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Störeinflüsse von Zirkulierende miRNAs in Irritable Bowel Syndrome erkannt einen Multiplexed Hochdurchsatz-Gene Expression-Plattform

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DOI:

10.3791/54693

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30. November 2016

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1Digestive Disorders Unit, National Institute of Nursing Research, National Institutes of Health, DHHS, 2National Institutes of Health Research Scholar, Howard Hughes Medical Institute, 3Internal Medicine, Medical School, University of Michigan

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Verwendung einer Multiplex-Hochdurchsatz-Genexpressionsplattform, die die Genexpression durch Barcoding und Zählen von Molekülen in biologischen Substraten quantifiziert, ohne dass eine Amplifikation erforderlich ist. Wir nutzten die Plattform, um die Expression von microRNA (miRNA) im Vollblut bei Probanden mit und ohne Reizdarmsyndrom zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Die Genexpressions Plattform Assay ermöglicht robust und hoch reproduzierbare Quantifizierung der Expression von bis zu 800 Transkripte (mRNA oder miRNAs) in einer einzigen Reaktion. Die miRNA-Test zählt Transkripte durch direktes Abbilden und miRNA-Moleküle digital zu zählen, die mit farbcodierten fluoreszierenden barcodierte Sondensätze (eine Reportersonde und eine Fangsonde) markiert sind. Barcodes sind hybridisierte direkt miRNAs zu reifen, die durch Ligieren eines einzigartigen Oligonukleotid-Markierung (miRtag) an das 3'-Ende verlängert worden sind. Reverse Transkription und Amplifizierung der Transkripte sind nicht erforderlich. Reportersonden enthalten eine Sequenz von sechs Farbpositionen unter Verwendung einer Kombination von vier fluoreszierenden Farben gefüllt. Die vier Farben über sechs Positionen werden verwendet, um ein Gen-spezifischen Farb Barcode-Sequenz zu konstruieren. Post-Hybridisierung Verarbeitung an einem Roboter-Vorbereitungsstation automatisiert. Nach der Hybridisierung werden die überschüssigen Sonden weggewaschen, und die dreigliedrigen Strukturen (Capture Probe-miRNA-Reportersonde) sind an einer mit Streptavidin beschichteten Objektträger über das Biotin-markierte Einfangsonde. Imaging und Barcode-Zählung erfolgt mit einem digitalen Analysator verwenden. Die immobilisierten barcodierte miRNAs werden visualisiert und bebildert, ein Mikroskop und Kamera, und die einzigartigen Barcodes dekodiert und gezählt. Datenqualitätskontrolle (QC), Normalisierung und Auswertung werden von einem speziell entwickelten Datenverarbeitung und Analyse-Software erleichtert, dass der Test-Software begleitet. Der Test zeigt eine hohe Linearität über einen breiten Bereich des Ausdrucks, sowie eine hohe Empfindlichkeit. Proben- und Testvorbereitung beinhaltet keine enzymatische Reaktionen, die reverse Transkription oder Verstärkung; hat wenige Schritte; und ist weitgehend automatisiert, Ermittler Effekte und was zu einer hohen Konsistenz und technischen Reproduzierbarkeit zu reduzieren. Hier beschreiben wir die Anwendung dieser Technologie zu identifizieren zirkulierenden miRNA Störungen in Reizdarmsyndrom.

Einleitung

Reizdarmsyndrom (IBS) ist die häufigste ambulante Diagnose in Gastroenterology, befällt 10 bis 15% der Bevölkerung und die eine erhebliche Belastung für das Gesundheitswesen. Derzeit gibt es keine allgemein anerkannte diagnostische Biomarker für IBS (dh wird die Diagnose anhand von klinischen Symptomen und anderen organischen Störungen auszuschließen, wie GI Krebserkrankung, chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und Magen - Darm (GI) Infektionen). Wenn Gen studieren Expressionsprofile gemeinsam Bedingungen mit subklinischer Histopathologie, wie IBS, hohe Empfindlichkeit und Genauigkeit (Reproduzierbarkeit) benötigt werden , wie Störungen in der Genexpression Profile 1-3 oft subtil sind. miRNAs wurden als sowohl diagnostische und funktionale Ziele in IBS 4,5, identifiziert und wir sind besonders daran interessiert , bei der Beurteilung ihrer Verwendung als Biomarker der IBS-assoziierten biologischen Störungen 3,4,6,7 zirkulieren. Die klinische Verwendung von circulating Biomarkern ist von aktuellem Interesse wegen der Leichtigkeit und minimal - invasive Art der Sammlung der Quelle 'Biomarker (zB peripheren Blut) von Patienten.

