Die Beurteilung Retinal Microglial Phagozytische Funktion In Vivo Mit einem Durchfluss-Zytometrie basierten Assay

Summary

Mikroglia Phagozytose ist von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Homöostase von Gewebe und unzureichende phagozytischen Funktion hat in der Pathologie in Verbindung gebracht. Allerdings ist die Bewertung Mikroglia - Funktion in vivo technisch anspruchsvoll . Wir haben eine einfache, aber robuste Technik für die präzise Überwachung entwickelt und die phagozytische Potenzial von Mikroglia in einer physiologischen Umgebung zu quantifizieren.

Abstract

Mikroglia sind die geweberesidenten Makrophagen des Zentralnervensystems (ZNS) und sie erfüllen eine Vielzahl von Funktionen, die die ZNS-Homöostase unterstützen, einschließlich der Phagozytose von beschädigten Synapsen oder Zellen, Trümmern und/oder eindringenden Krankheitserregern. Eine gestörte phagozytische Funktion wurde mit der Pathogenese von Krankheiten wie Alzheimer und altersbedingter Makuladegeneration in Verbindung gebracht, bei denen sich Amyloid-β-Plaque bzw. Drusen ansammeln. Trotz ihrer Bedeutung war es schwierig, die mikrogliale Phagozytose in vivo zu beurteilen. Hier beschreiben wir eine einfache, aber robuste Technik zur präzisen Überwachung und Quantifizierung des in vivo phagozytären Potenzials von retinalen Mikroglia. Bisherige Methoden stützten sich auf immunhistochemische Färbe- und Bildgebungsverfahren. Unsere Methode verwendet Durchflusszytometrie, um die Aufnahme von fluoreszenzmarkierten Partikeln nach intravitrealer Verabreichung an das Auge bei lebenden Nagetieren zu messen. Diese Methode ersetzt herkömmliche Praktiken, die aufwändige Gewebeschnitte, Immunfärbungen und Bildgebung erfordern, und ermöglicht eine genauere Quantifizierung der phagozytischen Funktion der Mikroglia in weniger als sechs Stunden. Dieses Verfahren kann auch angepasst werden, um zu testen, wie verschiedene Verbindungen die mikrogliale Phagozytose in physiologischen Umgebungen verändern. Obwohl diese Technik im Auge entwickelt wurde, ist ihre Anwendung nicht auf die Sehforschung beschränkt.

Introduction

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es , genau zu beurteilen und in vivo Mikroglia Phagozytose zu quantifizieren. Mikroglia werden die Gewebe Makrophagen des zentralen Nervensystems (ZNS). Sie führen eine Vielzahl von Funktionen, die Wartung von Gewebshomöostase zu gewährleisten. Dazu gehören Immunüberwachung, Sekretion von neurotrophen Faktoren und von zentraler Bedeutung, Phagozytose ^1. Mikroglia Phagozytose ist der Schlüssel in mehrere wichtige Ereignisse während der Entwicklung des Gehirns und der Netzhaut, wie Phagozytose irrelevanter Synapsen (synaptic pruning) und Entfernung von apoptotischen Neuronen ^2-4. Weiterhin wurd....

Protocol

Alle Tiere wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Leitlinien, die vom Scripps Research Institute behandelt.

1. Herstellung von Materialien für die Injektion

1. Sterilisieren eine 33 G - Nadel und Spritze: zerlegen und Autoklaven bei 115 ^ο C Bereiten Nadeln zur Injektion von in steriler Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung steigt (PBS).
2. 10 min - fluoreszierend markierten Teilchen bei Raumtemperatur für 5 aufzutauen. Bereiten Partikelinjektionslösung durch zu einer 50 mg / ml Lösung in sterilem PBS mit Ca ²⁺ Rekonstituieren / Mg ^2+.
   HINWEIS: AF488 markierte Partikel pilzlicher Herkunft , die ^21-....

Results

Hier wir ein Verfahren , um schnell und zuverlässig zu quantifizieren , um die Anzahl der phagozytischen retinalen Mikroglia in einer physiologischen Umgebung unter Verwendung von Durchflußzytometrie - Analyse (Figur 2) beschrieben. Dieses Verfahren kann angepasst werden , um die Wirkung von Verbindungen zu testen , und / oder genetische Manipulation auf der phagozytischen Kapazität von Mikroglia (3A, 3B). (- 20 Tage postnatalen 10) oder erwachs.......

Discussion

Es gibt drei kritische Schritte in diesem Verfahren: (1) intravitreale Injektion von Teilchen fluoreszierend markiert; (2) Die Gewinnung und Herstellung von Netzhautgewebe; und (3) durchflusszytometrische Analyse. Wir empfehlen, dass die Forscher intravitrealen Injektionen vor der Durchführung des Verfahrens üben wir hier vorstellen. Albino - Mäuse (zB BALB / c) und eine farbige Lösung kann (beispielsweise fluoreszenzmarkierte Partikel) für die einfache Visualisierung der Nadel und injizierten Lösung v.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomikroskop	Nikon	Eingestellt
Hamilton  Spritze, Serie 600	Sigma	26702
33 Gauge, Small Hub RN NDL, 0,5 Zoll, Punktform 4 - 12o	Hamilton	7803-05
Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 Konjugat	ThermoFisher Scientific	Z-23373	Unmittelbar vor der Injektion vorbereiten
DPBS	Corning	21-030-CV
Dumont #5/45 Pinzette	Fine Science Tools	11251-35	Benötigt zwei
Dumont #5SF Pinzetten	Fine Science Tools	11252-00
Vannas Federschere - 3 mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-10
Dissoziationskit für gebogenes Nervengewebe – Postnatale Neuronen	Miltenyi Biotec	130-094-802
5 ml Polystyrol Rundbodenröhrchen	Falcon	352054
96 Well U-Bodenplatte	Falcon	353077
Fleckenpuffer (BSA)	BD Biosciences	554657
CD11b-BV650 Antikörper	BioLegend	101259
Ly6C-APC-Cy7	BioLegend
Ly6G-PE-Cy7	BioLegend	127617
Propidiumiodid	BD Biosciences	556463
gereinigter Anti-Maus-CD16/32-Antikörper	BioLegend	101301