Methodenartikel

Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen

DOI:

10.3791/54673

⸱

11. November 2016

 ,  ,  , 
1Department of Medical Specialties, Division of Endocrinology, Diabetes, Hypertension and Nutrition, Diabetes Center, University of Geneva Medical School, Institute of Genetics and Genomics in Geneva (iGE3), 2Population Epidemiology Unit (UEP), Community Medicine, Geneva University Hospital

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier beschreiben wir Einstellungen, um die zirkadiane Biolumineszenz und die sekretorische Aktivität von menschlichen Inselzellen und primären Myotuben parallel zu überwachen. Zu diesem Zweck verwendeten wir die lentivirale Genverabreichung eines Luciferase-Kernuhrreporters, gefolgt von einer in vitro Synchronisation und Sammlung des Ausflussmediums durch kontinuierliche Zellperifusion

.

Zusammenfassung

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Circadian Uhren sind funktional in allen lichtempfindlichen Organismen, so dass eine Anpassung an die Außenwelt durch tägliche Umweltveränderungen antizipieren. Erhebliche Fortschritte in unserem Verständnis der engen Verbindung zwischen der inneren Uhr und die meisten Aspekte der Physiologie wurde auf dem Gebiet in den letzten zehn Jahren gemacht. Um jedoch die molekulare Basis zu entwirren, die beim Menschen bleibt der höchste technische Herausforderung, die Funktion des zirkadianen Oszillators zugrunde liegt. Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung eines experimentellen Ansatzes für die langfristige (2-5 Tage) Biolumineszenz Aufnahme und Abfluss Medium Sammlung in kultivierten menschlichen Primärzellen. Zu diesem Zweck haben wir Primärzellen mit einem lentiviralen Luciferase-Reporter transduziert, die unter der Kontrolle eines Kerntakt Genpromotor ist, der für die Beurteilung der parallel Hormonsekretion und circadian Biolumineszenz ermöglicht. Darüber hinaus beschreiben wir die Bedingungen für die in pr die innere Uhr zu störenimary menschlichen Zellen durch Transfektion von siRNA Targeting CLOCK. Unsere Ergebnisse auf der zirkadianen Regulation der Insulinsekretion durch menschliche Pankreasinseln und Myokine Sekretion durch humane Skelettmuskelzellen, werden hier vorgestellt, um die Anwendung dieser Methodik zu veranschaulichen. Diese Einstellungen können verwendet werden, um die molekulare Zusammensetzung von menschlichen peripheren Uhren zu studieren und ihre funktionellen Auswirkungen auf primäre Zellen unter physiologischen oder pathophysiologischen Bedingungen zu analysieren.

Einleitung

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Die zirkadiane Zeitsystem (aus dem Lateinischen "Circa diem") hat sich in allen lichtempfindlichen Organismen, als ein adaptiver Mechanismus zur Rotation der Erde entstanden. Bei Säugetieren wird sie in einer hierarchischen Weise organisiert, die zentrale Uhr umfasst, die in den suprachiasmatischen Kern des Hypothalamus ventral liegt und peripheren (oder Slave) Oszillatoren, die in verschiedenen Organen wirksam sind. Außerdem sind funktionelle diese Zelle autonom selbsterhaltende Oszillatoren in fast jeder Zelle des Körpers 1. Photic Signale stellen eine dominante Synchron Cue (Zeitgeber) für die SCN - Neuronen, während neuronale und humorale Signale von der SCN die peripheren Uhren zurückgesetzt ausgeht. Zusätzlich Rest-Aktivitätsrhythmen, die wiederum Fütterung-Fasten - Zyklen fahren, sind weitere Synchronisierungen für periphere Uhren 2. Nach unserem derzeitigen Verständnis wird die molekulare Zusammensetzung des Kerntakt basiert auf der Transkription und Übersettionalen Rückkopplungsschleifen, die zwischen den Organismen konserviert sind. Dies umfasst die Transkriptionsaktivatoren BMAL1 und CLOCK, die zusammen die Transkription der negativen Gene Kerntakt PER und CRY aktivieren. Hohe Konzentrationen von PER und CRY Proteine ​​ihre eigene Transkription durch Hemmung des BMAL1 / CLOCK Komplexes hemmen. Eine Hilfsschleife besteht aus den Kernrezeptoren REV-ERBs und RORs, der auch die Transkription von BMAL1 und CLOCK regulieren. Darüber hinaus repräsentieren posttranslationale Ereignisse , einschließlich Phosphorylierung, sumoylation, Acetylierung, O-GlcNAcylierung, Abbau und Kern Eintritt der Kerntakt Proteine eine zusätzliche wichtige regulatorische Schicht bei der Festlegung der 24 - Stunden - Schwingungszyklus 3.