Die Genexpression Plattform-Tests, die aufgrund ihrer einzigartigen chemischen und schlanke, meist automatisierten Workflow, bieten eine Microarray-Plattform, die für die gezielte Entdeckung breit und anpassbare Abdeckung (800 Ziele in einer einzigen Reaktion) des Transkriptom zur Verfügung stellt. Sie ergeben auch eine hohe Präzision und Linearität in einem breiten Spektrum von Expressionsniveaus in der Quantifizierung von transkriptomischen Zielen. Der Test erfordert nicht die reverse Transkription von RNA, die Amplifikation resultierenden cDNA oder andere enzymatische Reaktionen. Somit werden durch das Verfahren der digitalen Zähl- reduziert mögliche Fehler durch die hohen Taktzahlen der Amplifikation von RNA-Spezies mit geringer Häufigkeit oder seltene Spleißvarianten eingeführt. Dies bedeutet, dass eine Vielzahl von Probentypen, wie gereinigtes GesamtRNA (dh mRNA + miRNA), RNA aus Formalin fixierten Paraffin eingebettetem (FFPE) Proben sowie grobe Gewebe und Zell - Lysate können mit den Assays verwendet werden.

RNAs von Interesse sind, unter Verwendung eines Paars von Sonden (capture und Reportersonden) erfasst, die jeweils eine zielspezifische Sequenz enthält, die einen entsprechenden Bereich auf der Ziel-RNA erkennt. Um zu gewährleisten , ist die Detektion von kurzen RNAs (dh miRNAs), die reife miRNA - Sequenz durch Tempern eines einzigartigen Oligonukleotid - Markierung (miRtag) an das 3' - Ende des Moleküls verlängert. Ein Überbrückungs Oligonukleotid, das sowohl mit einem Teil des reifen Ziel-miRNA und der miRNA-spezifische miRtag kostenlos ist, wird verwendet, Sequenzspezifität sicherzustellen. Erfassung und Reportersonden abzubinden zum 3 'und 5'-Ende der reifen miRNA-miRtag komplex sind. Die Einfangsonden eine Biotin-Markierung am 3'-Ende aufweisen, die es ihnen ermöglichen, auf die Oberfläche einer mit Streptavidin beschichteten Glasobjektträger zu befestigen, fixing der Fänger-Sonde-miRNA-miRtag-Reportersonde Komplex mit dem Schlitten. Ein elektrischer Strom wird dann verwendet, um den Komplex auf der Gleitfläche zu orientieren, so dass Fluoreszenz Barcodes durch die Reportersonde an dem Ende eines Mikroskops und ladungsgekoppelte Vorrichtung (CCD) -Kamera zu '5 durch visualisiert werden. Barcodes werden gezählt und dekodiert wird, eine Zählung der spezifischen Ziel miRNAs ergibt. Die fluoreszierende Strichcode besteht aus sechs Positionen, die durch eine von vier fluoreszierenden Farben belegt werden kann, die verwendet werden können, mehr als 4.000 Farbbarcode Kombinationen, wobei jede Codierung für eine bestimmte RNA zu konstruieren.

Probenvorbereitung (dh RNA Reinigung oder Zell- / Gewebe Lysat - Zubereitung) sowie die Hybridisierung der Fänger und Reporter - Sonden werden an der Bank durchgeführt. Zwölf Proben können auf einem einzigen Schlitten gemultiplext werden. Nach der Hybridisierung über Nacht, alle weiteren Probenvorbereitung wird von einem Roboter-Vorbereitungsstation durchgeführt. Die geladenen Objektträger werden dann auf Anzeige übertragenigital Analysator für die Abbildung, Zählen, Decodierung und Datenverarbeitung. Die resultierenden Daten werden auf die beiliegende Software importiert, wo sie weiter mit einem hohen Grad an Benutzersteuerung verarbeitet. Die einzigartige Chemie, einfache Zubereitung, automatisierte Natur, einfacher Datentyp (Counts) und insgesamt optimierten Workflow des Assays ermöglichen hochpräzise Genexpression Quantifizierung, es ein nützliches Werkzeug zu machen bei der Untersuchung zirkulierender miRNA-Expressionsprofile und Signaturen in der funktionellen Bedingungen wie IBS.

Protokoll

Die hier beschriebenen Untersuchungen wurde von der Institutional Review Board der National Institutes of Health (Clinicaltrial.gov # NCT00824941) zugelassen.

1. Sammeln von Vollblut Proben

  1. Vollblut-Proben (2,5 ml) von Studienteilnehmern über Venenpunktur in Blutentnahmeröhrchen mit einem RNA-Stabilisierungslösung (unter Berücksichtigung der langfristigen Lagerung) enthält, und speichern Sie sie bei -80 ° C bis zur RNA-Reinigung.

