Entwicklung von Stammzellen abgeleiteten Antigen-spezifische regulatorische T-Zellen gegen Autoimmunität

Summary

Wir stellen hier eine Methode zur Entwicklung von funktionellen Antigen (Ag)-spezifischen regulatorischen T-Zellen (Tregs) aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) für die Immuntherapie von Autoimmunarthritis in einem Mausmodell vor.

Abstract

Autoimmunerkrankungen entstehen aufgrund der Verlust der immunologischen Selbsttoleranz. Regulatorische T-Zellen (Tregs) sind wichtige Vermittler von immunologischer Selbsttoleranz. Tregs repräsentieren etwa 5 - 10% der reifen CD4 ⁺ T - Zell - Subpopulation bei Mäusen und Menschen, mit etwa 1 bis 2% der Tregs im peripheren Blut zirkulieren. Induzierte pluripotenter Stammzellen (iPS) in funktionelle Treg unterschieden werden, die ein Potential für zellbasierte Therapie von Autoimmunerkrankungen eingesetzt werden. Hier präsentieren wir eine Methode Antigen (Ag) -spezifische Tregs von iPS - Zellen zu entwickeln (dh iPS-Tregs). Das Verfahren basiert auf den Transkriptionsfaktor FoxP3 enthält und eine Ag-spezifischen T-Zell-Rezeptor (TCR) in iPSCs und dann Notch Differenzierung auf Zellen OP9 Stromazellen exprimieren Liganden delta-like (DL) 1 und DL4. Folgende in vitro Differenzierung exprimieren die iPSC-Treg CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3 und Ag-spezifischen TCR und können Ag - Stimulation reagiert.Diese Methode wurde zur zellbasierte Therapie von Autoimmun Arthritis in einem Mausmodell erfolgreich angewendet. Adoptive Übertragung dieser Ag-spezifischen iPSC-Treg in Ag-induzierten Arthritis (AIA) -haltigen Mäusen hat die Fähigkeit, Gelenkentzündung und Schwellungen zu reduzieren und Knochenverlust zu verhindern.

Introduction

Autoimmunarthritis ist eine systemische Erkrankung, die durch eine Hyperplasie des Synovialgewebes und eine fortschreitende Zerstörung von Gelenkknorpel, Knochen und Bändern gekennzeichnet^{ist 1}. Die fehlerhafte Erzeugung oder Funktion von Tregs bei Autoimmunarthritis trägt zu chronischen Entzündungen und Gewebeverletzungen bei, da Tregs eine entscheidende Rolle bei der Verhinderung der Entwicklung autoreaktiver Immunzellen spielen.

Manipulation von Tregs ist eine ideale Strategie für die Entwicklung von Therapien zur Unterdrückung von Entzündungen in Ag-abhängiger Weise. Bei der Treg-basierten Immuntherapie ist die Spezifität der übertragenen Tregs wichtig für die Behandlung der anhaltenden Autoimmunität². Um die suppressive Aktivität zu zeigen, müssen Tregs wandern und in der betroffenen Region gehalten werden, was durch die Spezifität des TCR für das Ag an diesem Ort gesteuert werden kann³. Obwohl polyklonale Tregs eine kleine Population enthalten können, die diese Ag-Spezifität aus ihren TCRs enthält, ist die Anzahl dieser Ag-spezifischen Tregs in der Regel gering. Folglich erfordern zellbasierte Therapien mit polyklonalen Tregs gegen Autoimmunerkrankungen einen adoptiven Transfer einer großen Anzahl von Tregs^4,5. Da pluripotente Stammzellen (PSCs) die Fähigkeit haben, sich zu jeder Art von Zelle zu entwickeln, könnten sich Ag-spezifische PSC-Tregs als gute Kandidaten für eine Treg-basierte Immuntherapie erweisen. Frühere Studien haben die erfolgreiche Entwicklung von PSC-abgeleiteten T-Zellen gezeigt, einschließlich der Tregs^6-8.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Entwicklung von Ag-spezifischen iPSC-Tregs. Des Weiteren beschreiben wir eine zellbasierte Therapie der Autoimmunarthritis in einem Mausmodell unter Verwendung solcher Tregs. Diese Methode basiert auf der genetischen Modifikation von murinen iPSCs mit Ag-spezifischen TCRs und dem Transkriptionsfaktor FoxP3. Die manipulierten iPSCs differenzieren sich dann in Ag-spezifische Tregs auf den OP9-Stromazellen, die die Notch-Liganden DL1, DL4 und MHC-II (I-A^b) Moleküle in Gegenwart der Zytokine mFlt3L und mIL-7 exprimieren. Diese Ag-spezifischen iPSC-Tregs können suppressive Zytokine wie TGF-β und IL-10 produzieren, wenn sie mit dem Ag stimuliert werden, und der adoptive Transfer solcher Tregs hat die Fähigkeit, die AIA-Entwicklung in einem Mausmodell zu unterdrücken. Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um aus Stammzellen gewonnene Ag-spezifische Tregs für potenzielle therapeutische Interventionen zu entwickeln.

