Ein Auftriebskörper-basierte Methode zur Bestimmung Fettwerte in<em&gt; Drosophila</em

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine Methode organismal Fettwerte im dritten Larvenstadium (L3) Larvenstadium von Drosophila melanogaster zu messen. Dieses Verfahren nutzt die vergleichsweise geringe Dichte von Fettgewebe zwischen Larven mit einer veränderten Fettspeicher zu unterscheiden. Buoyancy-basierte Analyse ist ein wertvolles Werkzeug für die schnelle, reproduzierbare und wirtschaftliche Screening.

Zusammenfassung

Drosophila melanogaster ist ein wichtiges experimentelles System in der Erforschung der Fettregulation. Es gibt derzeit zahlreiche Techniken, um den Gehalt an gespeichertem Fett in Drosophila zu messen, aber die meisten sind teuer und/oder mühsam und haben klare Grenzen. Hier stellen wir eine Methode vor, mit der der Fettgehalt von L3 Drosophila-Larven schnell und kostengünstig bestimmt werden kann. Die Technik beruht auf den Dichteunterschieden zwischen Fett- und Magergewebe und ermöglicht eine schnelle Erkennung von Fett- und Mager-Phänotypen. Wir haben die Genauigkeit dieser Methode durch Vergleich mit dem Körperfettanteil überprüft, der durch neutrale Lipidextraktion und Gaschromatographie in Verbindung mit Massenspektrometrie (GCMS) bestimmt wurde. Darüber hinaus skizzieren wir detaillierte Protokolle für die Sammlung und Synchronisation von Larven sowie relevante experimentelle Rezepturen. Die im Folgenden vorgestellte Technik überwindet die Hauptmängel der am weitesten verbreiteten Lipidquantifizierungsmethoden und bietet eine leistungsstarke Möglichkeit, L3-Larven schnell und empfindlich auf fettregulierende Phänotypen zu untersuchen, während die Integrität der Larven erhalten bleibt. Dieser Assay hat breite Anwendungen für die Untersuchung des Stoffwechsels und der Fettregulation mit Drosophila.

Einleitung

Drosophila melanogaster ist seit mehr als einem Jahrhundert in der Erforschung der Genetik und andere grundlegende biologische Fragen verwendet. In den letzten Jahrzehnten hat es klar geworden , dass Drosophila ein mächtiges Werkzeug in der Studie von vielen menschlichen Krankheiten. Da 70-80% der mit menschlichen Krankheiten assoziierten Gene haben ein identifizierter Fliegen ortholog ^{1. - 4.} stellt Drosophila ein vereinfachtes noch übersetzbar System , bei dem komplexe Krankheiten zu studieren. Der Stoffwechsel hat vor allem von einer solchen Studie profitiert. Nicht nur sind die Genetik der Stoffwechsel gut konserviert zwischen Fliegen und Menschen, aber die zuständigen Organe und Zelltypen sind auch sehr ähnlich ^2,5. Zum Beispiel kann die Fettkörper der Fliegen speichert beide Triacylglyceride (TAG) und Glykogen, die Funktionen analog zu denen in Säugetierleber und weißen Fettgewebe ⁶ durchgeführt. Mit Drosophila als Modell für menschliche Fettleibigkeit hat unser Verständnis von Lipid erheblich verbessertStoffwechsel und die Genetik der Adipositas ^7. Larvenentwicklungsstadium ist besonders nützlich für die Untersuchung der Segregation von Nährstoffen Lagerung oder Verwendung, wie sie zum Zuführen und die Speicherung von Energie widmet sich während Puparium-Bildung verwendet werden.

