Studien der neuronalen Morphogenese unter Verwendung von Drosophila Larven dendritischen arborization (da) Neuronen profitieren von in - situ - Visualisierung von neuronalen und epidermalen Proteine durch Immun. Wir beschreiben ein Verfahren, das durch Entfernen von Muskelgewebe aus der Larvenkörperwand Immunfluoreszenzanalyse von da Neuronen und die umliegenden Hautzellen verbessert.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Drosophila Larven dendritischen arborization (da) Neuronen sind ein beliebtes Modell für Mechanismen der neuronalen Morphogenese zu untersuchen. Da Neuronen entwickeln in Kommunikation mit den Epidermiszellen sie innervieren und so ihre Analyse Nutzen aus in situ Visualisierung beider neuronal und epidermal exprimierten Proteine durch Immunofluoreszenz. Traditionelle Methoden der Larven Filets für Immunofluoreszenz Experimente vorbereiten lassen das Muskelgewebe intakt, dass die meisten der Körperwand erstreckt, mehrere Herausforderungen zu meistern neuronalen und epidermalen Proteine Bildgebung. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Muskelgewebe von Drosophila Larven Filets entfernen. Dieses Protokoll ermöglicht die Abbildung von Proteinen, die ansonsten durch Muskelgewebe verdeckt sind, verbessert die Signal-Rausch-Verhältnis, und erleichtert die Verwendung von Superauflösungsmikroskopie DA-Neuronenentwicklung zu untersuchen.
Einleitung
Drosophila Larven dendritischen arborization (da) Neuronen bieten ein wertvolles Modell für die neuronale Entwicklung des Studiums aufgrund ihrer Zugänglichkeit für genetische Manipulation und die Leichtigkeit , mit der sie abgebildet werden kann. Diese sensorischen Neuronen wurden bei der Identifikation zahlreicher Wege instrumental die Dendriten Morphogenese 1-3 steuern.
Vier Klassen von da Neuronen (Klasse I - IV) innervate die Larven Epidermis. Diese Neuronen liegen zwischen der Basalmembran der Epidermis und mit ihren Dendriten bilden weitgehend zweidimensionale Arrays 4,5. Von den vier Klassen, Klasse IV da Neuronen sich die hochverzweigten Lauben haben und, wie sensorische Neuronen von anderen Tieren, erfordert die Ausarbeitung dieser Dorne intrinsischen Faktoren sowie Hinweise aus benachbarten Geweben, insbesondere die Epidermis, für ihre Entwicklung 6-9 .
Studien, um festzustellen, wie solche neuronale und extra neuronale Tatsacheors steuern Dendriten Morphogenese Nutzen aus der Fähigkeit , die Proteinexpression in situ durch Immunfluoreszenz nachzuweisen. Die äußere Kutikula der Larve ist undurchdringlich für Antikörper, aber dieses Hindernis wird durch die Herstellung von Larven Filets durch gut etablierte Dissektion Methoden 10,11 leicht zu überwinden. Allerdings stellt die Körperwand Muskelgewebe, die gerade Inneren der Basalmembran liegt einige Herausforderungen zu Visualisierung von da Neuronen und epidermalen Zellen. Erstens, das Muskelgewebe, welche Linien die meisten der Körperwand, verschleiert stark fluoreszierende Signale von neuronalen oder epidermale Gewebe ausgeht. Dies reduziert erheblich das Signal-Rausch-Verhältnis in der Probe. Zweitens sind viele relevante Proteine werden in das Muskelgewebe sowie in den Neuronen oder Epidermis exprimiert wird. Dieser Muskel abstammenden Fluoreszenzsignal wird weiter zu verdunkeln Erfassung eines Fluoreszenzsignals von dem Neuron oder Epidermis wahrscheinlich. Schließlich Fortschritte in der Mikroskopie-Technologien keinew Genehmigung Bildgebung von Proben , die bei Unterbeugungs Auflösung und kann besonders hilfreich bei der Lokalisierung von Proteinen anspruchsvolle , die in Neuronen und die umliegenden Zellen der Epidermis 12,13 exprimiert werden. Allerdings Bildgebung mittels superauflösende Mikroskopie profitiert von einem starken Signal-Rausch-Verhältnis und die Nähe der Probe auf dem Deckglas. Zusätzlich zu dem Signal-Rausch-Verhältnis zu reduzieren, die Larvenkörperwand Muskel Abstände da Neuronen aus dem Deckglas, wodurch die verbesserte Bildauflösung zu begrenzen, die mit Superauflösungsmikroskopieverfahren erreicht werden kann. Neben Herausforderungen für die Immunfluoreszenzanalyse, stellt das Muskelgewebe eine Barriere für die Aufnahme elektro von sensorischen Neuronen im Larvenkörperwand. Seine Entfernung profitiert daher neurophysiologischen Manipulation von sensorischen Neuronen 14.