2. Die Gesamt-RNA-Reinigung

  1. Auftauen und die Blutröhrchen für 2 Stunden inkubieren, und sie dann Zentrifuge bei 5000 einen ausklappbaren Rotor für 10 min unter Verwendung von x g. Entfernen Sie den Überstand durch vorsichtiges Gießen oder Pipettieren sie in einen Abfallrohr ab, darauf achten, daß das Pellet zu stören.
  2. Waschen Sie das Pellet durch Zugabe von 4 ml RNase-freies Wasser, ersetzen Sie die Kappe sicher und Wirbel, bis das Pellet sichtbar gelöst ist. Zentrifuge mit einem Schwenkbecherrotor bei 5.000 × g für 10 min und WiederBewegen Sie den Überstand, wie in Schritt 2.1 beschrieben.
  3. In 350 ul BM1 Puffer (mitgeliefert) zum Pellet. Vortex das Pellet bis sie sichtbar aufgelöst ist, und es in ein 2-ml-Verarbeitung Rohr für die automatisierte Gesamt-RNA-Extraktion.
  4. Führen automatisierte Reinigung von intrazellulären RNA, einschließlich miRNA, aus dem Vollblut eines kommerziell erhältlichen RNA Extraction Kit, der auf einem Roboter-RNA-Extraktionssystem automatisiert werden kann.
    HINWEIS: Die automatisierte Robotersystem verwendeten wir können zwölf Proben gleichzeitig verarbeiten, und es dauert 3 Stunden für die RNA-Reinigungsprotokoll zu vervollständigen.
    1. Legen Sie die vorinstallierte Pipettenspitzen, Zentrifugenröhrchen, Puffer und Reagenzien, die in der RNA-Reinigungskits in die Roboter-RNA-Extraktionssystem zur Verfügung gestellt.
    2. Wählen Sie den "Blood miRNA Part A" Protokoll aus der Protokollauswahlmenü und den Lauf starten.
      HINWEIS: Siehe Ergänzende Materialien für eine Beschreibung der automatisierten Verfahren.
    3. Sobald der Roboter zusammenmpleted Teil A des automatisierten miRNA Reinigungsprotokoll, leeren Sie den Behälter Abfall und entfernen Sie die verwendeten Kunststoffe und Reagenzienbehälter aus dem Robotersystem.
    4. Schließen Sie die Abdeckungen auf allen Mikrozentrifugenröhrchen, die eluierte RNA und legen Sie sie in den Shaker-Adapter. Wählen "Blood miRNA Part B" aus der Protokoll - Auswahlmenü die Proben bei 65 o C für 5 min inkubiert.
    5. Sobald der Roboter läuft Teil B des miRNA Reinigungsprotokoll abgeschlossen ist, entfernen Sie sofort die Proben und kühlen sie auf Eis.
  5. Quantifizieren und das gereinigte RNA-Qualität mit einem Spektralphotometer zu bewerten.
    HINWEIS: Gemäß den Protokoll-Empfehlungen für die miRNA-Assay, einer Konzentration von mindestens 33 ng / & mgr; l erforderlich ist, und alle Proben sollten ein 280/260-Verhältnis von 1,9 und einen minimalen 260/230 Verhältnis von 1,8 erfüllen oder übertreffen die Abwesenheit, um sicherzustellen, organische Kontamination von Bedeutung, welche die Testleistung beeinträchtigen kann (siehe 17 bis Referenz).
  6. Lagern Sie die Proben bei -80 o C

3. miRNA Probenvorbereitung

  1. Normalisieren 12 RNA-Proben auf 33 ng / ul Nuklease-freies Wasser.
  2. Bereiten Sie eine 1: 500 Verdünnung der miRNA-Kontrollen im Assay-Kit nukleasefreiem Wasser zur Verfügung gestellt. Halten Sie sich auf dem Eis.
  3. Bereiten Sie das Glühen Master-Mix: Kombinieren Sie 13 ul Anelierungspuffer (zur Verfügung gestellt), 26 & mgr; l miRtag Reagenz (zur Verfügung gestellt), und 6,5 ul der miRNA-Kontrollen (hergestellt in Schritt 3.2) mit 10- und 20-ul-Pipetten.
  4. Unter Verwendung eines 10-ul - Pipette, fügen 3,5 ul des Glühens Mastermix und 3 & mgr; l der RNA - Probe (dh 100 ng) zu jedem von zwölf 0,2-ml Streifenröhrchen. Flick zu mischen, Spin - down mit einem Benchtop - Mini - Mikro (2000 × g), und in den Thermocycler (94 o C für 1 min, 65 ° C für 2 Minuten und 45 ° C für 10 min; halten bei 48 ° C) .
  5. Bereiten Sie die Ligatur Master-Mix durch die Kombination von 3 μl der Puffer Ligatur (zur Verfügung gestellt) und 19,5 & mgr; l des Polyethylenglykols (PEG; bereitgestellt), um eine 20 & mgr; l-Pipette. Hinzufügen, 2,5 & mgr; l des Ligations Mastermix zu jedem der Streifen Rohre aus Schritt 3.4 eine 10-ul-Pipette.
    1. Vorsichtig mischen, Spin - down mit einem Benchtop - Mini - Mikro (2000 × g), und zurück zum Thermocycler bei 48 ° C für 5 min. Nach 5 min eine 10-ul - Pipette, fügen 1 ul Ligase zu jedem Röhrchen direkt in den Thermocycler und brüten sie bei 48 ° C für 3 min, 47 ° C für 3 min, 46 ° C für 3 Minuten, 45 o C für 5 min und 65 o C 10 min; bei 4 o C halten
  6. Entfernen Sie die Schläuche aus dem Thermocycler, mischen sie sanft, drehen sie nach unten mit einem Benchtop-Mini-Mikro (2000 × g) und fügen 1 ul Ligatur clean-up-Enzym (zur Verfügung gestellt). Die Röhrchen in den Thermocycler (37 o C für 1 Stunde und 70 o C für 10 min; halten bei 4 o C). Verwenden Sie ein 10-ul-Pipette.
  7. Entfernen Sie die Rohre und eine 100-ul-Pipette, dann werden 40 ul Nuklease-freies Wasser, zu mischen und Spin-down mit einem Benchtop-Mini-Mikro (2000 × g).