Protocol

Alle Tierversuche werden von der Pennsylvania State University College of Medicine Animal Care Committee (IACUC Protokoll # 45470) zugelassen und werden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Vereinigung für die Bewertung und Zulassung von Labortierpflege durchgeführt.

1. Stammzellkultur

1. Inkubieren einer 10-cm-Schale mit 10 ml 0,1% Gelatine für mindestens 30 Minuten bei 37 ° C (Inkubator), um die Platte zu beschichten.
2. Entfernen Gelatine aus der Schale und der Platte 3 x 10 ⁶ bestrahlten SNL76 / 7 - Zellen und Inkubation für einen Tag bei 37 ° C (Inkubator) 10% DMEM - Medium (10% FBS und 1% Penicillin - Streptomycin) verwendet wird .
3. Entfernen Sie die Medien von der Platte und Kultur aufgetaut iPSCs über die SNL76 / 7-Zell Feeder-Schicht unter Verwendung von iPS-Medien (DMEM-Medium, das 15% fötales Kälberserum, 0,1 mmol / l nicht-essentielle Aminosäuren, 1 mmol / l L-Glutamin und 0,1 mmol / l β-Mercaptoethanol) ^9. Die Maus iPS-MEF-Ng-20D-17-Zellen-Line, die aus embryonalen Maus-Fibroblasten durch retroviralen Transfektion von Oct3 / 4, Sox2, Klf4 und c-Myc, induziert wurde, wurde von Dr. Shinya Yamanaka (Institut für Frontier Medical Sciences, Universität Kyoto, Kyoto, Japan) erhalten.
4. Ändern Sie die Medien am Tag 3 mit frischen Medien und beobachten iPSC Kolonien unter dem Mikroskop.
   HINWEIS: Diese Kolonien sind kleine, glänzende Cluster oder runde Zellen mit einer klaren Abgrenzung GFP-Expression unter einem Fluoreszenzmikroskop zeigt.