Hier ist ein Verfahren zur manuellen Entfernung von Drosophila Larve Muskelgewebe beschrieben. Wir zeigen, dass unser Protokoll permits Immunofluoreszenz Bildgebung von Proteinen, die sonst durch Muskelgewebe verdeckt, verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis für die Visualisierung der Klasse IV da Neuronen und ermöglicht die Verwendung von Superauflösungsmikroskopie zur besseren räumlichen Beziehungen von Proteinen und Zellstrukturen in da Neuronen unterscheiden und die Epidermis.
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Protokoll
Hinweis: Das Verfahren für die Muskelentfernung (Abbildung 1) ist eine Modifikation der zuvor beschriebenen Verfahren für die Larven Filets vor. Die Schritte , die Muskelentfernung vorangehen und folgen , werden kurz skizziert und der Leser wird auf die bisherige Arbeit 10 bezeichnet, 11 für detailliertere Beschreibungen.
1. Dissect Larve in Cold Saline
- Bereiten Sie eine Arbeitsverdünnung von kaltem HL3.1 Salz 15 oder kalt Ca 2+ -freien HL3.1 saline 11 (Tabelle 1). Legen Sie die Larve in einem Silikon-Elastomer-Schale mit gerade genug kaltem Salz den Boden der Schale zu bedecken.
HINWEIS: Siehe Diskussion in Bezug auf die Wahl der Kochsalzlösung.
| 1x HL3.1 Kochsalzlösung (pH 7,2) |
| 5 mM HEPES |
| 70 mM NaCl |
| 5 mM KCl |
| 1,5 mM CaCl 2 (weglassen für Ca 2+ -freien Salzlösung) |
| 4 mM MgCl 2 |
| 10 mM NaHCO 3 |
| 5 mM Trehalose |
| 115 mM Sucrose |
| Filter zu sterilisieren und lagern bei 4 ° C |
| Hinweis: Zusammensetzung ahmt Insekten Hämolymphe |
Tabelle 1. Zusammensetzung des Kalten Saline.
- Positionieren Sie die Larve mit der Bauchseite nach oben. Die ventrale Oberfläche der Larven durch die Bauch Dentical Riemen und der Rückenseite durch die primären Larven Trachealtuben von anterior nach posterior verlauf identifiziert werden. Dehnen Sie die Larve in der anterior-posterioren Richtung und stecken den Kopf und den Schwanz einSiliconelastomerschale mit Insektenstifte sezieren. Verwenden Sie feine Präparierscheren entlang der ventralen Mittellinie zu schneiden, die an einem Ende beginnen und Fortschritte in Richtung auf die andere.
HINWEIS: Diese Ausrichtung bewahrt die häufigsten studierte dorsalen Cluster von da Neuronen. - Nachdem die Larve aufgeschnitten wird, an die Sezieren Gericht die vier Ecken stecken, als ob ein Buch zu öffnen. Verwenden einer Pinzette zu greifen und entfernen Sie die inneren Organe einschließlich des ZNS, Darm und Luftröhre. Stellen Sie Insektenstifte, so dass das Filet ist straff, aber nicht maximal gestreckt.
HINWEIS: Die Muskeln werden auf Segmentgrenzen an der Körperwand verankert. Obwohl Muskeln die meisten der Körperwand bedecken, sind sie in einem engen Bereich in der Nähe der Rückenmittellinie fehlt.
2. Muskelentfernung
- Suchen Sie die Rückenmittellinie der Larve, wo Muskelgewebe fehlt. Positionieren Sie eine einzelne Zange Zinke so dass es unter dem Muskelgewebe in der flachste mögliche Ausrichtung eingefügt werden.
- Beginnt umder Rückenmittellinie in der Nähe der vorderen Begrenzung des Segments gleitet vorsichtig die Zange Zinke zwischen dem Muskel und der Epidermis, wobei darauf geachtet Kontakt zwischen der Zange und der Epidermis zu minimieren.
- Ziehen Sie die Zange nach oben die Befestigung des Muskels an der Körperwand an einem Ankerpunkt zu brechen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Hemi-Segment (e) von Interesse.
