Methodenartikel

Ein Mausmodell der Gruppe B Streptococcus Vaginal Colonization

DOI:

10.3791/54708

⸱

16. November 2016

 , 
1Department of Pediatrics, Division of Host-Microbe Systems & Therapeutics, University of California San Diego School of Medicine, 2Department of Biology and Center for Microbial Sciences, San Diego State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Der Zweck dieses Protokolls ist die menschliche Gruppe B Streptococcus (GBS) vaginale Besiedlung in einem Mausmodell zu imitieren. Dieses Verfahren kann verwendet werden, Wirtsimmunantworten und bakterielle Faktoren zu untersuchen, um GBS vaginal Persistenz beitragen, sowie therapeutische Strategien testen.

Zusammenfassung

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Streptococcus agalactiae (Gruppe B Streptococcus, GBS) ist ein Gram-positive, asymptomatische Besiedler des menschlichen Magen - Darm - Trakt und vaginalen Trakt von 10 - 30% der Erwachsenen. In immungeschwächten Personen, einschließlich Neugeborene, Schwangere und ältere Menschen, wechseln kann GBS zu einem invasiven Erreger der Sepsis, Arthritis, Pneumonie und Meningitis. Da GBS ein führender bakterielle Erreger von Neugeborenen ist, wird der Strom Prophylaxe von späten Schwangerschaft Screening umfasste für GBS vaginale Besiedlung und die anschließende peripartum Antibiotika-Behandlung von GBS-positiven Müttern. Schwere GBS vaginale Belastung ist ein Risikofaktor für beide Neugeborenen Krankheit und Kolonisation. Leider ist wenig über den Host und bakterielle Faktoren bekannt, die zu fördern oder GBS erlauben vaginale Besiedlung. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Ermittlung persistent GBS vaginal Kolonisierung eine einzelne β-Estradiol Vorbehandlung und tägliche Probennahme unter Verwendung von bakterieller loa zu bestimmen,d. Es weitere Details Methoden zusätzliche Therapien oder Reagenzien von Interesse zu verwalten und vaginalen Lavage und Fortpflanzungstraktes Gewebe zu sammeln. Dieses Mausmodell wird das Verständnis des GBS-Wirt-Interaktion in der vaginalen Umgebung fördern, die potentielle therapeutische Targets führen mütterliche vaginale Besiedlung während der Schwangerschaft zu kontrollieren und Übertragung an den gefährdeten Neugeborenen zu verhindern. Es wird auch von Interesse sein, zu unserem Verständnis der allgemeinen Bakterien-Wirt-Interaktionen in der weiblichen vaginalen Trakt erhöhen.