2. In vitro Differenzierung von Ag-spezifischen iPS-Tregs

1. Erzeugen , um die Konstrukte in retrovirale Transduktion durch Subklonierung der OT-II TCR - Gene und FoxP3 in das Plasmid Midr ¹⁰ mit selbstspaltendes Peptid 2A verbunden verwendet werden , um die Midr-TCR & agr;-2A-TCR & bgr;-2A-FoxP3 - Konstrukt zu bilden.
2. Führen retroviraler Transduktion von ⁹ iPSCs Verwendung Plat E - Zellen als die Verpackungszelllinie.
3. Am Tag 0 seed OP9-DL1-DL4-IA ^b Zellen ata minimalen Dichte von 10 ⁴ Zellen / cm ² durch OP-9 - Medium (α-MEM - Medium , das 20% FCS und 2,2 g / l Natriumbicarbonat verwendet wird . Plate 1 x 10 ⁶ Zellen pro 10 cm - Schale.
4. Am Tag 3, wenn OP9-DL1-DL4-IA ^b - Zellen 80-90% konfluent werden, um die Medien zu entfernen und 0,5 Saatgut - 1 x 10 ⁵ iPSCs über OP9-DL1-DL4 - IA ^b Zellen in OP-9 Medien.
   HINWEIS: Damit ist die Co-Kultur von iPS - Zellen auf OP9-DL1-DL4-IA - ^B - Zellen und betrachtet ⁹ Tag 0 der Differenzierung zu sein.
5. Am Tag 5, entfernen Sie die Medien aus dem 10-cm-Schale durch Absaugen, waschen Sie die Zellen mit 10 ml 1x PBS, und die PBS absaugen. 4 ml 0,25% Trypsin und Inkubation für 10 min bei 37 ° C. Einen weiteren hinzufügen 8 ml iPSC Medien zu den Zellen, resuspendieren sie und Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
   1. Den Überstand aspirieren und wieder die Zellen in 10 ml iPSC Medien. Inkubieren diese resuspendierten Zellen auf einem frischen 10-cm-Schaleund zurück in den Inkubator für 30 min.
      HINWEIS: Entfernen Sie die OP9-DL1-DL4-IA ^b Feeder - Zellen und halten die Differenzierung iPSCs in den Medien schweben. 90% Konfluenz für weitere Co-Kultur - Pflegen Sie OP9-DL1-DL4-IA ^b Zellen kontinuierlich 80 zu erreichen.
   2. Nach 30 Minuten sammeln die schwebenden Zellen, filtern sie durch eine 70 um Zelle Sieb, und die Zellen mit einem Hämozytometer zählen.
6. Seed 5 x 10 ⁵ von iPS - Zellen in ein frisches 80 bis 90% konfluent von OP9-DL1-DL4-IA - ^B - Zellen in OP9 Medien. Ergänzen die Medien mit MFlt-3L in einer Endkonzentration von 5 ng / ml.
7. teilweise differenzierte iPS-Zellen Am Tag 8 sammeln, indem die Platte mit den Medien aus der Schale Waschen selbst eine 10 ml Pipette. Verwenden Sie weitere 5 ml OP-9 Medien in der Schale vorsichtig halb anhaftenden Zellen durch eine sorgfältige, kraftvoll Pipettieren zu waschen, um nicht die OP9 Monoschicht an der Unterseite der Schale zu brechen. Wiederholen Sie die Wäsche mit 10 ml PBS alle semi-Anzeige bis zur ErnteHerent differenzierenden Zellen.
   1. Kombinieren beide Wäschen Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei Raumtemperatur, resuspendieren in 10 ml OP9 enthaltenden Medien MFlt-3L (5 ng / ml) und mIL-7 (1 ng / ml) und filtriere durch einen 70 um Zell Sieb.
8. Übertragen Sie die Zellen in einer 6-Well - Kulturplatte , enthaltend 80-90% konfluent OP9-DL1-DL4-IA - ^B - Zellen, wie in Schritt 1.1. Transfer-Zellen aus einer 10 cm Schüssel in eine Vertiefung der 6-Well-Platte geerntet.
9. Am 10. Tag, ändern die Hälfte der Medien von Zellen an die frische OP9 Medien ergänzt mit MFlt-3L (5 ng / ml) und mIL-7 (1 ng / ml). Wiederholen Sie diesen Schritt alle zwei Tage.
10. Alle 4-6 Tage, je nach Wachstum, Wieder Saatgut die Differenzierung iPSCs auf Platten mit einer frischen Schicht aus OP9-DL1-DL4-IA - ^B - Zellen, wie in Schritt 1.1 beschrieben.