4. miRNA Hybridization

  1. Auftauen Reporter und Fangsonde Sets (mitgeliefert) auf Eis und Spin sie unten ein Benchtop-Mini-Mikro mit (2000 × g).
  2. Mit einer 200-ul-Pipette, fügen Sie 130 ul Hybridisierungspuffer mit dem Reporter Codesatz Rohr (130 ul) der Hybridisierungs Master-Mix zu erstellen. Mischen und Spin-down mit einem Benchtop-Mini-Mikro (2000 × g).
    HINWEIS: Reporter und erfasst Sonden sind spezifisch und Standard für jede miRNA in der Platte enthalten. Benutzerdefinierte Bedienfelder und benutzer entworfen Erfassung und Sondensätze entworfen werden.
  3. In 12 neuen Streifen Röhrchen 0,2 ml, fügen Sie 20 ul des Hybridisierungs Mastermix ein 20-ul-Pipette.
  4. Denaturieren die miRNA Proben aus Schritt 3.7 bei 85 o C for 5 min und kühlt sie auf Eis. Werden 5 & mgr; l zu jedem der Rohre von Schritt 4.3 eine 10-ul-Pipette.
  5. Programmieren Sie den Thermocycler bis 65 ° C bei einer 30-ul - Volumen-berechnete Temperatur und Heizdeckel auf ewig Zeiteinstellung (programmiere es nicht am Ende des Laufes bis 4 ° C herunterzufahren).
  6. Mit einem 10-ul - Pipette werden 5 ul der Fangsonde in jedes Röhrchen gesetzt, mischen, Spin - down mit einem Benchtop - Mini - Mikro (2000 × g) und legen Sie sofort in den Thermocycler bei 65 o C. Inkubieren für nicht weniger als 12 Stunden und nicht mehr als 30 Stunden.

5. Vorbereitung Station und Digital-Analyzer

  1. Laden Sie die Vorbereitungsstation.
    1. Öffnen Sie die Station Tür und laden Sie die Reagenz-Platten (im Lieferumfang enthalten), Patrone (mitgeliefert), Pipettenspitzen (mitgeliefert), vorbereiteten Proben in zwölf 0,2-ml-Streifen Rohre und zwölf leere 0,2-ml Streifenröhrchen (mitgeliefert). Entfernen Sie die Streifen Röhrchendeckel und Reagenzienplattenabdeckung. Schließen Sie die Prep-StationTür und führen Sie den entsprechenden Test aus dem Bedienfeld.
      HINWEIS: Post-Hybridisierung Verarbeitung ist die gleiche, unabhängig von der zu testenden Lauf. Alle Reagenzien und Plastikerzeugnisse sind vorverpackten und bedürfen keiner Vorbereitung, andere als sie auf Raumtemperatur gebracht und die reagenzenthaltenden bei 2000 · g 96-Well-Platten für 2 Minuten zum Stillstand kommen. Alle Komponenten sind in klar definierten Positionen in der Vorbereitungsstation geladen. Siehe Ergänzende Materialien für eine Beschreibung der automatisierten Verfahren.
  2. Visualisieren und die Barcodes der immobilisierten und orientierten tripartite Komplexe zählen.
    1. Nehmen Sie die Patrone aus der Vorbereitungsstation, verschließen Sie diese mit den Deckgläsern versehen, und legen Sie sie im Digital-Analysator in den Schlitz oberhalb der Kamera-Optik.
    2. Wählen Sie den entsprechenden Test (miRNA-Panel-Test) und Test-Version auf dem Assay-Kit angezeigt und das Programm auszuführen.
      HINWEIS: Der Digital-Analysator nimmt dann Sichtfeld Bilder für jede Probenposition eint vier Anregungswellenlängen, so dass die fluoreszierenden Barcodes gelesen und decodiert werden. Spezifischen Barcodes, entsprechend einer spezifischen miRNA, werden gezählt.
    3. Exportieren Sie die Daten-Dateien auf einem USB oder direkt mit dem Server über eine Internet-Verbindung.