Derzeit gibt es viele verschiedene quantitative Methoden der Fettlagerebenen in Drosophila zu bestimmen. Die am weitesten verbreitete Methode ist die gekoppelte kolorimetrischen Assay (CCA) ^8,9. CCA wurde zur Bestimmung der TAG Niveaus in menschlichem Serum entwickelt und arbeitet auf der Prämisse, dass aus dem Rückgrat Triglyceriden freigesetzt Glycerin werden mehrere Reaktionen eingehen, letztlich in einer Redox-Reaktion gekoppelt ergeb ein gefärbtes Produkt erzeugen. Die Absorption bestimmter Wellenlängen des Lichts wird dann gemessen, um die anfängliche Menge an Glycerin vorhanden zu bestimmen. Jedoch Glycerin kann auch aus Mono- und Diacylglyceriden neben TAG freigesetzt werden und somit kann kein genaues Maß für s seinwachten Körperfett ^9. Außerdem Auge Pigment des zerquetschten erwachsenen Fliegen kann mit einigen Extinktionsablesungen stören und ^9,10 Ergebnisse erschweren. Daher muss CCA durch Dünnschichtchromatographie (TLC) begleitet und validiert werden, die für die Trennung der meisten Lipid Familien ermöglicht , die durch Densitometrie ^10,11 quantifiziert werden kann. Allerdings können einige Lipidklassen wie Sterole nicht analysiert werden und muss eine andere Art und Weise ¹² quantifiziert werden. Die Massenspektrometrie (MS) ist eine genaue Art und Weise alle Klassen der wichtigsten zellulären Lipiden ^12,13 quantitativ zu bestimmen. die Lipidextraktionsverfahren jedoch notwendig, die von MS zu analysieren sind sowohl zeitaufwendig (die meisten Einnahme fast einen ganzen Tag) und kostspielig. Hier präsentieren wir eine alternative Methode , um schnell und kostengünstig organismal Fettwerte in der L3 - Larven von Drosophila melanogaster bestimmen.

Das Verfahren stellt sich wie folgt nutzt die Differenz in der Dichte zwischen Fettgewebe und magerem Gewebe. Mammalian fat Gewebe hat eine Dichte von etwa 0,9 g / ml ¹⁴ während der Skelettmuskulatur als einer Dichte von 1,06 g / ml ^15. Dieser Unterschied bedeutet, dass Tiere mit höheren Vorräte an Fett geringere Dichte als Tiere mit geringeren Speicher des Fettes haben, die es ihnen ermöglichen besser fester Dichte in einer Lösung zu schweben. Diese Eigenschaft ermöglicht eine extrem schnelle Screening einer großen Anzahl von Tieren, während sowohl kostengünstige und nicht-invasive sind. Buoyancy-basierte Analyse wurde sowohl die Phänotypen der Änderung bekannten Regulatoren der Fettwerte sowie zu identifizieren , neue genetische und neurologische Regulatoren der Fettleibigkeit ^16,17 zur Bestätigung verwendet.

Protokoll

1. Sammeln Eier aus Flies mit Genotypen von Interesse

HINWEIS: Ideal Kreuze bestehen aus 150 virgin Fliegen und mindestens 75 Männer. Auf Sammlungen sollten mindestens 200 Fliegen bestehen.