3. Bewertung der In - vitro - Treg Differenzierung und Reifung

1. Morphologische Veränderungen der Differenzierung iPSCs.
   1. MoNitor die Co-Kultur von iPS - Zellen mit OP9-DL1-DL4-IA ^b Zellen jeden Tag von lebenden Zellen unter einem herkömmlichen Hellfeldmikroskop (20x) zu beobachten. Am Tag 5, beachten Sie die Kolonien mit Mesoderm-ähnlichen Eigenschaften, wie abgeflachten Zellen. Am Tag 8, beobachten kleine, runde Cluster von Zellen, die differenzierenden Zellen repräsentieren.
   2. Verwenden Sie die Trypanblau-Methode, die Zellen zu zählen, um die Anzahl und den Prozentsatz der lebenden Zellen zu erkennen. Berechnen der Lebensfähigkeit der Zellen, wie die Anzahl der lebensfähigen durch die Gesamtzahl von Zellen innerhalb der vier Rastern auf dem Hämocytometer geteilten Zellen. Wenn Zellen Trypanblau nehmen, betrachten sie als tot oder nicht lebensfähig. Aufzeichnen der Anzahl der lebenden Zellen aus der Kultur geerntet.
2. Durchflusszytometrie-Analyse von iPS-Zellen zu unterscheiden.
   1. An den Tagen 5, 7, 11, 15, 19, 21, und 28 der Co-Kultur, zu entfernen, die Zellen mit 0,25% Trypsin, wie in Schritt 25.
   2. Vor der Oberflächenfärbung mit unterschiedlichen Fluorochrom konjugierte Antikörper, INCUBATe 1 x 10 ⁶ Zellen mit 100 ul 2.4G2 Fc - Blocker in PBS verdünnt (Endkonzentration 10 ug / ml) bei 4 ° C für 20 min , um die Bindung des Antikörpers an den Fc - Rezeptor auf der Zelloberfläche zu verhindern.
   3. An den Tagen 5, 7, 11, 15, 19, 21 und 28, verwendet werden 1 x 10 ⁶ Zellen für die Durchflusszytometrie mit unterschiedlichen Fluorochrom konjugierte Antikörper , die Zelloberflächenmarker zu detektieren, einschließlich CD3, TCR & bgr;, CD4, CD8, CD25, und CTLA4.
   4. Fc folgenden Block, wasche die Zellen mit 10 ml PBS und Flecken mit unterschiedlichen Fluorochrom-konjugierten Antikörpern für 20 Minuten bei 4 ° C, und dann mit der 15-Farben-Durchflusszytometer die durchflusszytometrische Analyse durchzuführen. Verwenden 0,200 & mgr; g Antikörper pro 10 ⁶ in 100 ul PBS verdünnt Zellen.
   5. Am Tag 28 analysiert die Zellen mittels Durchflusszytometrie ¹¹ und Gate auf CD4 ⁺ CD8 ⁺ Zellen unter Verwendung von CD4 und CD8 - Fluorochrom-konjugiertem Färbung; Analyse für die Expression von TCRVα2, TCRVβ5, CD25, CTLA-4 Und FoxP3 (Abbildung 1). Für FoxP3 - Färbung, um die Zellen zu beheben und permealize sie und dann Antikörper - Färbung ¹¹ durchführen.
3. In - vitro - Antigen - Stimulation von iPS - Zellen.
   1. Am Tag 28 der Co-Kultur, Ernte iPS-Tregs aus Kulturen durch die schwimmenden Zellen zu sammeln. Trypsinize den Rest der Zellen mit 0,25% Trypsin (wie in Schritt 2.5) und resuspendieren Medien, die Zellen in 8 ml iPSC. Zentrifuge für 5 Minuten bei 400 × g bei Raumtemperatur, aspirieren die Medien und die Zellen wieder in 10 ml Medium erneut zu suspendieren.
      1. Inkubieren der resuspendierten Zellen in eine neue 10 cm-Schale bei 37 ° C für 30 min und die schwimmenden Zellen zu sammeln. Waschen Sie die Zellen mit kaltem PBS.