Thesaurierend Beweis stammt aus Studien in Tiermodellen und unterstreicht die entscheidende Rolle des zirkadianen Systems bei der Koordination von metabolischen und endokrinen Funktionen 4-5. Eine Anzahl von largE-Skala vorschlagen Transkriptom - Analyse , dass Fütterung - Nüchtern - Zyklen 6-8 eine zentrale Rolle bei der Synchronisation der peripheren Oszillatoren spielen. In einer Vereinbarung mit diesen Studien, Metabolom und lipidomic Analyse bei Nagern und Menschen haben gezeigt , dass eine große Anzahl von Metaboliten im Gewebe schwingen, Plasma und Speichel in einem zirkadianen Weise 9-11. Wichtig ist , zeigen die meisten Hormone zirkadianen Rhythmen im Blut 5,12-13. Darüber hinaus Zirkadianrhythmen des entsprechenden Hormons peripheren Gewebe produzieren könnte Hormonsekretion lokal regulieren. Zellautonome zirkadianen Oszillatoren wurden in Nagetieren und menschlichen Pankreas - Inselzellen 14-16 beschrieben. Diese Oszillatoren spielen eine wesentliche Rolle in der Pankreas - Insel Transkriptom Regulierung und Funktion 15,17-18. Weiterhin wurde Myokine Sekretion durch menschliche Skelett Myotuben kürzlich eine zirkadiane Muster aufweisen gezeigt, die durch zellautonomen oscillato geregeltrs operative in diesen Zellen 19.

Verschiedene Ansätze wurden für die weithin in vivo beim Menschen zirkadianen Rhythmen zu studieren. Zum Beispiel Plasma Melatonin oder sowie Brust-Hautoberflächentemperatur ( zusammengefasst in Referenzen 3,20) Cortisolspiegel wurden endogene zirkadiane Uhren zu bewerten untersucht. Obwohl diese Verfahren die systemische circadian Oszillationen in vivo erlauben , zu studieren, sind sie weit eine zuverlässige Beurteilung der Freilauf autonomen zirkadianen Rhythmen in verschiedenen Organen und Geweben von der Bereitstellung. Dennoch würde eine solche Präparation aus dem systemischen Regulation ein unverzichtbares Werkzeug für das Verständnis der spezifischen Wirkung der intrazellulären molekularen Uhren auf die Funktion dieser Zellen. Daher ist eine erhebliche Anstrengungen unternommen worden , zuverlässige Ansätze zur Untersuchung der menschlichen Uhren in immortalisierten oder primären kultivierten Zellen in vitro synchronisiert zu entwickeln , durchgeführt. Wichtig ist, wurde gezeigt, dassTakteigenschaften gemessen in kultivierten primären Haut - Fibroblasten - Zellen reflektieren eng die einzelnen Takteigenschaften des gesamten Organismus 21. Die Entwicklung von fluoreszierenden und Biolumineszenz circadian Reporter hat diesen Ansatz 22-27 stark vorangetrieben . Weiterhin Studium primären Zell Uhren , die von verschiedenen peripheren Organen ableiten ermöglicht die Untersuchung der molekularen Eigenschaften von menschlichem Gewebe-spezifischen Takte 3,5,16,19-20,28. Somit Beurteilung der inneren Uhren in in vitro synchronisiert primäre Explantate oder Zellen, durch Biolumineszenz Reporter Verwendung stellt eine sehr nützliche Methode , um die molekulare Zusammensetzung von menschlichen peripheren Uhren und ihre Auswirkungen auf die Organfunktion zu untersuchen.

In diesem Artikel werden wir detaillierte Protokolle für die Beurteilung der zirkadianen Genexpression in primären menschlichen Inselchen und Skelettmuskelzellen in vitro synchronisiert präsentieren sowie die Auswirkungen der autonomen Zell UhrStörungen auf der sekretorischen Funktion dieser Zellen.

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Protokoll

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Ethik - Anweisung: Manipulations in diesem Protokoll enthalten von der Ethikkommission der Universität Genf Krankenhaus genehmigt wurden und von der Ethikkommission SUD EST IV (Abkommen 12/111) 19. Menschliche Inseln wurden aus Bauchspeicheldrüsen von hirntoten Multi-Organ - Spender in der Inseltransplantation Zentrum an der Universitätsklinik von Genf (Schweiz) isoliert , wie von uns in Referenzen 16,18 beschrieben, oder von einer kommerziellen Quelle erhalten.