6. Datenverarbeitung und -analyse

  1. Klicken Sie auf die "Rohdaten" und wählen Sie "Import RCC-Dateien". Wählen Sie den Ordner mit RCC-Dateien (Rohdaten-Dateien) aus dem USB.
  2. Klicken Sie auf "Weiter", wählen Sie alle Felder aus, QC, und klicken Sie auf "Import".
  3. Klicken Sie auf das "Neue Studie" Tab. Nennen und beschreiben Sie die Studie und zu speichern.
  4. In der neuen Studie, wählen Sie die "New Experiment" Registerkarte und den Namen und das neue Experiment beschreiben. Klicken Sie auf "Weiter" und wählen Sie den RLF-Ordner aus dem linken Bereich, die die entsprechenden Rohdaten-Dateien enthält, die hochgeladen wurden. Sobald sie ausgewählt wurde, klicken Sie auf "Keep Selected", und klicken Sie dann auf "Weiter".
  5. HinzufügenAnmerkungen, falls gewünscht und klicken Sie auf "Weiter".
  6. Wählen Sie die Hintergrund-Subtraktion Methode; entweder negative Kontrolle, leere Spur Subtraktion oder eine benutzerdefinierte Subtraktion kann ausgewählt werden. Einmal ausgewählt, klicken Sie auf "Weiter".
    HINWEIS: Bestimmen Sie die am besten geeigneten Ansatz Hintergrundkorrektur auf der Grundlage der technischen Parameter und biologischen Kontext der Studie.
    HINWEIS: Zählungen sind weniger präzise für Low-Fülle-Ziele. Für die Zwecke der Studie, die wir hier beschreiben, wurden die Daten zunächst ohne Hintergrundkorrektur verarbeitet, um QC-Parameter untersuchen und miRNA unterschiedlicher Häufigkeiten über technische Replikate Variation zählt zu untersuchen. Die Daten wurden dann wieder aufbereitet unter Verwendung eines 25-count Hintergrund Schwelle.
  7. Wählen Sie den "Top 100" Normalisierung, und klicken Sie dann auf "Weiter".
  8. Um die Verhältnisdaten zu erhalten, wählen Sie die Verhältnisparameter und klicken Sie dann auf "Weiter".
  9. Klicken Sie auf "Fertig".
  10. Klicken Sie auf den Namen abperiment in linken Bereich ein Dropdown-Menü zu offenbaren "Raw", "Normalized", "gruppierte", "Ratio Data" und "Analyse von Daten" enthalten.
  11. Klicken Sie auf "Rohdaten" und beobachten einen QC-Bericht im rechten Fensterbereich. Beobachten Sie eine Fahne neben den Proben, die nicht die Standard-QC-Parameter übergeben kann. Erstellen Sie eine neue "Studie", die nicht die markierten Proben nicht enthalten und erneut zu verarbeiten, wie beschrieben, oder einfach markierten QC-Proben aus der Datenanalyse Schritt ausschließen, indem Sie "Ausschließen Proben durch QC / Normalisierung Flag".
    1. Export "Raw", "Normalized" oder "gruppierte" Datendateien in CVS oder einem anderen kompatiblen Dateiformat für die Analyse in einem anderen statistischen oder Microarray-Software.
  12. Wählen Sie "normalisierten Daten" aus dem linken Bereich und wählen Sie die Proben in der Analyse im rechten Fensterbereich einbezogen werden.
  13. Klicken Sie auf "Analyse" und wählen Sie die gewünschte Analysetyp (zB "Heat Map & #34 ;, "Violin Plot", "Box-Plot", "Scatter Plot" oder "Histogramm Plot"). Wählen Sie die gewünschten Ausschlusskriterien Boxen (zB ausschließen die Ausreißer - Proben oder Gene, schließen die Proben durch QC - Flags, schließen Sie die Kontrollgene und / oder die Normalisierung Sonden aus der Datenanalyse ausgeschlossen).
  14. Wählen Sie einzelne Proben werden aus der Analyse ausgeschlossen, wie gewünscht.
  15. Wählen einzelner Gene ausgeschlossen werden aus oder in die Analyse einbezogen, wie gewünscht.
  16. Wählen Sie die Parameter für die gewählte statistische oder Datenvisualisierung Manipulation und klicken Sie auf "Fertig stellen".

Ergebnisse

Transkriptomischen Störung in funktionellen Störungen kann subtil sein, und um zuverlässig diese subtilen Veränderungen in der Expression erkennen, muss die Quantifizierung der Genexpression genau zu sein. Die Genexpression Plattform-Assay-System reduziert den technischen Lärm durch seine hochautomatisierte Natur und die einzigartige Chemie nutzt produziert hochpräzise Genexpressionsdaten. Technische Replikate in 1 gezeigt , die eine hohe Reproduzierbarkeit in beiden endogenen (blaue Punkte) zeigen und viralen miRNA (orangefarbene Punkte; Housekeeping - Gene durch gelbe Punkte dargestellt sind) Quantifizierung Ausdruck, der möglich ist , mit dieser Methode. Mit dieser Methode, virale (Abbildung 2a) und endogene (Abbildung 2b) miRNAs , die Abweichung von den erwarteten Ausdruck zeigen, wie gesunde Studienteilnehmer definiert haben , können als Ziele von Interesse in IBS identifiziert werden. Es sollte beachtet werden, dass es unklar ist, ob die viralen miRNAsdetektiert hier ergeben sich aus viralen Genen in dem menschlichen Genom oder aus Viruslast integriert. Da der Test nur reife miRNAs mit single-nucleotide Spezifität zählt, Kreuzhybridisierung mit ähnlichen endogenen humanen miRNAs ist unwahrscheinlich. Dennoch Differential Steady-State-Konzentrationen dieser Moleküle sind von Interesse als Biomarker. Die Präzision des Verfahrens ermöglicht Störungen bei niedrigen Expressions Ziele detektiert werden, da eine genaue Erfassung dieser Transkripte werden von reichlicher Transkripte überschwemmt werden. Subtile Störungen auch zuverlässig beobachtet werden können. 3 und 4 zeigen einige dieser Störungen in zirkulierenden miRNAs in IBS und IBS-Subtypen im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen , und 5 und 6 (beide 3 angepasst) zeigen sich die beiden wichtigsten unterschiedlich erhöhten miRNAs (Abbildung 5: miRNA 342-3p, Abbildung 6: miRNA 150). in IBS Teilnehmer Abbildung 6 ist ein Beispiel für die graphische Ausgabe der durch die zugeordnete Software erzeugten Ergebnisse.