   2. Inkubieren 3 x 10 ⁶ Splenozyten aus Milzen von C57BL / 6 Rag1 - / - Mäuse , die mit 5 uM Ovalbumin - Peptid in 200 ul Medium (OVA _323-339) bei 4 ° C für 30 min in einer 96 - Well - Platte ^11.
   3. Mix Tregs mit OVA _323-339 -pulsed Splenozyten in einem Verhältnis 1: 4 (Verwendung von 0,75 x 10 ⁶ Treg). Für 40 Stunden in einem CO ₂ -Inkubator bei 37 ° C inkubieren. In den letzten 4 Stunden, fügen Sie 4 ul verdünnt Brefeldin A in die Kultur (tatsächliche Konzentration 1,000x in 1x Kulturmedien verdünnt).
   4. Ernte Zellen mit 0,25% Trypsin (wie in Schritt 2.5), wasche mit 10% NaN ₃ und 0,5 M EDTA - Lösung (FACS - Puffer), Block mit 100 ul verdünnt (Endkonzentration 10 ug / ml) Fc blocker 2.4G2 und Flecken für den Oberflächenmarker CD4, CD8, TCRVα2 und TCRVβ5 wie in den Schritten 3.2.3-3.2.4.
   5. Befestigen Sie die Zellen mit einer 4% igen Paraformaldehydlösung in PBS und Permeabilisierung mit 100 ul 1x Permeabilisierung Puffer nach Zelloberflächenfärbung. Vorsicht! Paraformaldehyd ist allergen, krebserregend und giftig.
   6. Beflecken die Zellen mit einem Fluorochrom konjugierte TGF-β und IL-10 für 20 min im Dunkeln. Verwenden Sie 0.200 ug Antikörper / 10 ⁶ Zellen verded in 100 ul PBS. Erkennung die intrazelluläre Produktion von TGF-β und IL-10 mit der 15-Farben - Durchflusszytometer (Abbildung 2).
   7. Waschen Sie die Zellen dreimal mit kaltem FACS - Puffer vor der Durchflusszytometrie - Analyse ^11.
4. In - vivo - Persistenz von Ag-spezifischen iPS-Tregs.
   1. Nach 8 Tagen der Co-Kultur auf OP9-DL1-DL4-IA - ^B - Zellen, übertragen iPSC abgeleitetes vorge Treg (Thy1.2) , wie in Schritt 3.3.1 in Thy 1.1 kongenen Mäusen (4-6 Wochen alt) über einen Schwanzveneninjektion ohne Anästhesie. Vor der Schwanzveneninjektion durchführen, erweitern die Schwanzvene eine Infrarot-Lampe für 5 min mit. Nach Schwanzvene Dilatation, legen Sie die Maus in einem Verzögerer und adoptiv Transfer 3 x 10 ⁶ in 200 ul PBS - Zellen , indem sie durch die Schwanzvene injiziert wird .
   2. Sechs Wochen nach der Treg Übertragung euthanize Mäuse durch CO ₂ Erstickung durch zervikale Dislokation gefolgt. Stellen Sie sicher, dass die mice atmen nicht. Öffnen Sie die Bauchhöhle durch die Außenhaut des Peritoneum Schneiden mit einer Schere und Zange und ziehen Sie sie vorsichtig die innere Haut Auskleidung der Bauchhöhle freizulegen. Isolieren Sie die Milz und peripheren Lymphknoten injiziert Thy 1.1 congenic Mäuse.
   3. Sammle die Zellen aus der Milz und den Lymphknoten mechanisches Brechen unter Verwendung einer Einzelzellsuspension zu ergeben. Inkubieren der Zellen mit 5 ml ACK-Lysepuffer für 5 min bei RT roten Blutkörperchen zu lysieren. Sammeln und waschen restlichen Splenozyten oder Lymphozyten mit 10 ml kaltem FACS-Puffer.
   4. Nach dem Waschen, Behandlung von Zellen mit dem Fc-Blocker 2.4G2 bei 4 ° C für 20 min, wie in Schritt 3.2.2 und Fleck mit 100 ul verdünnt Fluorochrom-konjugiertem anti-Thy 1.2-Antikörpern.
   5. Wasche die Zellen mit 10 ml FACS - Puffer und gehen zytometrische Analyse ¹¹ zu fließen.