1. Herstellung von primären Zellkultur

  1. Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation, Distanzierung und Kultur
    HINWEIS: Mantel jedes Rohr, Kunststoffspitze oder Pipette mit Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) Medium, um ein Verkleben der Kunststoffoberfläche Inseln oder Inselzellen zu verhindern, was zu einem erheblichen Verlust an Zellmaterial führen kann.
    1. Einen Tag vor der Dissoziation zu Inselzell 1 ml Laminin-5-reichen extrazellulären Matrix (abgeleitet von 804G-Zellen als descriBett in Bezug 29) pro 3,5 cm Schale. Bevor Zellen Plattierung absaugen Matrix und waschen Sie die Schale 3 mal mit sterilem bi-destilliertem Wasser. Dann wird die Schale unter dem Laminar-Flow-Schrank für 5 min trocknen lassen.
    2. Im Inneren des Laminarflowbox, verteilen die erhaltenen kleinen Inseln mit CMRL Medium in 15-ml-Röhrchen (s). Zentrifuge bei 272 × g für 5 min.
    3. Den Überstand aspirieren, und dann das Pellet in 1 ml steriler Dulbecco-phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) vorgewärmt auf 37 ° C ohne Calcium und Magnesium. Zentrifuge bei 272 × g für 5 min.
    4. Aspirieren den Überstand und Zellpellet in 1 ml DPBS.
    5. Um die Gesamtzahl der Inseln, pipettieren 10 & mgr; l aus der 1 ml Insel-Suspension in ein neues 3,5-cm-Schale zählen. Zähle die Anzahl der Inselchen in dem 10 & mgr; l Tropfen unter dem Mikroskop und daraus die Berechnung der Gesamtzahl der Inselchen in dem 1 ml Insel-Suspension. In 14 ml DPBS und Zentrifuge die Zellsuspension eine weitereZeit bei 272 xg für 5 min.
    6. Für Inselzell-Dissoziation, den Überstand aspirieren und 1 ml Zellablösung Lösung für maximal 1.000 Inseläquivalenten (IEQ). Das Röhrchen wird in einem Wasserbad bei 37 ° C und sanft die Inseln mischen durch Auf- und Abpipettieren mehrmals jede Minute, während 6-10 min.
      HINWEIS: Um die Verdauung Qualität zu überprüfen, pipettieren ein 2 ul Tropfen Suspension auf einem Glasträger und überprüfen unter dem Mikroskop, dass alle Zellen gut getrennt sind, und dass keine Dubletten oder Zellklumpen geblieben.
    7. Beenden Sie die Reaktion durch Zugabe von 14 ml kaltem CMRL mit Supplementen (10% fötalem Rinderserum (FBS), 1% L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid, 1% Penicillin-Streptomycin (P / S), 1% Gentamycin, 1 % Natriumpyruvat). Zentrifuge bei 425 × g für 5 min. Den Überstand aspirieren und 15 ml CMRL Medium zu dem Zellpellet.
    8. Das Pellet in einem kleinen Volumen von CMRL mit Ergänzungen. Zähle die Anzahl der Zellen unter dem Mikroskop unter Verwendung eines hemocytoMeter, stellen Sie die CMRL Volumen, um eine Zellkonzentration von ~ 650, 000 Zellen / ml zu erhalten.
    9. Pipettieren 3 getrennt Tropfen von 100 ul jeweils von der dispersen in Schritt 1.1.8 in einer 3,5-cm-Schale erhalten Zellsuspension mit Laminin vorbeschichtet.
      Hinweis: Zellen legen in etwa 24 Stunden auf dem Teller.
    10. Inkubiere Zellen (1A) in einem Gewebekultur - Inkubator bei 37 ° C in einer feuchten Kammer. Ändern das Medium der Zelle alle 2-3 Tage Tropfen durch Absaugen 100 & mgr; l aus jedem Tropfen und mit dem gleichen Volumen an frischem Medium ersetzt.
  2. Menschliche primäre Myoblastenkultur und Differenzierung in Myotuben
    1. Gewebebiopsie, Satelliten-Zellisolierung und Myoblastenkultur
      Hinweis: Muskelbiopsien aus der Gruppe von Etienne Lefai (INSERM, Lyon, Frankreich) erhalten 19.
      1. Reinige primären Skelettmyoblasten nach dem zuvor beschriebenen Verfahren von 30.
    2. Differenziert primary menschlichen Myoblasten in Myotuben
      1. Nehmen Sie eine Phiole (1 x 10 6 Zellen) menschlicher in flüssigem Stickstoff gelagert Myoblasten und auftauen Zellen schnell durch das Fläschchen für 30 sec bis 1 min in einem Wasserbad unter Rühren bei 37 ° C bringen.
      2. Pipetten Zellen (1 ml) in 24 ml Wachstumsmedium, bestehend aus HAM-F 10 mit 20% FBS ergänzt, 1% P / S, 0,5% Gentamycin und 0,2% Amphotericin B.
      3. Zentrifuge 5 min bei 150 x g.
      4. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren Zellen mit 15 ml frischem Wachstumsmedium pro 2,5 x 10 5 Zellen.
      5. Platte mindestens 2,5 x 10 5 Zellen pro F75 adhärenten Kolben. Halten die Myoblasten in einem Zellinkubator bei 37 ° C und 5% CO 2.
      6. Sobald Zellen 60-80% Konfluenz erreichen, dissoziieren die Zellen mit Trypsin-EDTA 0,05% für 1-2 min und in 2 ml Wachstumsmedium auf adhärente 3,5 cm Petrischalen plattieren.
      7. Nach Erreichen der Konfluenz, das Wachstumsmedium zu entfernen.
      8. Starten Sie die Differenzierung Protocol menschlicher Myoblasten in Myotuben, indem sie in 2 Züchten ml Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), enthaltend 1 g / l Glucose, 2% FBS, 1% P / S, 0,5% Gentamycin und 0,2% Amphotericin B (Differenzierungsmedium) in einem Zellinkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. Ändern Sie das Medium alle 2 bis 3 Tage.
        HINWEIS: Myotuben sind in der Regel innerhalb von 7-10 Tagen gebildet.
      9. Überprüfen Muskelzelldifferenzierung unter dem Mikroskop (2A) durch die Fusion von Myoblasten in kernigen Myotuben beobachten 19.