Einleitung

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Streptococcus agalactiae, Streptococcus Gruppe B (GBS), ist eine gekapselte, Gram-positives Bakterium , das häufig aus dem Darm und Urogenitaltrakt von gesunden Erwachsenen isoliert. In den 1970er Jahren entstand GBS als führende Mittel von Infektionsneugeborenensterblichkeit, mit mehr als 7.000 Fälle von Neugeborenen Krankheit jährlich 1. Frühem Beginn GBS Krankheit (EOD) tritt in den ersten Stunden oder Tage des Lebens, stellt sich eine Lungenentzündung oder Atemnot, und entwickelt sich oft in Sepsis, während late-onset-Krankheit (LOD) erfolgt nach mehreren Monaten und präsentiert mit Bakteriämie, die häufig Fortschritte 2 bis Meningitis. Ab 2002 empfiehlt die Centers for Disease Control and Prevention Universal-Screening für GBS vaginale Besiedlung im späten Schwangerschaft und intrapartum Antibiotikaprophylaxe (IAP) zu GBS-positiven Müttern 1. Trotz der Reduktion der early-onset Krankheit auf etwa 1.000 Fälle in den Vereinigten Staaten jährlich aufgrund von IAP,GBS bleibt die häufigste Ursache für früh einsetzende neonatale Sepsis und late-onset Auftreten bleibt unberührt 1. Ob in utero, während der Arbeit oder sogar in late-onset Fällen erfordert neonatale Exposition gegenüber GBS Überleben, quer durch eine Reihe von Host-Umgebungen und Barrieren, Immunevasion, und, im Fall von Meningitis, Überquerung der stark regulierten blut- Hirn - Schranke 2. Upstream dieser virulenten Wechselwirkungen innerhalb des Neugeborenen ist die erste Besiedlung des mütterlichen vaginalen Trakt. Mütterliche GBS vaginale Besiedlung Preise von 8-18% reichen in Industrie- und Entwicklungsländern, mit einer geschätzten durchschnittlichen Rate von 12,7% 3,4. GBS Besiedlung des vaginalen Trakt während der Schwangerschaft kann bei einzelnen Frauen 5 in der Natur konstant, intermittierend, oder vorübergehend sein. Interessanterweise ist ein mütterliches Alter> 36 Jahren mit anhaltenden Kolonisation 6. Zahlreiche biologische und sozioökonomische Risikofaktoren für GBS vaginale Besiedlungwurde identifiziert. Biologische Faktoren gehören Magen - Darm - GBS Besiedlung und das Fehlen von Lactobacillus im Darm. Allerdings, der ethnischen Zugehörigkeit, Fettleibigkeit, Hygiene und sexuelle Aktivität auch mit GBS vaginal Wagen 7 in Verbindung gebracht worden.

Obwohl berüchtigt für neonatale Infektionen verursacht, verursacht GBS auch eine Vielzahl von Infektionen der Mutter sowohl peripartum und nach der Geburt. GBS Schlitten ist bei Frauen erhöhte sich mit Vaginitis präsentiert 8 und, in einigen Fällen kann sogar der Krankheitseinheit 9 sein. Zusätzlich GBS Aufstieg des Fortpflanzungstraktes während der Schwangerschaft im innerFrucht Infektion oder chorioamnionitis 10 führen kann. Darüber hinaus kann in bis zu 3,5% der Schwangerschaften, verbreitet GBS in die Harnblase 11 mit einer Infektion der Harnwege oder asymptomatische Bakteriurie zu verursachen. GBS bacteriuria während der Schwangerschaft ist mit einem erhöhten Risiko von intrapartum Fieber, chorioamnionitis, Frühgeburt verbunden sind, und premature Bruch von Membranen 12. Zusammengenommen ist das Vorhandensein von GBS innerhalb der vaginalen Trakt, um Infektionen von mehreren Wirtsgewebe verbunden sind, und die Fähigkeit, GBS aus dieser Nische zu beseitigen ist zwingend notwendig, sowohl von Müttern und Neugeborenen Gesundheit.

Bis vor kurzem war der Großteil der Arbeit untersuchen GBS Wechselwirkungen mit dem zervikovaginalen Trakts beschränkt auf in vitro Zellmodellen 13-15. Diese in vitro - Experimente haben bakterielle Faktoren ergeben , dass für die Einhaltung von Bedeutung sind, einschließlich der Oberflächenproteine eine solche Pili und Serin--rich repeats 17,18 sowie Zweikomponentenregulierungssysteme 15,19 und die globale Transkriptionsantwort des vaginalen Epithels GBS 19. Um jedoch alle die Wirt-Mikroben-Interaktionen innerhalb der vaginalen Trakt aufzuklären, ein robustes Tiermodell notwendig. Frühe Arbeiten zeigten , dass GBS kann aus dem vaginalen Trakt von geimpften Mäusen und Ratten 20,21 gewonnen werden 22 in beiden schwangeren und nicht schwangeren Bedingungen. Im Jahr 2005 wurde kurzfristige GBS vaginale Besiedlung bei Mäusen modelliert , um die Wirksamkeit eines Phagen lytisches Enzym zu untersuchen , vaginale GBS über einen Zeitraum von 24 h 23 zu behandeln. Einige Jahre später wurde ein Modell vaginale Besiedlung Maus GBS Langzeit entwickelt Wirt und bakterielle Faktoren Persistenz Regierungs GBS zu studieren. Dieses Modell hat zahlreiche GBS Faktoren einen Beitrag zur Besiedlung, einschließlich der Oberflächen Anhängsel identifiziert 17,18 und GBS Zweikomponentensysteme 19,24. Dieses Modell wurde zur Identifizierung von Wirtsreaktionsmechanismen beigetragen 19,25 und wurde verwendet , um mehrere therapeutische Strategien zu testen, einschließlich immunmodulatorische Peptide 26 und 27 Probiotika. Dieses Protokoll gibt die notwendige Führung GBS in die Maus vaginalen Trakt zu impfen und anschließend Besiedlung zu verfolgen und sammeln Proben für weitere Analysen.