4. In vivo - Reifung und Unterdrückung von Autoimmun- Arthritis

1. Generieren Sie die Konstrukte wie in Schritt 2.1.
2. Führen retroviraler Transduktion ⁹ , wie in Schritt 2.2.
3. In vivo - Differenzierung und Arthritis - Induktion in Mäusen.
   1. Differenzieren OT-II TCR / FoxP3-transduzierten iPSCs (OT-II-FoxP3 / iPSCs) FoxP3-transduzierten iPSCs und DsRed transduziert iPSCs auf den OP9-DL1-DL4-IA ^b Stromazellen in der Gegenwart von Cytokinen MFlt-3L und 2.6 - mIL-7 für 8 Tage wie in den Schritten 2.1 beschrieben.
   2. Trypisinize alle drei Arten von Zellen von der 10 cm-Platte und resuspendieren Zellen aus jeder 10 cm-Platte in 10 ml frisches Medium. Fügen Sie die Zellen in ein frisches 10-cm-Platte und zurück zum Inkubator für 30 min. Nach 30 Minuten, sammle schwebenden Zellen.
   3. Pass-Zellen durch einen 70 & mgr; m Zellsieb zu Zellhaufen zu entfernen und zählen eine Zählkammer. Stellen Sie die Zellen in einer Konzentration von 1,5 x 10 ⁷ Zellen / ml in kaltem PBS und das Filter wieder , wenn nötig. Halten Sie Zellen auf Eis, bis adoptiven Zelltransfer in Mäuse.
   4. Injizieren 200 ul der Zellsuspension (3 × 10 ⁶ Zellen) in drei verschiedenen Gruppen von 4 bis 6 Wochen alte weibliche C57BL / 6 - Mäusen durch die Schwanzvene , wie in 3.4.1 beschrieben ,
   5. an der Basis des Schwanzes am 10. Tag nach der Zellübertragung, injizieren Mäuse mit 100 ug mBSA in komplettem Freundschem Adjuvans emulgiert, um eine 1 ml Spritze verwendet wird.
   6. Am Tag 17, betäuben Mäuse eine Isofluran Verdampfer mit (gemäß IACUC-Richtlinien). Nutzen Sie 4 - 5% Isofluran für die Induktion und 1 bis 2% für die Wartung. Induzieren Arthritis durch intra-artikuläre Injektion von 20 ug mBSA in 10 ul PBS in der linken Kniegelenk und von 20 ug und 100 ug mBSA ganzen OVA in 10 & mgr; l PBS in den rechten Kniegelenks. Speisen und ein gelpack auf der Bettwäsche Boden platziert werden, nachdem Arthritis entwickelt hat. Die Mäuse werden eingeschläfert: Body Condition Score (BCS) von 2/5 oder moribund, schwere Kachexie und / oder persistent recumbency (eine 24-Stunden-Zeitraum) und dem Schweregrad 4. Partitur4, Rötung und starke Schwellung umfassen den Knöchel, Fuß und Ziffern oder Ankylosen des Gliedes.
4. Die Charakterisierung der OT-II TCR / FoxP3-transduzierten iPS-Zellen.
   1. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop (20x) nicht fixierten Live - DsRed ⁺ GFP ⁺ Zellen sichtbar zu machen.
   2. Untersuchen Gen Integration und Expression sowohl von Western - Blot und Durchflusszytometrie ^11.
5. Treg Entwicklung und Reifung.
   1. Bei Wochen 2, 4 und 6 nach der Zellübertragung, einschläfern die Mäuse. Für Euthanasie, verwenden Sie in jedem Käfig 1 bis 2 L CO ₂ in der ersten Stufe. Sobald das Tier das Bewusstsein verloren hat, erhöhen die Durchflussrate von CO ₂ bis 4 - 5 l / min. Euthanize Mäuse durch CO ₂ Inhalation. Isolieren Sie die Milz und entleeren Sie die Lymphknoten durch die Außenhaut des Peritoneum Schneiden mit einer Schere und Zange und ziehen Sie sie vorsichtig die innere Haut Auskleidung der Bauchhöhle freizulegen.
   2. Sammeln Sie die Einzelzellsuspension fROM mit der Milz und Lymphknoten durch mechanische Panne eine Zelle Sieb mit und eine 1-ml-Spritze in 1% iPSC Medien. Zentrifugieren Sie die konische Röhrchen, die Medien bei 400 g für 5 min enthält. Resuspendieren des Zellpellets in 5 ml ACK-Lysepuffer roten Blutkörperchen zu lysieren. Re-Zentrifuge bei 1000 rpm für 5 min. Re-suspend das Zellpellet und waschen Sie die restlichen Splenozyten oder Lymphozyten mit kaltem FACS-Puffer. Führen Sie die Schritte 3.4.4 - 3.4.5 und fahren Sie mit durchflusszytometrische Analyse.
6. Intrazellulärer Färbung.
   1. Am Tag 50 nach der Herausforderung, isolieren die Milz und entleeren Sie die Lymphknoten der Mäuse (wie in Schritt 4.5.1) nach Euthanasie durch CO ₂ Inhalation durch Genickbruch folgte.
   2. Sammeln Sie die Einzelzellsuspension aus der Milz und Lymphknoten durch mechanische Panne eine Zelle Sieb und eine 1 ml Spritze. Inkubieren Sie die Splenozyten bei Raumtemperatur für 5 min mit 5 ml ACK-Lysepuffer roten Blutkörperchen zu lysieren. Sammeln Sie und waschen Sie die restlichen splenocytes oder Lymphozyten mit kaltem FACS-Puffer. Führen Sie die Schritte 3.2.3 - 3.2.4, aber Fleck mit Oberflächenmarker CD4, CD8, CD25 und TCRVβ5.
   3. Gehen Zellen für die intrazelluläre Färbung zu beheben , wie in 3.3.5 beschrieben - 3.3.7 und analysieren intrazellulären Zytokin - Produktion (TGF-β und IL-10) von iPS-derived Tregs und Tor auf Live - CD4 ⁺ CD25 ⁺ Zellen.