2. small interfering RNA (siRNA) Transfektion

  1. siRNA Transfektion von humanen Inselzellen
    HINWEIS: Die Transfektions-Protokoll wird in Tropfen von 100 & mgr; l am nächsten Tag nach der Zell Dissoziation durchgeführt (Schritte 1.1.1-1.1.10).
    1. Absaugen 100 ul CMRL Medium aus jedem Tropfen und ersetzen Sie es mit dem gleichen Volumen an Serum-freien Minimal Essential Medium (MEM) 2 hvor der Transfektion durch Pipettieren.
    2. Bereiten Sie eine MEM-basierte Mischung aus Transfektionsreagenz und 50 nM Ziel siRNA (SICLOCK) oder 50 nM nicht-Targeting siControl gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      1. Für eine Schale mit 3 Tropfen bereiten zwei 1,5-ml-Röhrchen mit 200 ul MEM jeder.
      2. In einer dieser Röhren 4 ul Transfektionsreagenz.
      3. In dem zweiten Rohr 1 ul des geeigneten siRNA-Stammlösung (20 & mgr; M).
      4. Agitieren, diese beiden Röhren langsam auf dem Orbitalschüttler für 5 min und dann mischen den Inhalt der Rohre zusammen und agitieren für weitere 20 min.
    3. Absaugen 100 ul MEM aus jedem Tropfen und ersetzen Sie es mit dem gleichen Volumen im vorherigen Schritt durch Pipettieren erhalten Transfektionsgemisch.
    4. Ersetzen Sie die Transfektion Lösung mit CMRL Medium nach 4 h Inkubation bei 37 ° C. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.1-2.1.3 am nächsten Tag für die Zellwieder Transfektion.
  2. siRNA Transfektion von humanen Myotuben
    1. Vor der Transfektion, ersetzen Sie das Medium (siehe Schritt 1.2.2.8) mit 2 ml frischem Differenzierungsmedium pro 3,5 cm Petrischale.
    2. In einem sterilen 1,5 ml - Röhrchen, Herstellung einer Mischung aus 20 nM siRNA (siControl oder SICLOCK), die zu 2,4 ul einer 20 uM siRNA - Lösung und 12 ul von Transfektionsreagenz verdünnt in 100 ul Differenzierungsmedium entspricht. Inkubieren der Lösung bei Raumtemperatur für 15 min unter leichtem Schütteln.
    3. Transfizieren Zellen mit 114,4 & mgr; l der siRNA Mischung pro 3,5 cm - Petrischale und legen Zellen in eine Gewebekultur - Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 für 24 Std.

3. Kontinuierliche Langzeit Circadian Biolumineszenz Aufnahme in Parallel mit der Bewertung der Hormonausschüttung in lebenden menschlichen primären Zellen durchgeführt