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. Abbildung 1: Normierte Grafen von zwei technische Replikate technische Replikate laufen auf zwei separaten Patronen zeigen eine hohe lineare Korrelation (r 2 = 0,90, y = 1.03x - 0,4) über den Bereich der normierten (normiert auf die Top - 100 - ausgedrückt miRNAs) miRNA zählt (log2 zählt auf die x- und y-Achse). Das Streudiagramm umfasst Daten für endogenen humanen miRNAs in blau (654 miRNAs), endogenen viralen miRNAs in Orange (80 miRNAs) und Housekeeping-Gene in gelb (8-Gene). Endogene viralen miRNAs waren in früheren Versionen des Tests zur Verfügung (Version 1.4 wurde hier verwendet wird), sind aber nicht mehr auf dem Standardtest einbezogen, obwohl sie als individuelle Ergänzungen zur Verfügung stehen./54693fig1large.jpg "Target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2:. Normalized Grafen von Viren- und endogenes humanes miRNAs in IBS-Verstopfung (IBS - C) im Vergleich zu gesunden Kontrollen Störeinflüsse in (a) virale (orange) und (b) endogenen humanen miRNAs (blau) sind offensichtlich in diesem Beispiel, wo miRNA Zählungen (log2 transformiert) von IBS-C Teilnehmer (y-Achse) sind gegen die regressiert miRNA Zählungen (log2 transformiert) von gesunden Kontrollen (x-Achse). Die Mehrheit der miRNAs Express sehr ähnlich in beiden Populationen, aber einige vor allem aus der Korrelation abweichen. Diese Abweichungen sind offensichtlich sowohl bei seltenen und reichlich ausgedrückt Ziele. Bittehier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 3:. MiRNAs sind deutlich und Einheitlich Differentiell exprimierte in IBS Im Vergleich zu gesunden Kontrollen Differentiell exprimierte miRNAs in IBS enthüllt die lineare Diskriminanzanalyse Effektgröße Methode, die innerhalb der Kategorien Tests der statistischen Signifikanz mit Kontrollen für Konsistenz kombiniert. Bitte klicken Sie hier , um die sehen eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 4:. MiRNAs sind deutlich und Einheitlich Differentiell exprimierte in IBS - Formationsglieder Im Vergleich zu gesunden Kontrollen miRNAs waren differentially ausgedrückt in IBS-Subtypen (-D: Durchfall, -C: Verstopfung). im Vergleich zu gesunden Kontrollen die lineare Diskriminanzanalyse Effektgröße Methode, die innerhalb der Kategorien Tests der statistischen Signifikanz mit Kontrollen für Konsistenz kombiniert Bitte hier klicken , um eine größere zu sehen Version dieser Figur.

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Abbildung 5:. Differentielle Expression von miRNA-342-3p Chronische Bauchschmerzen unbekannter Ursache ist ein Hauptsymptom der IBS. Der Box-Plot zeigt, dass miR-342-3p (normalisierte Zählungen auf der y-Achse), ein miRNA mit chronischer Blasenschmerzen unbekannter Ätiologie verbunden sind, gefunden wurde, zu gesunden Kontrollen verglichen in allen IBS-Subtypen bei höheren Zählungen im Umlauf anwesend zu sein. Die Stäbe der nicht-Ausreißer Bereich darstellen, die Boxes die Inter-Quartil-Bereich und das blaue Quadrat der Median Zahl. Geändert von 3. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 6: unterschiedliche Expression von miRNA-150 A Violine Plot zeigt , dass IBS Teilnehmer signifikant hatten höhere miR-150 zählt im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen (log2 umgewandelt Zählungen auf der y-Achse) im Umlauf.. Die Kurven , die die Frequenz der Zählungen in der Kategorie zeigen, stellen die vertikalen Balken des 1. und 3. Quartile und das rote Viereck zeigt die mittlere Zählung. Geändert von 3. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls

Für den Assay miRNA Insbesondere ist es wichtig, nicht ungereinigt Lysate verwenden (diese können in mRNA und Protein-Assays verwendet werden), da die Reagenzien nicht für die Verwendung mit Lysaten optimiert und Probenvorbereitungsreaktionen wahrscheinlich gehemmt werden. Zusätzlich durch Verunreinigungen aus Lyse und RNA Reinigungsschritte über (zB Guanidinium - Verbindungen, Ethanol und Phenolen) können Ligation und Probenreinigung Reaktionen hemmen. Gute Qualität RNA ist daher von entscheidender Bedeutung, um die Empfindlichkeit und Genauigkeit des miRNA-Assays.