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Protokoll

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Alle Tier Arbeit wurde durch das Amt für Lab Animal Care in San Diego State University und führte unter anerkannten Veterinär Standards zugelassen. Weibliche Mäuse, Alter 8 bis 16 Wochen wurden für die Entwicklung dieser Methode verwendet.

1. Herstellung und intraperitoneale Injektion von β-Östradiol

  1. Messen Sie β-Estradiol (0,5 mg / Maus) auf dem Papier wiegen, während geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen (PPE). ACHTUNG: β-Östradiol durch die Haut und der Schleimhäute absorbiert werden.
  2. Übertragen β-Estradiol in ein 15-ml konischen Röhrchen und Wirbel, bis alle Klumpen entfernt und das β-Estradiol ist ein feines Pulver. Zeichnen Sie up Sesamöl (100 ul / Maus) in einen 10-ml-Spritze. Spritzenfilter Sesamöl in den 15-ml konischen Röhrchen, enthaltend das β-Östradiol unter Verwendung eines 0,45-um-Filter. Vortex, um die 15-ml konischen Röhrchen, bis das β-Estradiol eine homogene Suspension in dem Sesamöl ist.
  3. Zeichnen Sie auf die β-estradiol Suspension in eine neue 10-ml-Spritze. Mit einer 18 G, 1-in. Nadel Aliquot 100 ul der Suspension in 1 ml-Tuberkulin-Spritze. Bereiten Sie eine Spritze für jede Maus. Legen Sie eine neue, sterile 26 G, ½-in. Nadel auf jeder Tuberculinspritze.
  4. Verabreichen 0,5 mg des β-Estradiol in 100 ul Sesamöl suspendiert (5 mg / ml) in jede Maus 24 Stunden vor der bakteriellen Inokulation. Injizieren jede Maus innerhalb der Bauchhöhle, in den unteren Bauch Quadranten, gerade nach rechts oder links von der Mittellinie, wie zuvor beschrieben 28.
    HINWEIS: Keine Reinigung oder Clipping von der Injektionsstelle notwendig ist.