  1. Einführung in Circadian Biolumineszenz Reporter in primären humanen Zellen, die durchLentivirale Transduction
    HINWEIS: Alle Verfahren mit lentiviralen Partikel müssen in einer Biosicherheitsstufe 2 Einrichtung durchgeführt werden, mit Mitteln zur Arbeit zusätzliche Vorkehrungen zu treffen, die eine moderate potentielle Gefahr für Mensch und Umwelt darstellen.
    1. Bereiten reporter lentivirale Partikel durch Co-Transfizieren des Vektors von Interesse pLenti6.4 / R4R2 / V5-DEST / Bmal1-luc oder pLV156-Per2-dLUC (genannt Bmal1-luc und Per2-luc jeweils) Plasmid 31 mit lentiviralen Vektoren pMD2G und psPAX in 293T - Zellen , die Polyethylenimin - Methode (für Einzelheiten des Verfahrens siehe Referenz 16).
    2. Titrieren der erhaltenen lentivirale Partikel (Details auf der Titration kann bei http://lentilab.unige.ch/ erhältlich). Für weitere Experimente verwenden Lentiviren mit Titern April 10.-Mai 10. transduzierenden Einheiten im Bereich [TU / ul].
    3. Platz Gerichte mit menschlichen Inselzellen oder menschlichen Myoblasten (bei 30-50% Konfluenz) in der Laminar-Flow-Kabineet und ersetzen Sie das Medium mit 2 ml frischem ergänzten CMRL Medium (siehe Schritt 1.1.7) oder Wachstumsmedium (siehe Schritt 1.2.2.2) sind.
    4. Berechnen Sie die Vielzahl der Infektion (MOI) (dh infektiöse Partikel (transduzierenden Einheiten) / Anzahl der Zellen).
    5. Transduzieren die primäre Zellkultur durch Pipettieren Lentivirus - Lösung in die Schale, um ein MOI = 3 (beispielsweise bei 65.000 anhaftenden Zellen werden 3 ul der Viruslösung mit dem Titer von 6,5 x 10 4 bis 100 & mgr; l Medium drop) zu erhalten.
    6. über Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator inkubieren. Ändern Medium am nächsten Tag.
      HINWEIS: Transduktion menschlicher Inselzellen mindestens 4 Tage vor der Biolumineszenz Aufzeichnung, um eine ausreichende Expression des Reporterkonstrukts zu erreichen. Myoblasten werden während der Expansionsphase transduziert, dann bis zur Konfluenz gezüchtet und anschließend in Myotuben differenziert.
  2. In - vitro - Synchronisation von primären humanen Zellen
    1. 10 uM Adenylylcyclase Aktivator Hinzufügen in 2 ml Medium pro 3,5 cm-Petrischale, die Primärzellen zuvor transduzierten in Schritt 3.1.5 enthält.
    2. in einem Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C für 60 min inkubieren.
    3. Ändern des Mediums mit dem Adenylatzyklase-Aktivator mit 2,5 ml des Aufzeichnungsmediums, das 100 & mgr; M Luciferin.
      HINWEIS: Für Zellen menschlichen Insel verwenden CMRL ergänzt mit 10% FBS, 1% L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid, 1% P / S, 1% Gentamycin; für den menschlichen Myotuben Phenolrot verwenden - mit 2% FBS-freiem DMEM mit 1 g / L Glucose supplementiert, 2% L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid, 1% P / S, 0,5% Gentamycin und 0,2% Amphotericin B.

4. Parallele Beurteilung von Circadian Biolumineszenz Aufnahme und die Hormonausschüttung Profile in Synchronized Menschen Sekretorisches Primärzellen

  1. Einrichten Langzeit Constant Perifusion und Biolumineszenz-Aufnahme für Human Primärzellen.
    HINWEIS: Bei der Arbeit outside die Laminarflowbox, reinigen Sie alle Kontaktflächen und begrenzen Exposition der Kulturen oder Medium zu der Luftverunreinigung zu vermeiden.
    1. Um das Perifusion Medium herzustellen, werden 100 & mgr; M Luciferin zu dem Medium.
      HINWEIS: Für Zellen menschlichen Insel verwenden CMRL ergänzt mit 10% FBS, 1% L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid, 1% P / S, 1% Gentamycin; für den menschlichen Myotuben Phenolrot verwenden - mit 2% FBS-freiem DMEM mit 1 g / L Glucose supplementiert, 2% L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid, 1% P / S, 0,5% Gentamycin und 0,2% Amphotericin B.
    2. Im Inneren des Laminarflowbox, öffnen Sie die 3,5-cm-Schalen der transduzierten, transfiziert und synchronisierten primären Zellkulturen (Inselzellen oder Myotuben), die wie oben beschrieben. Legen Sie sterile metallischen Kappen (entwickelt im Haus) (Abbildung 1B2) in die 3,5 - cm - Schalen , die mit Silikon Zustrom / Ausfluß Verbindungsrohre (Abbildung 1B1 / B5) ausgestattet sind.
    3. Die Schalen werden auf der Messplattform im 37 ° C light dichten Inkubator. Befestigen Sie die Gerichte auf die Plattform durch einen schraubbaren Adapter (Abbildung 1B3). Legen Sie die Zustrom / Ausfluß Rohre des Perifusion System in die entsprechenden Silikonschläuche der Kappe (Abbildung 1B1 / B5) und die Drehzahl der Pumpe mit einer Flussrate von ~ 0,5 ml Medium pro 1 Stunde eingestellt.
    4. Öffnen Sie die in-house entwickelt Drip-biolumicorder Software, die die Signale der Photomultiplier-Röhre (PMT) -Detektor aufzeichnet. Wählen Sie das Verzeichnis, in dem die Daten gespeichert werden und kontinuierlich Biolumineszenz starten von jedem Gericht die Aufnahme der "Start" Symbol anklicken.
      HINWEIS: Alternativ zu der Drip-biolumicorder Software, andere Programme (zB LumiCycle) können verwendet werden , um Signale von PMT - Detektor aufzunehmen.
    5. Legen Sie sterile 6-Well-Gewebekulturplatten in der Sammelbox auf Eis.
    6. Öffnen Sie die Steuerungssoftware, die den Zeitpunkt des automatischen Schalter unter den Sammelbrunnen steuert. Stellen Sie die Zeit window mittlerer Sammlung (sec). Beginnen Sammlung des Abflusses Medium alle 4 h (14,400 sec; ~ 2 ml pro Zeitpunkt), indem Sie den "run" Symbol klicken.
    7. Übertragen und messen Sie den Abfluss Medium aus jeder Ansammlung gut in sterile 2 ml-Röhrchen durch Pipettieren. Halten Röhrchen in einem -20 ° C Gefrierschrank, bevor der nächste Schritt beginnt. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.5-4.1.6 alle 24 Stunden.
    8. Stoppen Sie die Biolumineszenz Aufnahme und den Mediumstrom durch das Symbol "Stop" auf der entsprechenden Software klicken. Entfernen Sie die Metallkappen und absaugen Restmittel aus den Gerichten.
    9. Um die sekretierte Protein erhaltenen Werte in verschiedenen Experimenten, entweder extrahieren DNA (Normalisierung durch genomische DNA - Gehalt für Myotuben 19) oder 1 ml Lyse - Säure-Ethanol - Puffer (Normierung durch Gesamthormongehalt für Inselzellen 18) mit dem zu normalisieren Geschirr.

