Tools, um die Rolle der Architektur-Protein HMGB1 zur Untersuchung bei der Verarbeitung von Helix verzerrenden, ortsspezifische DNA-Quervernetzungen zwischen

Anirban Mukherjee; Karen M. Vasquez

doi:10.3791/54678

Methodenartikel

Tools, um die Rolle der Architektur-Protein HMGB1 zur Untersuchung bei der Verarbeitung von Helix verzerrenden, ortsspezifische DNA-Quervernetzungen zwischen

DOI:

10.3791/54678

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10. November 2016

Anirban Mukherjee¹ , Karen M. Vasquez¹

¹Division of Pharmacology and Toxicology, College of Pharmacy, The University of Texas at Austin

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Gezielter DNA-Schaden kann durch Bindung eines DNA-schädigenden Wirkstoffs an ein Triplex-bildendes Oligonukleotid (TFO) erreicht werden. Unter Verwendung modifizierter TFOs können DNA-Schadens-spezifische Proteinassoziationen und DNA-Topologiemodifikationen in menschlichen Zellen durch die Verwendung von modifizierten Chromatin-Immunpräzipitationsassays und DNA-Supercoiling-Assays, die hierin beschrieben werden, untersucht werden.

Zusammenfassung

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High-Mobility-Group-Box 1 (HMGB1) Protein ein Nicht-Histon-Protein, das in Architektur Regulieren viele wichtige Funktionen im Genom, wie beispielsweise Transkription, DNA-Replikation und DNA-Reparatur beteiligt ist. HMGB1 bindet strukturell verzerrten DNA mit einer höheren Affinität als zu kanonischen B-DNA. Beispielsweise fanden wir, dass HMGB1 bindet an DNA Interstrang-Vernetzungen (ICLs), die die beiden Stränge der DNA kovalent verknüpfen, Verzerrung der Wendel verursachen und nicht reparierten wenn links kann zum Zelltod führen. Aufgrund ihrer zytotoxische Potential sind mehrere ICL auslösende Mittel, die gegenwärtig als chemotherapeutische Mittel in der Klinik eingesetzt. Während ICL bildende Mittel Präferenzen für bestimmte Basensequenzen zeigen (zB 5'-TA-3 'ist die bevorzugte Vernetzungsstelle für Psoralen), DNA - Schäden in einer wahllos Art und Weise sie weitgehend induzieren. Jedoch durch kovalentes Koppeln des ICL-induzierenden Mittels zu einem Triplex Forming Oligonucleotid (TFO), die in einer sequenzspezifischen DNA bindetWeise gezielte DNA-Schädigung erreicht werden. Hier verwenden wir einen TFO kovalent auf der 'Ende zu einem 4'-Hydroxymethyl-4,5' 5 konjugiert, 8-trimethylpsoralen (HMT) Psoralen eine ortsspezifische ICL auf einem mutations Reporterplasmid zu erzeugen als ein Werkzeug zu verwenden, die architektonische Modifizierung, Verarbeitung und Reparatur von DNA-Komplex Läsionen durch HMGB1 in menschlichen Zellen zu untersuchen. Wir beschreiben experimentelle Techniken TFO-gerichtete ICLs auf Reporter-Plasmide herzustellen, und die Assoziation von HMGB1 mit den TFO-gerichtete ICLs in einem zellulären Kontext mit Chromatinimmunpräzipitation Assays zu verhören. Ferner beschreiben wir DNA-Supercoiling Assays spezifische architektonische Modifikation des beschädigten DNA zu bewerten, indem die Menge der superhelikalen Windungen Messung auf dem Psoralen-vernetzt Plasmid durch HMGB1 eingeführt. Diese Techniken können verwendet werden, um die Rollen von anderen Proteinen in der Verarbeitung und Reparatur von TFO-directed ICLs oder anderen zielgerichteten DNA-Schäden in jeder Zelllinie von Interesse beteiligt zu studieren.

Einleitung

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Triplex Forming Oligonucleotide (TFOs) bind duplex DNA in einer sequenzspezifischen Art und Weise via Hoogsteen-Wasserstoffbrückenbindung tripelhelicalen ^1-5 Strukturen zu bilden. Triplex - Technologie verwendet, um eine Vielzahl von biomolekularen Mechanismen, wie Transkription, DNA - Schäden zu reparieren, und Gen - Targeting ( zusammengefasst in Referenzen ^6-8) zu befragen. TFOs wurden ^9,10 ausgiebig zu induzieren ortsspezifische Schäden an Reporter - Plasmide verwendet. Unser Labor und andere haben bislang auf einer TFO, AG30, gebunden an ein Psoralen Molekül ^5,10-12 ortsspezifische DNA - Quervernetzungen zwischen (ICL)....