7. Einschleusung von Ag-spezifische Tregs in den Knien und die Unterdrückung von Arthritis.
   1. Im Anschluss an die Schritte (4.3 - 4.3.6) an den Tagen 7-14 post-Arthritis Induktion, einschläfern Mäuse durch CO ₂ Inhalation durch Genickbruch folgte (nach IACUC - Richtlinien). Entfernen Sie Haare von den Knien mit einem elektrischen Klipper und auszuschneiden die Knie durch chirurgischen Eingriff.
   2. Entfernen Sie die Haut von den Beinen durch einen Einschnitt in der Hinterbein mit stumpfem Ende Schere und schneiden Sie die Haut über den Oberschenkel und bis zum Knöchel. Ziehen Sie leicht die Haut über das Bein und Fuß, um die Muskeln zu belichten. Entfernender Muskel aus dem Bein vorsichtig, ohne das Kniegelenk zu beschädigen.
      1. Schneiden Sie das Hinterbein knapp über dem Becken / Hüftgelenk und schneiden Sie die Tibia mit scharfen Dissektionsscheren.
   3. Befestigen Sie die Knie in 4% Formalin für 48 Stunden. Entkalken Sie die Knie durch Verwendung von 2,5 M Ameisensäure; spülen dreimal in Xylol für 3 Minuten, spülen Sie zweimal in 100% Ethanol, spülen Sie zweimal in 95% Ethanol, spülen Sie zweimal in entionisiertem Wasser für 2 min und entkalken in 1 mM EDTA. Behandlung bei einer sub-Siedetemperatur (90 ° C) für 20 min.
   4. Kühle das fixierte Gewebe für 30 min. Spülen Sie es mit 1x PBS für 4 min und betten sie in Paraffin. Entwässern das Gewebe durch eine Reihe von Ethanol-Bad, das Wasser zu verdrängen und sie dann mit Wachs infiltrieren. Dann einbetten das infiltrierte Gewebe in Wachsblöcke. Führen Sie sowohl vertikale als auch horizontale Schnitte für die Färbung. Bereiten Sie 4 um Abschnitte mit einem Schlittenmikrotom.
   5. Führen Sie Immunfluoreszenzanfärbung auf den Abschnitten nach Standardverfahren der deparaffinisation und Rehydrierung mit Xylol und Ethanol ^12.
   6. Block endogene Peroxidase-Aktivität durch den Schieber in einer ausreichenden Menge von 3% ige Wasserstoffperoxidlösung eingetaucht wird für 3 min nach der Ag Retrieval. Block Folien für nicht-spezifische Bindung in 3% BSA in PBS bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer für 60 min.
   7. Fleckenabschnitte mit 200 ul Fluorochrom-konjugiertem TCRVβ5 Antikörper, verdünnt 1: 100 in der Blockierungslösung. Inkubieren für 2 Stunden bei Raumtemperatur in einem 75 bis 100% befeuchteten Kammer und wäscht 5 mal in 1x PBS für 5 min.
   8. Gegenfärbung der Folien für die Kernfärbung mit einem verblassungshemmenden Reagenz DAPI enthält. Hinzufügen, etwa 300 & mgr; l der verdünnten DAPI Färbungslösung (300 nM in 1x PBS) auf dem Deckglas, so dass sicher, dass gesamte Deckglas abgedeckt. Speichern der Objektträger im Dunkeln bei 4 ° C bis zur Analyse unter einem Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 3).
8. Arthritis Unterdrückung Assay
   1. Messen Sie die Schwellung beider Knie der Mäuse vor Arthritis-Induktion durch eine Dial-gauge Sattels mit einer Basislinie zu etablieren.
   2. Führen Sie die Schritte (4.3 - 4.3.6) für Arthritis-Induktion und Treg Übertragung. Messen Sie die Maus Knie mit einem Zifferblatt Spursattel post-Treg Übertragung.
   3. Berechnen Sie die prozentuale Zunahme im Knie Durchmesser: Prozent Zunahme = (Knie Durchmesser am Tag 1 - Knie Durchmesser am Tag 0) / Knie Durchmesser am Tag 0.
9. Die Messung der Gelenkzerstörung und entzündlichen Zellinfiltration in den Knien durch die Histologie (Abbildung 4).
   1. Am Tag 7 nach der Arthritisinduktion, euthanize die Mäuse wie oben beschrieben und die Knie durch chirurgischen Eingriff auszuschneiden. Siehe Schritt 4.7.1 - 4.7.2.
   2. Befestigen Sie die Knie in 4% Formalin, entkalken in EDTA und in Paraffin eingebettet werden. Siehe Schritt 4.7.3
   3. Entfernen Sie beide Knie, fix in 10% Formalin und verkalken in Formical-4. Einbetten das Gewebe in Paraffin, Schnitt bei 4 um, und Fleck mit hematoxylin und Eosin (H & E) oder Safranin-O-Färbung (wie in Schritt 4.7.7) und unter einem Mikroskop zu beobachten.
   4. Verwenden Sie H & E-Färbung Knochenerosion mit einem semi-quantitativen Scoring-System zu bewerten (0: keine Erosionen; 4: erweiterte Erosionen und die Zerstörung von Knochen). Verwenden Safranin-O-Färbung um den Verlust von Proteoglykanen zu bewerten und mit einer semi-quantitative Bewertungssystem score (0: kein Verlust von Proteoglykanen; 3: vollständiger Verlust der Färbung für Proteoglykane).
      1. Verwenden Sie ein semi-quantitativen Scoring-System zu entzündlichen Zellinfiltration auf H & E gefärbten Objektträger punkten (0: keine Zellinfiltration; 4: wimmelte Zellinfiltration). Bewerten Sie Noten durch beide Knie in einer verblindeten Weise zu untersuchen.