5. Messung Islet Hormone und Myokine Ebenen im OutflowMedium erhalten durch kontinuierliche Perifusion von primären humanen endokrinen Zellen

  1. Insulin
    1. Quantifizierung basalen Insulinspiegel im Abflussmedium von gesammelten Zeitpunkten von einem menschlichen Insulin enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) -Kit unter Verwendung der Anweisungen des Herstellers folgend.
    2. Normalisieren Daten an das absolute Volumen des gesammelten Mediums in jeder Vertiefung gegeben und auf die Gesamtinsulingehalt, extrahiert aus Säure-Ethanol - behandelten Zellen am Ende des Experiments (Schritt 4.1.9) 18.
  2. Interleukin-6 (IL-6)
    1. Quantifizieren basal IL-6-Spiegel in Ausströmrichtung Medium von gesammelten Zeitpunkten durch einen menschlichen IL-6 ELISA Kit Anweisungen des Herstellers folgend.
    2. Normalisieren Daten an das absolute Volumen des gesammelten Mediums in jeder Vertiefung und genomischen DNA-Gehalt am Ende des Experiments (Schritt 4.1.9).

6. Circadian Dataset Analysen für Biolumineszenz und die Hormonausschüttung Profile

  1. Biolumineszenz-Analyse
    1. Analysieren Biolumineszenz Profil mit Hilfe der mitgelieferten Software 19.
  2. JTK-Zyklus-Analyse
    1. Analysieren Sie Hormonsekretion Profile und Biolumineszenz Aufnahmeergebnisse durch den JTK_CYCLE Algorithmus 32 verwendet wird .
    2. Stellen Sie die zirkadiane Periodenbreite bei 20 bis 24 Stunden.
      HINWEIS: Falls die experimentellen Bedingungen wurden parallel aufgezeichnet, ein gekoppeltes statistische Analyse können die Experimente zum Vergleich durchgeführt werden.
  3. CosinorJ Analyse
    1. Alternativ analysieren Hormonausschüttung und circadian Biolumineszenz Profile der Software CosinorJ mit 28.

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Ergebnisse

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Beurteilung der Islet Hormonausschüttung mit Parallel Circadian Biolumineszenz Aufnahme von peri-kondensierte menschlichen Inselzellen

Nach dem Bereitstellen 18 eine erste molekulare Charakterisierung des zirkadianen Uhr, wirksam in menschlichen Inselzellen 16, wollten wir bei der Untersuchung der Auswirkungen von Taktstörungen auf die Inselfunktion und Transkription. Wir setzen eine effiziente SICLOC...

