Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen

Volodymyr Petrenko; Camille Saini; Laurent Perrin; Charna Dibner

doi:10.3791/54673

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Methodenartikel

Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen

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DOI:

10.3791/54673

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11. November 2016

Volodymyr Petrenko^*¹ , Camille Saini^*² , Laurent Perrin^*¹ , Charna Dibner¹

¹Department of Medical Specialties, Division of Endocrinology, Diabetes, Hypertension and Nutrition, Diabetes Center, University of Geneva Medical School, Institute of Genetics and Genomics in Geneva (iGE3), ²Population Epidemiology Unit (UEP), Community Medicine, Geneva University Hospital

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir Einstellungen, um die zirkadiane Biolumineszenz und die sekretorische Aktivität von menschlichen Inselzellen und primären Myotuben parallel zu überwachen. Zu diesem Zweck verwendeten wir die lentivirale Genverabreichung eines Luciferase-Kernuhrreporters, gefolgt von einer in vitro Synchronisation und Sammlung des Ausflussmediums durch kontinuierliche Zellperifusion

Zusammenfassung

Circadian Uhren sind funktional in allen lichtempfindlichen Organismen, so dass eine Anpassung an die Außenwelt durch tägliche Umweltveränderungen antizipieren. Erhebliche Fortschritte in unserem Verständnis der engen Verbindung zwischen der inneren Uhr und die meisten Aspekte der Physiologie wurde auf dem Gebiet in den letzten zehn Jahren gemacht. Um jedoch die molekulare Basis zu entwirren, die beim Menschen bleibt der höchste technische Herausforderung, die Funktion des zirkadianen Oszillators zugrunde liegt. Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung eines experimentellen Ansatzes für die langfristige (2-5 Tage) Biolumineszenz Aufnahme und Abfluss Medium Sammlung in kultivierten menschlichen Primärzellen. Zu diesem Zweck haben wir Primärzellen mit einem lentiviralen Luciferase-Reporter transduziert, die unter der Kontrolle eines Kerntakt Genpromotor ist, der für die Beurteilung der parallel Hormonsekretion und circadian Biolumineszenz ermöglicht. Darüber hinaus beschreiben wir die Bedingungen für die in pr die innere Uhr zu störenimary menschlichen Zellen durch Transfektion von siRNA Targeting CLOCK. Unsere Ergebnisse auf der zirkadianen Regulation der Insulinsekretion durch menschliche Pankreasinseln und Myokine Sekretion durch humane Skelettmuskelzellen, werden hier vorgestellt, um die Anwendung dieser Methodik zu veranschaulichen. Diese Einstellungen können verwendet werden, um die molekulare Zusammensetzung von menschlichen peripheren Uhren zu studieren und ihre funktionellen Auswirkungen auf primäre Zellen unter physiologischen oder pathophysiologischen Bedingungen zu analysieren.

Einleitung

Die zirkadiane Zeitsystem (aus dem Lateinischen "Circa diem") hat sich in allen lichtempfindlichen Organismen, als ein adaptiver Mechanismus zur Rotation der Erde entstanden. Bei Säugetieren wird sie in einer hierarchischen Weise organisiert, die zentrale Uhr umfasst, die in den suprachiasmatischen Kern des Hypothalamus ventral liegt und peripheren (oder Slave) Oszillatoren, die in verschiedenen Organen wirksam sind. Außerdem sind funktionelle diese Zelle autonom selbsterhaltende Oszillatoren in fast jeder Zelle des Körpers ^1. Photic Signale stellen eine dominante Synchron Cue (Zeitgeber) für die SCN - Neuronen, während neuronale und humo....