1. Bereiten Sie Traubenplatten.
   1. Hinzufügen 37,5 g Agar 1,5 L destilliertem Wasser in einem 4 l-Kolben.
   2. Autoklav Wasser / Agar Mix für 50 min bei 121 ° C (250 ° F).
   3. Während Wasser / Agar Mix Autoklavierung ist, in den 500 ml Traubensaft 50 g Saccharose und rühren mit einem Rührstab auf einem beheizten Rührplatte bis Saccharose gelöst ist.
   4. Schalten Sie die Hitze und weiterhin Rühren der Traubensaft / Saccharose-Mischung auf unter 70 ° C abkühlen lassen. Testen Sie die Innentemperatur mit einem Alkohol-Thermometer.
   5. In 3 g Drosophila Anti-Pilz - Mittel (zB Tegosept) Traubensaft / Saccharose - Mischung zu erwärmen und rühren zu lösen.
   6. Wenn Wasser / agar Mischung aus dem Autoklaven ist, kann der Kolben durch Verwirbelung gelegentlich zur Berührung zu kühlen.
   7. Wasser / Agargemisch und Traubensaft / Saccharose-Mischung und rühren, bis alles gut vermischt Kombinieren.
   8. Verwenden Sie eine serologische Pipette 8 hinzufügen - 10 ml der Traubenmischung auf den Deckel einer kleinen Petrischale (35 x 10 mm-Stil). Die Mischung höher Krone als die Höhe der Deckelwände eine konvexe Form zu bilden.
   9. Lassen Sie Trauben Platten für 2 Stunden bei Raumtemperatur abkühlen lassen und dann lagern in einem luftdichten Behälter bei 4 ºC.
2. Bereiten Sie Hefe-Paste.
   1. 6 ml Phosphatpufferlösung (PBS) bis 4 g Lebend aktiven Trockenhefe in einem 50 ml konischen Röhrchen und Mischen mit einem Spatel bis glatt.
   2. Shop Hefe Paste bei 4 ºC.
3. Fügen Sie eine kleine Portion (etwa 1/8 tsp) von Hefe-Paste in die Mitte einer Traube Platte. Glätten alle Ecken und Kanten mit einem Spatel.
4. Platzieren grape Platten in einem Inkubator, bis sie Umgebungstemperatur erreicht haben.
5. Übertragen Sie fliegt von Interesse in einem Eiersammelraum und Platz Trauben Platte with Hefe-Paste auf der Oberseite nach innen zeigen. Bandtraubenplatte an der Eiersammelkammer zu vermeiden, die Platte zu lassen herausfallen. Stellen Sie sicher, wichtige Genotyp und aktuelle Informationen auf der Unterseite der Traube Platte zu schreiben.
6. Upend die Eiersammelkammer die Fliegen zu legen ihre Eier auf der Wein Platte zu ermöglichen.
7. Legen Sie eine Box oder decken die Eiersammlung Kammern um und legen Sie sie in einem Inkubator bei 25 ° C.
8. Lassen Sie Fliegen Eier zu legen für 4 - 6 Stunden.
9. End-Kollektion von der Trauben Platte aus dem Ei Sammelkammer zu nehmen und die Fliegen wieder in ihre Flasche Lebensmittel übertragen. Verwenden Sie einen Spachtel überschüssige Hefe-Paste aus der Traube Platte abzuwischen. Store grape Platte in einem größeren Petrischale in einem befeuchteten Inkubator bei 25 ºC für ca. 24 Std.

2. Transfer Larvae zu Experimental Lebensmittel

1. Bereiten Sie experimentelle Nahrung.