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Diskussion

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Die experimentellen hier beschriebenen Einstellungen bestehen aus lentiviralen Lieferung von circadian Biolumineszenz Reporter in kultivierten humanen primären Zellen, gefolgt von der anschließenden in vitro - Synchronisation und eine kontinuierliche Aufzeichnung der Biolumineszenz für mehrere Tage, und die parallele Analyse von Hormonsekretion durch die gleichen Zellen. Sie stellen einen effizienten Ansatz für molekulare Mechanismen und funktionelle Aspekte der zirkadianen Uhren in primären menschlichen Zellen...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Wir danken unseren Kollegen von der Universität Genf: Jacques Philippe für konstruktive Kommentare zu dieser Arbeit, Ueli Schibler für wertvolle Hilfe bei der Entwicklung des Perifusion System und für die wissenschaftliche Inspiration, André Liani für das Design konzipiert haben, Fertigung und Inbetriebnahme von das Perfusionssystem, Lesa-Technologie LTD Unternehmen für die Unterstützung bei der Perifusion System und Drip-biolumicorder Software-Entwicklung, George Severi für die Unterstützung bei den Perifusion Experimenten Ursula Loizides-Mangold zum Lesen kritisch das Manuskript, und Anne-Marie Makhlouf für Lentiviren Vorbereitungen ; Etienne Lefai, Stéphanie Chanon und Hubert Vidal (INSERM, Lyon) für die menschliche primäre Myoblasten vorzubereiten; und Domenico Bosco und Thierry Berney (Human Islet Transplantation Center, Universitätsspital Genf) für die menschliche Inseln bieten. Diese Arbeit wurde von der Schweizerischen National Science Foundation Grant No finanziert 31003A_146475 / 1, die Sinergia Swiss National Science Foundation Grant No CRSII3-154405, Fondation Romande pour la Recherche sur Diabète, Bo Hjelt-Stiftung, Stiftung Ernst et Lucie Schmidheiny, und Société Académique de Genève (CD).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Trypsin-EDTAInvitrogen25300-054Für die Verdauung von Muskelbiopsien
DPBS kein Calcium kein MagnesiumInvitrogen14190-094
HAM F-10Invitrogen41550-021Für Myoblastenkultur
FBSInvitrogen10270Ergänzung zum Kulturmedium
Penicillin-StreptomycinSigmaP0781-100Ergänzung zum Nährmedium
Gentamycin-Axon A1492.0001Ergänzung zum Kulturmedium
FungizoneInvitrogen15290-026Amphotericin B, Ergänzung zum Kulturmedium
DMEM 1g/L Glukose + Na-Pyruvat + Glutamax Invitrogen21885-025Für die Myotubenkultur
DMEM 1g/L Glukose-Na-Pyruvat - GlutamaxInvitrogen11880-028Aufzeichnungsmedium für LumiCycle
GlutamaxInvitrogen35050-028L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid, Ergänzung zum Aufzeichnungsmedium
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT-104Zellablösung, für die Dissoziation von Inselzellen
CMRLGibco21530-027Nährmedium für Inselzellen
NatriumpyruvatGibco11360-039Ergänzung zum Kulturmedium
15 ml Konisches Röhrchen aus hochklarem PolypropylenFalcon352096
F75 KolbenBD Falcon353136
3,5 cm Petrischale BD Falcon353001
FoskolinSigmaF6886Adenylylcyclase-Aktivator, zur Synchronisation
LuciferinProlume LTD260150Ergänzung zum Aufzeichnungsmedium
OptiMEM Invitrogen51985-026Serumfreies Minimal Essential Medium (MEM) für die Transfektion menschlicher Inselzellen
Lipofectamine RNAiMAX ReagenzInvitrogen13778-150Transfektionsreagenz
HiPerFect ReagenzQiagen301705Transfektionsreagenz
ON-TARGET plus siCLOCK smartpool DharmaconL-008212-00
ON-TARGET plus nicht zielgerichtete siRNA #1 (siControl)DharmaconD-001810-01
DNeasy Blut & Taschentuch-Kit Qiagen69504Für die DNA-Extraktion von Myotuben
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen74104Für die RNA-Extraktion von Myoröhrchen
QIAshredder Qiagen79654Für die RNA-Extraktion von Myotuben
2 ml SammelröhrchenAxygen311-10-051Zur Entnahme des Mediums mit der Perifusion
Gewebekulturplatte, 6 WellBD Falcon 353046Zur Entnahme des Mediums mit dem Perifusionskit
RNeasy Plus Micro Qiagen74034Für die Extraktion von Insel-RNA
IL-6 Instant ELISA Kit für den MenscheneBioscience88-7066-22
Humaninsulin-Kit MercodiaMercodia10-1113-01
Salzsäure, min,37%,p.a.Acrosorganics 124630010Wird zur Herstellung von Lysepuffer (375 ml Ethanol + 7,5 % HCl + 117,5 % H2O)
Ethanol (>99,8 %)Fluka Analytical02860-1LWird zur Herstellung von Lysepuffer (375 ml Ethanol + 7,5 % HCl + 117,5 % H2O)
Menschliche Inseln für die ForschungProdo Laboratories
NameCompanyKatalognummer<strong>Kommentare
Ausrüstung:
ZentrifugeHeraeusMegafuge 1.0R
WasserbadVWR1112A  bei 37 &°; C
Tissu KulturhaubeSchneller SafeFastElite
Tissu KulturinkubatorHeraeusHeraCell 1505% CO2 bei 37 ° C, kein Wasser durch die LumiCycle-Installation
Tissu KulturbrutatorHeraeusHeraCell 1505% CO2 bei 37 &°; C, kein Wasser durch die LumiCycle-Installation
Tissu Kultur-InkubatorThermo ScientificHera Cell 150i5% CO2 bei 37 &°; C
ShakerHeidolph InstrumentsUnimax 1010Zum Rühren des siRNA-Mixes
LumiCycleActimetrics
LumiCycle SoftwareActimetrics
CosinorJ SoftwareEPFLFrei verfügbar unter: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/
Rheodyne titan MX ERC GmbHSteuerungssoftware, die das Timing des automatisierten Schaltvorgangs steuert