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Protokoll

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1. Herstellung von TFO-directed ICLs auf Plasmid Substrate

Inkubieren äquimolaren Mengen von Plasmid pSupFG1 ^10,11 DNA (5 ug Plasmid - DNA ist ein guter Ausgangspunkt) mit Psoralen-konjugiertes TFO AG30 in 8 ul von Triplex Bindungspuffer [50% Glycerin, 10 mM Tris (pH 7,6), 10 mM MgCl _2] und dH ₂ O auf ein Endvolumen von 40 ul in einem bernsteinfarbenen Röhre. Gut mischen durch Pipettieren von oben und unten. Inkubieren der Reaktion bei 37 ° C Wasserbad für 12 Stunden.
Wärmen Sie die UVA-Lampe bis zur vollen Leistung zu gewährleisten. Legen Sie die Triplex-Reaktion auf Paraffinfilm, und legen Sie die Paraffinfilm a....

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Ergebnisse

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Bildung des TFO-directed ICL ist kritisch für die Plasmid-basierte Assays, die verwendet werden, um die Rollen von architektonischen Proteine in ICL Verarbeitung in menschlichen Zellen zu befragen. denaturierender Agarosegelelektrophorese ist ein facile Weg, um die Effizienz der TFO-directed ICL Formation zu bestimmen. Die Plasmide TFO-gerichtete ICLs beherbergen wandern mit einer geringeren Mobilität durch die Agarosegelmatrix (1A, Spur 3) im Vergleich zu den nicht-ve.......

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Diskussion

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Die effiziente Bildung von TFO-directed ICLs hängt von zwei entscheidenden Faktoren: Erstens richtigen Pufferkomponenten (zB MgCl ₂₎ und die Zeit der Inkubation des TFO mit seiner Ziel - DNA - Substrat (abhängig von der Bindungsaffinität des TFO an seine Ziel duplex, und die Konzentrationen verwendet werden); und zweitens, die richtige Dosis an UVA (365 nm) Bestrahlung Psoralen Vernetzungen effizient bilden. Optimale Triplex-Bildung kann durch die Verwendung HPLC oder gelgereinigt TFOs erreicht werde.......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

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Die Autoren möchten die Mitglieder des Vasquez Labor für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health / National Cancer Institute unterstützt [CA097175, CA093279 zu KMV]; und die Krebsprävention und Forschungsinstitut für Texas [RP101501]. Die Finanzierung für den offenen Zugang Gebühr: National Institutes of Health / National Cancer Institute [CA093279 zu KMV].

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
5'HMT Psoralen-AG30	Midland Certified Reagent Co., Midland, TX	Sonderanfertigung	HPLC (oder Gel) gereinigtes
einfaches ChIP Enzymatisches Chromatin IP Kit	Zellsignalisierung Inc.	9003	Das vom Hersteller vorgeschlagene Protokoll ist für Chromatin-IP und nicht für Plasmid-IP optimiert. Die Kontroll-IgG- und H3-Antikörper sowie die Protein-G-Kügelchen und die Mikrokokken-Nuklease werden vom Hersteller zur Verfügung gestellt.
GoTaq Green	Promega	M7122	PCR-Mastermix
HMGB1-Antikörper	Abcam	Ab18256
Wizard Gel und PCR-Aufreinigungskit	Promega	A9281
Chloroquin-Diphosphat-Salz	Sigma	C6628-50G	Für die zweidimensionale Agarose-Gel-Elektrophorese
EcoRI	New England BioLabs	R0101S
GenePORTER Transfektionsreagenz	Genlantis	T201015
Vaccinia Topoisomerase I	Invitrogen	38042-024
Blak-Ray langwellige UV-Lampe	Upland, CA	B 100 AP	UVA-Lampe
EpiSonic Multifunktionaler Bioprozessor 1100	Epigentek	EQC-1100	Wasserbad-Ultraschallgerät
Mylar-Filter	GE Healthcare Life Sciences
Agarose	Sigma-Aldrich	A6111
BIO-RAD Chemidoc	BIO-RAD	XRS+ System	DNA-Bildgebungssystem
Glycin	Fisher Scientific	BP381-500
37% Formaldehyd	Sigma-Aldrich	F8775-25ML	Wird zum Vernetzen verwendet
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
DMEM	ThermoFisher	11965092	Zellkulturmedien
PBS	ThermoFisher	70013073	Zellkultur
Trypsin-EDTA	ThermoFisher 25200056		Zellkultur
Bromokresol grün	Sigma-Aldrich	114-359	DNA-Ladefarbstoff
Silikonisierte Röhrchen	Fisher Wissenschaftlich	02-681-320	Mikrofuge-Röhrchen mit niedriger Retention
Tris-Basis	Fisher Scientific	BP152-1
Borsäure	Fisher Scientific	A74-1
EDTA	Fisher Scientific	BP24731
Photometer	InternationalLight Technologies	ILT1400-A	UVA-Dosismessung
Zelllinien
Humanes U2OS-Osteosarkom	ATCC	ATCC HTB-96	Kultiviert nach Lieferanten' Empfehlung
Humanes zervikales Adenokarzinom HeLa	ATCC	ATCC-CCL-2	Kultiviert gemäß Lieferant Empfehlung
Proximaler Forward Primer	5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac Proximaler
reverse Primer	5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg
Distaler Forward Primer	5′-aat acc gcg cat agc ag
Distaler reverse Primer	5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc

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Referenzen

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Moser, H. E., Dervan, P. B. Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation. Science. 238, 645-650 (1987).
Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. Site-specific oligonucleotide binding represses tran....

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