   HINWEIS: Diese Lebensmittel Rezept basiert auf der Mitte Rezept Bloomington Lager ^18. Wichtige Änderungenwie beurteilt umfassen Menge an Hefe erhöht den Nährwert der Lebensmittel zu optimieren, indem Timing des Wanderns Stufe (zwischen 112-120 Stunden nach der Eizellenentnahme bei 25 ° C). Während wir dieses Rezept ideal für die Gesundheit und die Entwicklung unserer experimentellen Larven gefunden haben, ist ein Lebensmittel Rezept akzeptabel gegeben Kalibrierung mit positiven und negativen Kontrollen, von denen Beispiele in Schritt 3.10 aufgeführt sind.
   1. Messen 1600 ml destilliertem Wasser.
   2. Mischungs 134 g Maismehl, 10,6 g Agar Drosophila Typ II, und ein Teil des Wassers (~ 500 ml) in einem 1 l Becherglas. Mischung für 2 min mit einem motorisierten Handmixer.
   3. Mischen Sie 70 g Lebend Trockenhefe, 18,4 g Sojamehl, 84,8 g Malzextrakt, und ein Teil des Wassers (~ 500 ml) in einem anderen 1-Liter-Becher. Mischung für 2 min mit einem motorisierten Handmixer.
   4. Swirl jeden Becher und gießen Sie in einem 4-Liter-Kolben. Verwenden Sie das restliche Wasser, um die Becher ausspülen und fügen Sie in den Kolben.
   5. Messen Sie 140 ml Licht Maissirup und in den Kolben gegeben, mischen durch Schwenken.
   6. Autoklav für 50 min bei 121 ºC (250 ºF) in der flüssigen Umgebung.
   7. Nach dem Autoklavieren gießen Lebensmittel in einen 4-Liter-Becher und abkühlen lassen. Helfen Sie den Kühlprozess, indem sie mit einem motorisierten Handmixer gemischt werden.
   8. Sobald der Kolben zu berühren abgekühlt genug, fügen Sie 8,8 ml Propionsäure und 16,8 ml Drosophila Anti-Pilz - Mittel / Ethanol - Lösung. Gut mischen. (Make Drosophila Anti-Pilz - Mittel - Lösung durch Zugabe von 380 g Drosophila Anti-Pilz - Mittel auf 1 L 200 Proof Ethanol und Rühren auf einer warmen Platte , bis sie gelöst, so dass sicher , dass die Lösung nicht mehr als 70 ° C nicht überschreitet.)
   9. Gießen Sie Lebensmittel in Fläschchen, bis das Essen etwa 1 Zoll tief ist und erlauben für 2 bei RT abkühlen - 3 Stunden. Stecken Fläschchen und lagern in einem Inkubator bei 25 ° C. Verwenden Sie innerhalb einer Woche.
2. Tauchen Sie ein Spatel mehrmals in die obere Schicht des Fläschchens von Lebensmitteln es zu punkten. Dies wird dazu beitragen, die Larven zu wühlen und füttern.
3. 22 bis 24 Stunden nach der Eiersammlung hatended mit einem kleinen Pinsel 50 erste Larvenstadium (L1) Larven der gleichen ungefähren Größe zu sammeln. Legen Larven in der experimentellen Nahrung. Reinigen Sie den Pinsel auf einem Labortuch und sicherzustellen, dass es keine restlichen Larven auf dem Pinsel, bevor zu einem anderen Genotyp weiter.
4. Legen Fläschchen Larven in einem Inkubator bei 25 ° C und erlauben zu entwickeln.

