind.
  2. Für jede Probe zählen manuell 3000 Insulin-positiven Zellen und derer zählen, wie viele sind auch Ki67-positiv. Nur zählen Insulin-positive Zellen, die eine gut definierte und deutlich sichtbaren Kern haben. Der prozentuale Anteil proliferierender β-Zellen für jede Probe durch die Anzahl der Ki67-positiv / Insulin-positive Zellen durch die Gesamtzahl von Insulin-positiven Zellen Dividieren und Multiplizieren mit 100.
  3. Nach determining den Prozentsatz für jede Probe β-Zellen von proliferierenden, festzustellen, wenn ein statistisch signifikanter Unterschied in Proliferations β-Zellen zwischen Kontroll- und experimentellen Proben vorhanden ist, indem Ergebnisse mit einer Einweg-ANOVA unter Verwendung kommerziell erhältlicher Software statistischen Analyse.

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Ergebnisse

Figur 1 ist eine visuelle Darstellung der Mikrokugeln unter Verwendung des obigen Protokolls erzeugt. Das hier beschriebene Protokoll ergibt rhCTGF beladenen Mikrokügelchen in verschiedenen Größen. Der größte Teil der Mikrokügelchen zwischen 1 und 10 & mgr; m im Durchmesser sein, obwohl einige Mikrokugeln kann größer (Abbildung 2). Falls gewünscht, können Mikrokügelchen eine Größe basierend auf Herstellungsparameter abgestimmt und op...

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Diskussion

Die Studie der β-Zellproliferation in Kultur wird typischerweise durch mehrere Schwierigkeiten behindert. Zunächst verewigt β-Zelllinien werden durch höhere Grad der Proliferation gekennzeichnet als das, was in endogenen β-Zellen in lebenden Inseln zu finden ist. Außerdem fehlt diesen immortalisierten Zelllinien die normale Architektur kritisch für die normale β-Zellfunktion. Diese beiden Tatsachen machen es schwierig , zu bestimmen , ob die Resultate mit dem verewigte β-Zelllinien erhalten wird wahr halten , wenn sie <...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken Bethany Carboneau (Vanderbilt University) für die kritische Lektüre dieses Manuskripts. Wir danken auch Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) für die Isolierung von Inselzellen und Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) und Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) für die Nutzung ihrer Zentrifugen- und Gewebekulturanlage. Diese Forschung umfasste die Nutzung des Islet Procurement and Analysis Core des Vanderbilt Diabetes Research and Training Center, das durch NIH-Zuschüsse DK20593 unterstützt wurde. Diese Arbeit wurde durch ein Postdoctoral Fellowship der American Heart Association (14POST20380262) an R.C.P. und Zuschüsse der Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592) und des Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) an M.A.G. unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Oregon Green 488 Carbonsäure, Succinimidylester, 6-IsomerThermoFisher ScientificO6149Zur Markierung von COI mit Fluorophor
DMSO DimethylsulfoxidFisher BioReagentsBP231-1Zum Auflösen von Fluorophor in Schritt 1
Einweg-PD-10-EntsalzungssäulenGE Healthcare17-0851-01Entsalzungssäule in Schritt 1
Resomer RG 505, Poly(D,L-Lactid-co-glycolid), esterterminiert, Molekulargewicht 54.000 - 69.000Sigma-Aldrich739960Wird zur Erzeugung von Mikrosphären in Stufe 2 verwendet
(vinylalkohol) Molekulargewicht 89.000 - 98.000Sigma-Aldrich341584Wird zur Erzeugung von Mikrosphären in Stufe 2
verwendet RPMI 1640Thermo Scientific11879-020Zur Kultivierung von Inselzellen
Dextrose wasserfreiFisher BioReagents200-075-1Ergänzung für Inselmedien
Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichP4333Antibiotika für Inselmedien
Normales PferdeserumJackson ImmunoResearch008-000-121Ergänzung für Inselmedien
96-Well-GewebekulturplatteCorning3603Für die Kultivierung von Inselzellen
Ethylenglyko-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäureSigma-AldrichE4378Supplement für Pre-Assay-Inselmedien
Cytospin 4 CytocentrifugeThermo ScientificA78300003Zum Spinnen von Zellen auf Objektträger
EZ Single CytofunnelThermo ScientificA78710020Zum Spinnen von Zellen auf Objektträger
EthylendiamintetraessigsäureFisher BioReagentsBP118-500Wird bei der Dissoziation von Inselzellen
verwendet ParaformaldehydSigma-AldrichP6148Zur Fixierung von Zellen
Triton  X-100Fisher BioReagentsBP151Für die Permeabilisierung
von Zellen Normales EselserumJackson ImmunoResearch017-000-121Blockierungsreagenzien für Immunfluoreszenz
Anti-Ki67-Antikörperabcamab15580Für Ki67-Immunfluoreszenz
Polyklonales Meerschweinchen Anti-InsulinDakoA0564Für Insulin-Immunfluoreszenz
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-RabbitJackson ImmunoResearch711-165-152Für Ki67-Immunfluoreszenz
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea PigJackson ImmunoResearch706-175-148Für Insulin-Immunfluoreszenz
DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid)ThermoFisher ScientificD1306Für die Zellkernvisualisierung in Immunfluoreszenz
Aqua-MountLerner Laboratories13800Schnelltrocknende Einbettmedien
FreeZone -105 ° C 4,5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry SystemLabconco7382020Für die Lyophilisierung von Mikrosphären
Poly

Referenzen

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