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
  2. Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annu Rev Physiol. 72, 517-549 (2010).
  3. Dibner, C., Schibler, U. Circadian timing of metabolism in animal models and humans. J Intern Med. , (2015).
  4. Marcheva, B., et al. Circadian clocks and metabolism. Handb Exp Pharmacol. (217), 127-155 (2013).
  5. Philippe, J., Dibner, C. Thyroid circadian timing: roles in physiology and thyroid malignancies. J Biol Rhythms. 30 (2), 76-83 (2015).
  6. Andrews, J. L., et al. CLOCK and BMAL1 regulate MyoD and are necessary for maintenance of skeletal muscle phenotype and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 19090-19095 (2010).
  7. McCarthy, J. J., et al. Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiol Genomics. 31 (1), 86-95 (2007).
  8. Shostak, A., Husse, J., Oster, H. Circadian regulation of adipose function. Adipocyte. 2 (4), 201-206 (2013).
  9. Dallmann, R., Viola, A. U., Tarokh, L., Cajochen, C., Brown, S. A. The human circadian metabolome. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2625-2629 (2012).
  10. Adamovich, Y., et al. Circadian clocks and feeding time regulate the oscillations and levels of hepatic triglycerides. Cell Metab. 19 (2), 319-330 (2014).
  11. Chua, E. C., et al. Extensive diversity in circadian regulation of plasma lipids and evidence for different circadian metabolic phenotypes in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14468-14473 (2013).
  12. Kalsbeek, A., Fliers, E. Daily regulation of hormone profiles. Handb Exp Pharmacol. (217), 185-226 (2013).
  13. Hastings, M., O'Neill, J. S., Maywood, E. S. Circadian clocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms. J Endocrinol. 195 (2), 187-198 (2007).
  14. Muhlbauer, E., Wolgast, S., Finckh, U., Peschke, D., Peschke, E. Indication of circadian oscillations in the rat pancreas. FEBS Lett. 564 (1-2), 91-96 (2004).
  15. Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
  16. Pulimeno, P., et al. Autonomous and self-sustained circadian oscillators displayed in human islet cells. Diabetologia. 56 (3), 497-507 (2013).
  17. Perelis, M., et al. Pancreatic beta cell enhancers regulate rhythmic transcription of genes controlling insulin secretion. Science. 350 (6261), (2015).
  18. Saini, C., et al. A functional circadian clock is required for proper insulin secretion by human pancreatic islet cells. Diabetes Obes Metab. , (2015).
  19. Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
  20. Saini, C., Brown, S. A., Dibner, C. Human peripheral clocks: applications for studying circadian phenotypes in physiology and pathophysiology. Front Neurol. 6, 95(2015).
  21. Brown, S. A., et al. Molecular insights into human daily behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (5), 1602-1607 (2008).
  22. Asher, G., et al. SIRT1 regulates circadian clock gene expression through PER2 deacetylation. Cell. 134 (2), 317-328 (2008).
  23. Dibner, C. On the robustness of mammalian circadian oscillators. Cell Cycle. 8 (5), 681-682 (2009).
  24. Dibner, C., et al. Circadian gene expression is resilient to large fluctuations in overall transcription rates. EMBO J. 28 (2), 123-134 (2009).
  25. Nagoshi, E., et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119 (5), 693-705 (2004).
  26. Sage, D., Unser, M., Salmon, P., Dibner, C. A software solution for recording circadian oscillator features in time-lapse live cell microscopy. Cell Div. 5, (2010).
  27. Kowalska, E., Moriggi, E., Bauer, C., Dibner, C., Brown, S. A. The circadian clock starts ticking at a developmentally early stage. J Biol Rhythms. 25 (6), 442-449 (2010).
  28. Mannic, T., et al. Circadian clock characteristics are altered in human thyroid malignant nodules. J Clin Endocrinol Metab. 98 (11), 4446-4456 (2013).
  29. Parnaud, G., et al. Proliferation of sorted human and rat beta cells. Diabetologia. 51 (1), 91-100 (2008).
  30. Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. (95), e52049(2015).
  31. Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4 (2), e1000023(2008).
  32. Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. J Biol Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
  33. Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Mol Metab. 3 (1), 29-41 (2014).
  34. Innominato, P. F., et al. The circadian timing system in clinical oncology. Ann Med. 46 (4), 191-207 (2014).
  35. Chitikova, Z., et al. Identification of new biomarkers for human papillary thyroid carcinoma employing NanoString analysis. Oncotarget. 6 (13), 10978-10993 (2015).
  36. Pagani, L., et al. The physiological period length of the human circadian clock in vivo is directly proportional to period in human fibroblasts. PLoS One. 5 (10), e13376(2010).

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