2. Vaginal Inokulation mit GBS

  1. Einen Tag vor der Inokulation wachsen, um eine 5-ml über Nacht Flüssigkultur eines GBS-Stamm von Interesse, wie A909 (Serotyp Ia), in Todd Hewitt-Brühe (THB) bei 37 ° C.
  2. Subkultur der GBS über Nacht Kultur bei 1:10 Volumen in frisches THB und Inkubation bei 37 ° C. wachsen dieBakterien bis zur mittleren logarithmischen Phase (OD 600 = 0,4-0,5). HINWEIS: Dies dauert normalerweise 2 - 3 Stunden, abhängig von der Belastung von GBS.
  3. Übertragen Sie die Subkultur in ein steriles 15 ml konischen Röhrchen und Pellet-Bakterien bei 3000 × g für 5 min. Den Überstand aspirieren. Resuspendieren der Bakterienpellet in 200 & mgr; l steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS).
  4. Unter Verwendung des resuspendierten Pellets, bringen 3-5 ml PBS (1 ml pro 10 Mäuse) genau OD 600 = 0,4 in einem neuen 5-ml - Kulturröhrchen. Dadurch wird eine Konzentration von ~ 1 × 10 8 koloniebildenden Einheiten (CFU) / ml sein. Transfer in ein neues 15 ml konischen Röhrchen und erneut pelletieren, die Bakterien bei 3.000 × g für 5 min. Den Überstand aspirieren.
  5. Resuspendieren des Pellets in PBS das ursprüngliche Volumen bei 1/10. Wenn beispielsweise 3 ml OD 600 = 0,4 wurde pelletiert, resuspendiert dann in 300 ul PBS. ANMERKUNG: Dies ist der letzte Bakteriensuspension (~ 1 × 10 9 CFU / ml) für die Tierimpfung verwendet.
  6. Reserve 50 ul dieser Suspension für die serielle Verdünnung und Plattierung auf THB Agar die genaue Inokulum zu bestimmen.
  7. Beimpfen jeder Maus mit 10 ul der endgültigen Bakteriensuspension so dass 1 × 10 7 CFU an jede Maus verabreicht.
    1. Die Maus manuell zu impfen, zurückhalten , indem die lose Haut am Genick zwischen der Handler Daumen und Zeigefinger und dann Immobilisierung der Schwanz zu sichern, wie zuvor 28 beschrieben.
    2. Zeichnen bis 10 ul der GBS, hergestellt in Schritt 2.6 in einen 200-ul Gel Ladepipettenspitze. Legen Sie die Spitze 5 bis 10 mm in die Vaginallumen und verzichtet die 10 ul Inokulum.
      HINWEIS: Um das Risiko von Organtrauma oder Verletzungen zu minimieren, vor allem bei jüngeren oder kleineren Mäuse Gel Ladespitzen werden über Standard-200-ul-Tipps bevorzugt.
    3. Unmittelbar Impfung folgenden, lassen Sie die Schopfe und heben das Hinterende der Maus, die Maus am Schwanz heben und walking den Vorderpfoten auf einer harten Oberfläche für ca. 1 min.
    4. Sichtprüfung für jede Rückfluss von Inokulum die vaginale Öffnung. Wenn Rückstau beobachtet wird, kann eine frische Pipettenspitze verwendet werden, zu manipulieren oder die vaginale Öffnung vergrößern, erleichtert die Aufnahme des Rückstau in das Lumen. Zusätzlich über eine Pipette und erneut inokuliert kann Rückstau abgesaugt werden.
      HINWEIS: Bei Verabreichung von topischen Mitteln, probiotischer Organismen oder Proteine ​​von Interesse, ein Volumen von bis zu 20 & mgr; l in einem physiologischen Puffer kann in den vaginalen Trakt gegeben werden.

3. Abtupfen die Vaginallumen zu GBS laden Quantifizieren

  1. Bereiten Sie eine 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen pro Maus durch Zugabe von 100 ul PBS. Unmittelbar vor dem Abtupfen, den Tupfer in PBS vorbefeuchtenden.
  2. Begrenze die Maus, wie in Schritt 2.7.1 und legen Sie den Tupfer 10 mm in das Vaginallumen beschrieben. Vorsichtig drehen Sie den Tupfer 4-mal im Uhrzeigersinn und 4-mal gegen den Uhrzeigersinn, leichten Druck auf die Scheidenwand anwenden.
  3. Bringen Sie den Tupfer auf die 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 ul PBS. Vor dem Beschichten, Wirbel der Mikrozentrifugenröhrchen für ~ 15 Sekunden, die Bakterien aus dem Tupfer zu lösen. verdünnen Abwechselnd jede Probe in PBS und Platte 20 ul-Verdünnungen 01.10 bis 1: 10.000 auf Differenzierungsmedium-Agar-Platten gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Inkubiere die Platten bei 37 ° C für 24 Std. GBS Kolonien entweder hell rosa oder lila in Farbe erscheinen. Andere endogene Flora wird gehemmt, oder wird als blau, weiß oder grau Kolonien erscheinen.