ein Thermocycler mit beheizbarem Deckel zu verwenden ist kritisch richtige Temperaturkontrolle, um sicherzustellen, die Leistung aller Reaktionsschritte zu optimieren. Während Schritt 3.5.1, ist es wichtig, nicht die Streifen aus dem Thermocycler zu entfernen, um die Temperatur während der Zugabe der Ligase zu halten. Das Entfernen der Streifen hinzuzufügen, um die Ligasewird beeinträchtigt die Reaktion. Wenn die Schritte der Hybridisierung durchgeführt wird, ist es entscheidend, kräftiges Schütteln, Pipettieren oder Schnippen zu vermeiden, wenn Reagenzien in den Mischrohre, da dies die Reportersonden abscheren kann. Um eine optimale Leistung und Konsistenz zu gewährleisten, ist es wichtig, in den Rohren durch leichtes Schnippen gründlich Reagenzien mischen. Immer Spin-down-Reaktionen nach dem Mischen und verwenden eine neue Pipette jedes Mal kippen ein Reagens abgegeben wird genaues Pipettieren, um sicherzustellen, und um ein versehentliches Kreuzkontamination zu vermeiden.

Technische Änderungen und Fehlerbehebung

Die Code-Sets können angepasst werden nur Ziele von Interesse sind. Auf diese Weise können die Kosten abgewogen werden für die Prüfung großer Probenmengen zu ermöglichen, wenn eine weitere Untersuchung oder eine Bio-Signatur zu validieren. Benutzerdefinierte Sonden können für Gene oder Ziele nicht zur Verfügung von der a - la - carte - Menü gestaltet werden. Die Empfindlichkeit für weniger reichlich Ziele oder niedriger Konzentration RNA kann seinindem für eine längere Hybridisierungszeit manipuliert und / oder durch höhere auflösenden digitalen Zählen verwendet wird.

In unserer Studie haben wir die vordefinierte 800 Ziel-miRNA-Panel mit Gesamt-RNA aus Vollblut; jedoch können die Assays angepasst werden weniger miRNAs zu schließen, wenn ein gezielter Ansatz erforderlich ist. Insgesamt 24 Proben können an einem einzigen Tag hergestellt werden, in zwei Gruppen von 12 versetzt angeordnet, da zwei Kassetten bequem durch post-Hybridisierungsverarbeitung auf der Roboter-Vorbereitungsstation und abgebildet auf dem digitalen Analysator am nächsten Tag übergeben werden können. Staggered Verarbeitung der Proben in Chargen von 12 ist wichtig, um die Hybridisierungszeit zu standardisieren. Patronen , die abgebildet wurden , können gespeichert und bei 4 ° C gelagert werden erneut abgetastet werden , wenn Daten Analysen legen nahe , dass eine höhere Auflösung scan die Detektion von selteneren miRNAs verbessern. Nachweis von selteneren Moleküle auch durch Hybridisieren Proben für mehr verbessert werden kann; kann jedoch verlängert Hybridisierung Result in Übersättigung und kann nur die Ergebnisse verbessern, wenn die Ausgangs-RNA-Konzentrationen niedrig sind (wie in der extrazellulären Vesikel abgeleitete RNA). Die Plattform der Empfindlichkeit und Präzision ermöglichen relativ niedriger Abundanz miRNAs zuverlässig gezählt werden.

Einschränkungen der Technik

Die beschriebene Gen-Expression Assay-Plattform bietet Platz für nur 800 Ziele pro Array auf. Es ist daher nicht für ganze miRNA-Transkriptom / ganze Transkriptom-Studien geeignet. Nur bekannt, beschrieben und angegebenen Ziele können mit der Plattform erfasst werden, so ist sie nicht auf die Entdeckung neuer molekularer Spezies geeignet. Andere Verfahren, wie beispielsweise RNA-Seq oder anderen herkömmlichen Microarray Methoden eignen sich besser für ganze Transkriptom Sondierungsstudien.

Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / Alternativmethoden

IBS wird durch eine Kombination von Symptomen gekennzeichnet, principally einschließlich Bauchschmerzen; viszerale Überempfindlichkeit; und Veränderungen der Stuhlgewohnheiten, wie häufiges Durchfall, Verstopfung oder eine Kombination aus beidem 9,10. IBS - Symptome haben keine bekannte organische Ursache, und die Patienten präsentieren nicht mit klinisch signifikanten Entzündung, histopathologischen Störungen des Magen - Darm - Gewebe oder systemische Marker 9-12. Forschung deutet darauf hin , dass die biologische Dysregulation in IBS ist subtil, subklinische und heterogen, mit gemeinsamen Themen Schwellen um Entzündungen und Immunfunktion 10. Daher mussten wir Experimentator eingeführte Variation zu steuern, und eine Plattform verwenden, die zuverlässig Erkennung subtile Störungen in der Genexpression fähig war. Die einzigartigen Eigenschaften des Assays und System standardisieren Probenverarbeitung und reduzieren Experimentator durch Automatisierung der Handhabung, die Verringerung technische Varianz hoch reproduzierbare Daten zu erzeugen. Mit diesen Funktionen können für gezielte Untersuchungen und produzieren hochpräzise und replicable Daten. Dies ermöglicht die Erkennung von subtilen Störungen und Störungen unter niedrigem Expression Ziele, die durch die Signale von reichlicher Ziele übersehen oder überschwemmt werden kann, wenn Intensitäts- oder Amplifikation basierenden Verfahren. PCR-basierte Mikroarrays und RNA-Seq Methoden sind brauchbare Alternativen zu den beschriebenen Plattform und als alternative attraktiv sein kann, wenn höhere Durchsätze erforderlich sind, oder wenn es das Ziel ist, die gesamte Transkriptom zu charakterisieren oder zu neuen Molekülen zu suchen. Allerdings Alternativen durchführen kann nicht so gut in genau und sensibel Nachweisen und Quantifizieren von seltenen Ziele und subtile Störungen.