5. Messung der Knochenverlust in den Knien mit dem hochauflösenden Micro-Computertomographie (Mikro-CT) -System

1. Am Tag 10 nach der Arthritis Induktion, betäuben Mäuse mit 2% Isofluran und Vorbereitung für die Bildgebung.
2. Position mice mit den Knien nach oben in der Kammer gegenüber.
3. Verwenden , um eine hochauflösende Mikro-CT - System in vivo - Bildgebung des Knochenarchitektur um die Knie der Mäuse zu erwerben.
4. Führen Sie Mikro-CT-Scans mit einem 2,2 mm Länge, einschließlich Maus Kniegelenke mit den folgenden Parametern: 10,5 um Voxelgröße bei 55 kv, 145 & mgr; A 200 ms Integrationszeit, 211 Bilder.
5. Import Mikro-CT - Bilder und capture frontalen Ebene Bilder nach der weiteren Bildverarbeitung (Volume Rendering und Umwandlungs) (Abbildung 5).

Results

Wie hier gezeigt, am Tag 28, Ag-spezifischen Treg ausgedrückt wesentlichen CD3 und Ag-spezifischen TCR, zwei T-Zell-Marker. Die CD3 ⁺ TCRVβ5 ⁺ Bevölkerung ausgedrückt CD4. Die meisten der CD3 ⁺ TCRVβ5 ⁺ CD4 ⁺ Zellen auch CD25, CD127 exprimiert und CTLA-4, die in erhöhten Mengen exprimiert werden , typischerweise in natürlich T _regs (nTregs) und in T - Zellen exprimieren FoxP3 ektopisch auftritt. Foxp3 - Expression in iPSC ...

Discussion

In diesem Protokoll ist ein kritischer Schritt der in vitro Differenzierung von TCR / FoxP3 - Gen-Transduktion iPSCs. In vitro Notch - Signalweg induziert Entwicklung in Richtung der T - Zell - Abstammungslinie. Um iPSCs in CD4 ⁺ FoxP3 ⁺ Tregs unterscheiden, haben wir die OP9-DL1 / DL4 / IA ^b - Zellen, die hoch express MHC II (IA ^b) Moleküle. Die meisten der iPSCs differenzieren sich in CD4 ⁺ -Zellen. Doch nach der Oberfläche TCR-Expression, verlie...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6j Mäuse	Jackson Laboratory	664
B6.129S7 Rag1tm1Mom/J	Jackson Laboratory	2216
Anti-CD3 (2C11) Antikörper	BD Pharmingen	553058
Anti-CD28 (37.51) Antikörper	BD Pharmingen	553295
Anti-CD4 (GK1.5) Antikörper	Biolegend	100417
Anti-CD8 ( 53– 6.7) Antikörper	Biolegend	100714
Anti-CD25 (3C7) Antikörper	Biolegend	101912
Anti-TCR-β (H57597) Antikörper	Biolegend	109220
Anti-IL10	Biolegend	505010
Anti-TGFβ	Biolegend	141402
DMEM	Invitrogen	ABCD1234
α-MEM	Invitrogen	A10490-01
FBS	Hyclone	SH3007.01
Brefeldin A	Sigma	B7651
Polybrene	Sigma	107689
Genejammer	Integrierte Wissenschaft	204130
ACK Lysis Puffer	Lonza	10-548E
mFlt-3L	peprotech	250-31L
mIL-7	peprotech	217-17
Gelatine	Sigma	G9391
Paraformaldehyd	Sigma	P6148-500G	Vorsicht: Allergen, krebserregend, toxisch
Permeabilisierungspuffer	Biolegend
mBSA	Sigma	A7906
Eialbumin	Avantor	0440-01
CFA	Difco	2017014
Tailveiner Rückhaltesystem	Braintree scientific	RTV 150-STD