HINWEIS: Dieses Protokoll Erhaltung des hinteren jedes da Neuron Dendriten Bereich optimiert. Um den vorderen Teil des Dendriten Feld zu erhalten, ist es am besten, die Zange Zinke am hinteren Ende jedes Segments einzufügen. - Nachjustieren Insektenstifte, so dass die Larven Filet maximal in alle Richtungen gedehnt wird.
- Befestigen Sie das Filet, während es noch auf dem Sezieren Schüssel mit kaltem, frisch zubereiteten 4% Formaldehyd in PBS für 25 min fixiert ist.
- Spülen Sie 5-mal in PBS.
- Verwenden einer Pinzette vorsichtig Muskelgewebe von den übrigen Ankerpunkte ziehen weg, wobei darauf geachtet Conta zu minimierenct mit der Epidermis.
- Loslösen und entfernen Sie das Filet vom Sezieren Schale in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Führen Sie alle nachfolgenden Waschen, Sperrung und Immunfluoreszenzanfärbung Schritte, wie zuvor 11 beschrieben.
3. Montieren Sie den Larval Fillet
- Entfernen Sie zuerst den Kopf und Schwanz mit feinen Präparierschere, um die Probe so flach wie möglich zu machen. Montieren Sie das Filet auf einem Deckglas in Antifade mountant mit der inneren Oberfläche des Filets das Deckglas gegenüber.
- Platzieren Sie einen Objektträger auf dem Deckglas und drücken Sie vorsichtig die Montage Medium zu dispergieren. Klappen Sie den Mikroskop-Objektträger über und versiegeln Sie das Deckglas auf dem Objektträger mit Nagellack. Objektträger für mindestens einen Monat bei -20 ° C gelagert werden.
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Ergebnisse
Wir zeigen den Nutzen des Muskels Entfernungsprozedur für das Signal-Rausch-Verhältnis in Immunofluoreszenz Experimente Verbesserung der septate Junction-Proteine Coracle (Cora) und Disketten-large (DLG) zusammen mit der Klasse IV da Neuronen mit der Membran Marker markiert zusammen visualisieren CD4- tdTomato.
Cora wurde bisher verwendeten Flächen zu identifizieren , wo DA Neuron Dendriten von epidermalen Zellen eingeschlossen sind , und ist eine von viele...
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Diskussion
Hier ist ein Protokoll für die manuelle Entfernung von Muskelgewebe von Drosophila Larven Filets beschrieben. Dieses Protokoll modifiziert vorher Larven- Dissektion Techniken beschrieben 10,11. Nachdem die Larven in einer Silikonelastomerschale zergliedert wird, wird der dorsalen Mittellinie befindet. Eine einzelne Zange Zinke, in seiner flachsten mögliche Ausrichtung, ist zwischen dem Muskelgewebe und der Epidermis, in der Nähe der Rückenmittellinie sorgfältig eingeführt. Die Zange gezogen sanft nac...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Wir danken Gary Laevsky für hilfreiche Diskussionen über die Mikroskopie. Diese Arbeit wurde von NIH finanziert gewährt R01GM061107 und R01GM067758 zu ERG
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Dumont #5 Pinzette | Elektronenmikroskopie Sciences | 72701-D | |
| Mikroschere, 8 cm, gerade, 5 mm Klingen, 0,1 mm Spitzen | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 Silikonelastomer | Kit Dow Corning | 3097358-1004 | für Präparierplatten |
| Austerlitz Insektenstifte, 0,1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 Lichtquelle | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Mikroskopie | ||
| Vectashield Antifading-Eindeckmedium | Vector Laboratories | H-1000 | für die konfokale Mikroskopie |
| Prolong Diamond Antifade-Eindeckmittel | Life Technologies | P36970 | für die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung |
| Mikro-Deckglas, 22 x 22 mm, Nr. 1,5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus Objektträger, 25 x 75 x 1,0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Maus Anti-Coracle Antikörper | Entwicklungsstudien Hybridoma Bank | C615.16 | Überstand, verdünnt 1:50 |
| Maus Anti-Scheiben große Antikörper | Entwicklungsstudien Hybridoma Bank | 4F3 | Überstand, verdünnt 1:50 |
| Kaninchen Anti-dsRed-Antikörper | Clontech | 632496 | verdünnt 1:1.000 |
| Anti-Kaninchen-Antikörper aus Ziege, Alexa Fluor 568 konjugierter | ThermoFisher Scientific | A-11011 | verdünnter 1:1.000 |
| Anti-Maus-Antikörper aus Ziege, Alexa Fluor 488 konjugierter | ThermoFisher Scientific | A-11001 | verdünnt 1:500 |
Referenzen
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- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
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