4. Sammeln Vaginal Lavage

  1. Begrenze die Maus, wie in Schritt 2.7.1 beschrieben. Mit Hilfe eines 200-ul Gel Ladepipettenspitze, pipettieren 20 ul PBS in das Vaginallumen. Pipettieren vorsichtig das gesamte Volumen auf und ab 4-mal innerhalb des Lumens, und dann das gesamte Volumen in der gleichen Pipettenspitze zurückziehen. HINWEIS: Wenn die Spülflüssigkeit mit Schleim ist dick, ein Standard 200 ul Pipettenspitzekann die endgültige Spülflüssigkeit zu sammeln verwendet werden.
  2. Lavage für Zytokin-Analyse oder CFU Quantifizierung verzichtet werden in einem 0,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen Wenn sparen. Wenn die Bestimmung der Phase der Brunst, verzichtet werden mindestens 5 & mgr; l Waschflüssigkeit auf einen Glasträger und beobachten Sie die Zellen unter 100-facher Vergrößerung auf einem Lichtmikroskop. HINWEIS: Für die Beispiele von estrous Stufen siehe Abbildung 1.

5. Gewebe Dissection und Homogenisieren

  1. Für jede Maus, bereiten drei 2-ml-Schraubverschluss Röhrchen (eine für jedes Gewebe: Vagina, Gebärmutterhals und Gebärmutter). Füllen Sie jedes Röhrchen mit reichlich (0,4-0,5 g) 1,0 mm Zirkoniaperlen die kegelförmigen Boden des Röhrchens zu decken.
  2. Autoclave die vorbereiteten Röhrchen vor dem Sammeln von Gewebe für 30 Minuten bei 121 ° C, vor allem, wenn bakterielle Belastung zu quantifizieren. Hinzufügen 500 ul sterilem PBS in jedes Röhrchen. Wiegen Sie jedes Röhrchen nach dem Autoklavieren und Aufzeichnung zum späteren Nachschlagen gewonnen Gewebegewicht zu berechnen.
  3. Opfer der Maus genehmigt institutionellen Methoden wie CO 2 Ersticken und Zervikaldislokation verwenden. Sprühen Sie die ventrale Abdomen mit 70% EtOH nach unten. Mit einer sterilen Schere, öffnen Sie die abdominopelvinen Höhle, heben Sie die Rückenhaut und Bauchmuskulatur, und verdrängen den Darm, so dass die Fortpflanzungsorgane ausgesetzt ist.
  4. Sterilisieren Sie die Schere mit 70% EtOH, sauber wischen, wenn nötig, und schneiden beide Uterushörner halber Länge zwischen der Gebärmutterkörper und der Ovarien. Mit einer Schere und Pinzette, separates viszerale Fett, Membranen und die Harnblase entfernt von der Fortpflanzungsorgane, bewegen kaudal.
  5. Sterilisieren Schere, wie in Schritt 5.4 beschrieben. Transversely schneiden die Vagina so nah an der Vulva wie möglich auf die Fortpflanzungsorgane vom Körper zu trennen. Heben und entfernen Sie die intakte Fortpflanzungstrakt und legen Sie sie in einer sterilen Petrischale.
  6. Mit Hilfe einer neuen Rasierklinge, trennen Sie die Gebärmutter aus dem Gebärmutterhals in einem Querschnitt. Sterilisieren Sie die Rasierklinge mit 70%EtOH, und trennen sich dann die Zervix von der Vagina in einem Querschnitt. HINWEIS: Es wird immer noch eine minimale Menge an uterine Gewebe des Gebärmutterhalses angebracht sein. Es wird eine minimale Menge von vaginalen Gewebe immer noch auf den Gebärmutterhals angebracht.
  7. Mit einer sterilen Pinzette, übertragen jede der Gewebe in ihre jeweiligen 2-ml-Röhrchen, die PBS und Homogenisieren Perlen. Reinigen Sie die Zange mit 70% EtOH zwischen den einzelnen Gewebe Handhabung.
  8. Wiegen Sie jede 2-ml Schraubdeckel Rohr und subtrahieren das ursprüngliche Gewicht des Glases, das Gewebe Gewicht zu bestimmen. Gewebegewichte variieren typischerweise zwischen 20 bis 100 mg. die Schraubkappe Rohre dicht versiegeln und die Gewebe für 1 min bei Maximalgeschwindigkeit in einem Gewebe-Homogenisator homogenisiert.
  9. Bakterienbelastung, verdünnte seriell 25 ul Gewebehomogenat und Platte Verdünnungen 01.10 bis 1 zu quantifizieren: 10.000 auf Differenzierungsmedium-Agar-Platten. Inkubieren Sie die Platten, wie in Schritt 3.3 beschrieben. Zum Speichern von Proben für die Zytokin-Quantifizierung, gefrier Gewebehomogenisate bei -20 ° C.