Zukünftige Anwendungen oder Anfahrt nach dieser Technik Mastering

Zirkulierende miRNA-Expression in IBS Teilnehmer zeigten eine Reihe von Störungen, die sowohl signifikant und konsistent zu sein innerhalb der Kategorien gefunden wurden. Die identifizierten miRNAs wurden mit entsprechenden pathwa assoziiertys und pathologischen Bedingungen, einschließlich einer funktionellen Schmerzzustand (miR-342-3p: chronische Blasenschmerzen) 8 und Entzündung (miR-150) 13. Das Beispiel Studie wurde auf einer explorativen Kohorten-basierte verwendet Ziele und Systeme von Interesse zu definieren. Eine gezieltere kleinere miRNA-Array wurde dann konstruiert, die pro Probe Kosten gesenkt werden und damit für viel größere Kohorten in einer kosteneffektiven Art und Weise, um Signaturen und Biomarkern analysiert werden zu validieren und zu verfeinern. Die Genexpression Plattform - Assay - System sorgt für ein Gleichgewicht zwischen der traditionellen explorativen Natur des Mikroarrays und gezieltere, hypothesengeleitete Datenerfassung weiter zu verfeinern und zu testen molekularen Signaturen und Biomarker 14-16. Das Verfahren wird verwendet werden , um molekulare und Protein Störungen in in vivo zu untersuchen und in - vitro - Modellen , bei denen die beschriebenen Ziel miRNAs sind experimentell überexprimiert oder gehemmt. Neue Tests erlauben die gleichzeitige Quantifizierung von mRNAs und proteins direkt von Zell- und Gewebe Lysaten. Darüber hinaus kann durch die Reinigung von bestimmten Fraktionen der peripheren Blut zu optimieren und Exkremente (zB Urin) und durch die Anpassung und bestimmte Testparameter zu optimieren, molekularen Profile und Signaturen mit niedrigem Molekular Konzentration Fraktionen (zB exosomalen Fraktionen) werden geprüft.

Offenlegungen

W.A.H., S.K.A., N.H.F. und R.M.P. halten ein US-Patent (Nr. PCT/US14/38638) für eine zirkulierende miRNA-Signatur des Reizdarmsyndroms, die von der hierin beschriebenen Forschung ausgeht.

Danksagungen

Die Autoren danken Wendy A. Henderson, 1ZIANR000018-01-06 für die Finanzierung durch das U.S. Department of Health and Human Services, die National Institutes of Health, das National Institute of Nursing Research Research und die Division of Intramural Research, Wendy A. Henderson, 1ZIANR000018-01-06, die Intramural Research Training Awards für Nicolaas H. Fourie, Ralph M. Abey und Leeanne B. Sherwin für besondere Unterstützung durch den Burroughs Wellcome Fund.

Die hierin geäußerten Meinungen und die Interpretation und Berichterstattung über diese Daten liegen in der Verantwortung des/der Autor(en) und sollten nicht als offizielle Empfehlung, Interpretation oder Politik der National Institutes of Health oder der Regierung der Vereinigten Staaten angesehen werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
nCounter Prep-StationNanostringN/AEssential
nCounter Digital AnalyzerNanostringN/AEssential
SpektralphotometerNanoDropND-1000Kann eine geeignete gleichwertige
Zentrifugeverwenden JedeN/AKann eine geeignete gleichwertige
MiniMicroCentrifugeJedeN/AKann verwendet werden geeignete äquivalente
Pipetten (1.000, 100, 20, 10 µ l)BeliebigN/AKann ein geeignetes gleichwertiges
QiacubeQiagen9001292ein geeignetes gleichwertiges
PAXgene Blood miRNA KitQiagen763134verwenden Kann ein geeignetes äquivalentes
PAXgene Blutröhrchenverwenden VWR77776-026Kann ein geeignetes äquivalentes
nCounter Human miRNA Assay KitNanostring150625Essential
nCounter Master KitNanostring100050Essential
nSolverNanostringN/AEssential
verwenden kann verwenden

Referenzen

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Schlagwörter

Multiplexe GenexpressionMicroRNA Quantifizierungdigitale Z hlungRNA ExtraktionHybridisierungsassayautomatisierte AufreinigungBiomarker Detektion

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