3. Bestimmen Fettwerte in Larvae

1. Bereiten Sie Lösungen.
   1. Bereiten Sie 1 L 10x PBS Lager.
      1. Hinzufügen , 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na ₂ HPO ₄ und 2,4 g KH ₂ PO _{4 bis 800} ml Wasser in einem 2 l Becherglas einen Rührstab enthält. Rühren Sie ohne Hitze, bis alle Salze eingeschlossen sind. Bringen pH auf 7,4. Erhöhen Sie Volumen auf 1 l mit Wasser.
   2. Bereiten Sie 2 L 1x PBS. In 200 ml 10x PBS-Stammlösung zu 1800 ml Wasser.
   3. Verwenden Sie diese Lager von 1x PBS 20% w / v Saccharose zu machen.
2. Entfernen Sie die Fläschchen von Larven aus derInkubator einmal gibt es von 20 bis 40 Larven die Seiten des Fläschchens wandern nach oben (in der Regel am fünften Tag nach dem Ei Sammlungen). Notieren Sie Datum und Uhrzeit des Tests sowie die Anzahl der Larven wandern.
3. Bereiten experimentelle Lösung durch Zugabe von 11,5 ml PBS und 9 ml 20% Saccharose zu einem 50 ml konischen Röhrchen.
4. In 20% Saccharose in das Fläschchen, bis sie 0,5 - 1 Zoll von der Spitze des Fläschchens.
5. Verwenden Sie einen Spachtel, um sanft die oberste Schicht der Nahrung frei Larven schüren, die noch in der Nahrung wühlen. Alle Larven werden auf die Oberfläche der Saccharoselösung ansteigen.
6. Verwenden einer Pinzette vorsichtig auf die Larven in die Ausgangssaccharosekonzentration von Schritt 3.3 übertragen.
7. Verwenden Sie einen Spachtel vorsichtig auf die Larven in dieser Lösung rühren.
8. Verschließen Sie die konischen Röhrchen und den Kopf stellen mehrmals gründlich die Lösung mischen.
9. Die Kappe des konischen Rohrs und wirbeln eine sanfte Wirbel zu erzeugen.
10. Lassen Sie die Larven zu regeln, entweder schwimmend an die Spitze der Lösung oder sinking nach unten. Warten Sie 2 bis 5 min für Larven zu begleichen.
    HINWEIS: Wenn es noch Larven sind, die nicht auf jeden Fall entweder oder sinkende schwimmend, eine Linie wählen als Cutoff-Punkt zu verwenden, um die Larven entweder als Floater oder einem Platinen zu beschriften. Wenden Sie dieses gleiche Kriterium für alle Genotypen. Wir verwenden den Winkel an der Unterseite des konischen Rohrs als unsere Grenze. Adp oder sir2 ¹⁷ mutant Larven kann als positive Kontrolle und LSD2 ¹⁹ Mutanten als negative Kontrolle für die Kalibrierung des Assays verwendet werden , werden verwendet werden.
11. Notieren Sie die Anzahl der schwimmenden Larven und die spezifische Konzentration getestet.
12. 1 ml 20% Saccharose in die Versuchslösung ihre Dichte zu erhöhen.
13. Wiederholen Sie die Schritte 3,7-3,10. Notieren Sie die Anzahl der schwimmenden Larven und diese neue Konzentration.
14. Weiterhin Schritten 3.12 und 3.13 bis mindestens 95% der Larven schwimmen.
15. Verwenden einer Pinzette alle Larven in eine Dissektion Schale mit PBS gefüllt zu sammeln.
16. Observe Larven unter dem Mikroskop und zur Kenntnis, wenn es irgendwelche kleinen Larven, Pre-Puppen, Puppen oder andere Unterschiede zwischen den Genotypen.
    HINWEIS: Im Idealfall alle Larven sollte homogen und in der gleichen Entwicklungsstufe erscheinen. Wir haben nur konsequent Fettmessungen unter diesen Bedingungen beobachtet.
17. Notieren Sie sich die Gesamtzahl der Larven.
18. Mit einer Pinzette, übertragen 10 Larven in ein Labor wischen, um zu trocknen. Beschriften Sie eine Mikrozentrifugenröhrchen und legen 10 Larven in die Röhre.
19. Blitzeis die Larven in flüssigem Stickstoff. Lagern Sie die Röhrchen bei -20 ºC.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt ein Beispiel dafür , wie die Auftriebsbasierten Assay erkennen kann sowohl höhere als auch niedrigere Fettreserven in genetisch manipulierten Larven. 1A zeigt , daß bei Anregung oder Silencing einer bestimmten Untergruppe von Neuronen (E347) im Larven Gehirn induziert niedrigere und höhere Fett Geschäfte sind. Die gleichen genetischen Hintergrund - Kontrolle wurde in beiden Fällen verwendet. 1B zeigt ein Beispiel dafür ...

Diskussion

Es gibt eine Vielzahl von Techniken , die entwickelt wurden Lipidspiegel ⁸ zu messen ^{- 10.} Allerdings kommt jedes dieser Verfahren einige wesentliche Nachteile, die durch den Auftrieb basierenden Assay oben umrissenen adressiert sind. Erstens ist dieser Test sehr schnell. eine vollständige Konzentrationsgradienten Prüfung dauert nicht länger als 30 - 60 min. Dies ist eine große Verbesserung gegenüber den meisten der Techniken, die derzeit im Einsatz. Zum Beispiel Lipid-Quantifizierung vo...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Bacto Agar	VWR	214030
Welch's Original 100% Traubensaft
Saccharose	Fisher	S512
Tegosept	Genesee Scientific	20-259
Ethanol			200 Proof
Backhefe	Fleichmann's
Yellow Maismehl	Quaker		Angereicherte entkeimte
Drosophila-Agar Typ II	Apex	66-104
Sojamehl	ADM Spezialzutaten	062-100
Malzextrakt	Breiss	5748
Heller Maissirup	Karo
Propionsäure	VWR	U330-09
Natriumchlorid	Fisher	50147491
Kaliumphosphat monobasisch	Sigma	P5655-100G
Natriumphosphat wasserfrei	Fisher	S3933
Kaliumchlorid	Fisher	P330-500
35 x 10 mm Petriplatte	Fisher	08-757-100A
50 ml konisch	Fisher	50-869-569