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Ergebnisse

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Bei der Entwicklung dieses Modells wurden mehrere Beobachtungen in Bezug auf Faktoren, welche die Dauer von GBS vaginale Besiedlung beeinflussen. Um zu bestimmen, wie estrous Stufe bei der Impfung Auswirkungen GBS bakterielle Persistenz, Mäuse wurden am Tag der Impfung über vaginalen Lavage in Szene gesetzt. Abbildung 1 zeigt die vier Stufen der Maus Östrocyclus, bestimmt durch nass-Mount vaginalen Lavage, ein gut etabliertes Verfahren 29. Mäuse wurden in Grup...

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Diskussion

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Um die Förderung des Verständnisses von GBS Wechselwirkungen mit der sowohl dem Host und andere Mikroben im Rahmen des Host Ferner ist ein Tiermodell erforderlich. Diese Arbeit beschreibt die technischen Aspekte bei Mäusen GBS vaginale Besiedlung zu etablieren. Dieses Protokoll erreicht> 90% Kolonisierung von Mäusen ohne die Verwendung von Anästhetika Bakterien zu beimpfen, oder Abstrichproben, immununterdrück zu sammeln Kolonisierung, vaginal Vorwaschen zu aktivieren, oder Zusätze, um die Impfkultur zu verdicken. Da...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

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Wir möchten dem Vivarium-Manager und den Mitarbeitern der San Diego State University für die Unterstützung bei der Tierhaltung danken. Bei dieser Arbeit wurde K.A.P. durch ein ARCS-Stipendium und ein Stipendium der Inamori Stiftung unterstützt. K.S.D. wird durch einen R01-Zuschuss NS051247 von den National Institutes of Health unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Sesamöl Sigma AldrichS3547-250ML
β-Östradiol Sigma AldrichE8875-1GACHTUNG: Tragen Sie geeignete PSA. β-Östradiol kann über die Haut und die Schleimhautoberflächen aufgenommen werden. 
200 μ l Pipettenspitzen zum Laden von Gelen USA Scientific1252-0610
Urethro-genitale, sterile Calciumalginat-TupferPuritan25-801 A 50
CHROMagar StrepBDRG InternationalSB282
Todd Hewitt BouillonHardy Diagnostics7161C
18 G, 1,5-Zoll-NadelnBD305199
26 G, 0,5-Zoll-NadelnBD305111
10 ml SpritzenBD309604
1 ml SpritzenBD309659
0,45 μ m PVDF-SpritzenvorsatzfilterWhatman6900-2504
Dulbecco's Phosphatgepufferte Salzlösung 1xCorning21-031-CV

Referenzen

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