Method Article

Ein optimiertes Protokoll für die effiziente radioaktive Markierung von Gold-Nanopartikeln durch eine Verwendung von 125 I-markiertem Azide prosthetische Gruppe

DOI:

10.3791/54759

⸱

October 10th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute, 2Department of Radiation Biotechnology and Applied Radioisotope Science, University of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein detailliertes Verfahren für die Synthese eines 125 I-markierten Azid und die radioaktiven Markierung von dibenzocyclooctyne (DBCO) -Gruppe-konjugierten, 13 nm große Goldnanopartikel einen kupferfreien Klick - Reaktion beschrieben.

Abstract

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Hier demonstrieren wir ein detailliertes Protokoll für die Radiosynthese einer 125I-markierten Azid-Prothesengruppe und deren Anwendung auf die effiziente Radiomarkierung von DBCO-Gruppen-funktionalisierten Goldnanopartikeln mittels einer kupferfreien Klickreaktion. Die Radiojodierung des stannylierten Vorläufers (2) erfolgte unter Verwendung von [125I]NaI und Chloramin T als Oxidationsmittel bei Raumtemperatur für 15 min. Nach der HPLC-Aufreinigung des Rohprodukts wurde das gereinigte 125I-markierte Azid (1) mit hoher radiochemischer Ausbeute (75 ± 10 %, n = 8) und ausgezeichneter radiochemischer Reinheit (>99 %) erhalten. Für die Synthese von radioaktiv markierten Goldnanopartikeln mit einer Größe von 13 nm wurden die DBCO-funktionalisierten Goldnanopartikel (3) unter Verwendung eines thiolierten Polyethylenglykolpolymers hergestellt. Eine kupferfreie Klickreaktion zwischen 1 und 3 ergab die 125I-markierten Goldnanopartikel (4) mit mehr als 95% der radiochemischen Ausbeute, die durch Radio-Dünnschichtchromatographie (Radio-TLC) bestimmt wurde. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass die vorliegende Radiomarkierungsmethode mit einer stammgeförderten kupferfreien Klickreaktion für die effiziente und komfortable Radiomarkierung von DBCO-Gruppen-haltigen Nanomaterialien nützlich sein wird.

Introduction

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Die stammgeförderte kupferfreie Klickreaktion zwischen Aziden und Cyclooctinen wurde ausgiebig zur effizienten bioorthogonalen Markierung einer Vielzahl von Biomolekülen, Nanomaterialien und lebenden Probanden1-7 angewendet. Aufgrund der hervorragenden Ortsspezifität und der schnellen Reaktionsgeschwindigkeit dieser Konjugationsreaktion wurde sie auch zur Synthese von radioaktiv markierten Tracern verwendet. Einige 18F-markierte Azid- oder DBCO-Prothesengruppen wurden für die In-vitro-Markierung verschiedener Krebsarten, die auf Peptide und Antikörper abzielen, sowie für die in vivo vorgezielte Bildgebung von Tumoren8-13 hergestellt. Zusätzlich zu diesen Beispielen wurde die gleiche Konjugationsreaktion auf die Metall-Radioisotopen-Markierung von Nanomaterialien für bildgebende Untersuchungen der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) angewendet14-16.

Seit mehreren Jahrzehnten werden radioaktive Jode für die biomedizinische Forschung und klinische Studien durch PET-Bildgebung (124I), Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie (SPECT) (123I, 125I) und Schilddrüsenkrebsbehandlung (131I)17-21 verwendet. Daher ist eine effiziente Methode zur Markierung von radioaktivem Jod von grundlegender Bedeutung für verschiedene Untersuchungen, einschließlich molekularer Bildgebungsstudien, der Analyse der Organverteilung von Biomolekülen, der Identifizierung von Biomarkern und der Arzneimittelentwicklung. Eine kupferfreie Click-Reaktionsstrategie könnte bei der Markierung von radioaktivem Jod eingesetzt werden. Diese Anwendung wurde jedoch noch nicht so umfassend untersucht wie die der 18F-markierten Biomoleküle22-23. Hier werden wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Synthese eines 125I-markierten Azids für die radioaktive Markierung von DBCO-Gruppen-abgeleiteten Molekülen bereitstellen. Die Verfahren in diesem Bericht umfassen die Radiojodierung des stannylierten Vorläufers, Reinigungsschritte mit HPLC und die Festphasenextraktion. Wir demonstrieren auch die effiziente Radiomarkierung von DBCO-Gruppen-modifizierten 13-nm-großen Goldnanopartikeln unter Verwendung des 125I-markierten Azids. Das detaillierte Protokoll in diesem Bericht wird synthetischen Chemikern helfen, eine neue Radiomarkierungsmethode für die Synthese von radioaktiv markierten Produkten zu verstehen.

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Protocol

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Achtung: Die oxidierte Form von radioaktivem Jod ist sehr volatil und mit ausreichenden Bleiabschirmungen und Blei Fläschchen behandelt werden. Alle radiochemischen Schritte sollten in einem gut belüfteten Holzkohle gefiltert Haube, und die experimentellen Verfahren müssen durchgeführt werden, durch Radioaktivität Detektionsgeräten überwacht werden.

1. Herstellung von Chemikalien und der Umkehrphasen - Patrone für die Synthese der 125 I-markiertem Azide

  1. Vorbereitung der Reagenzien in Lösung
    1. Man löst 1 mg des Azids Vorläufers (2) in 150 ul absolutem Ethanol (Abbildung 1).
      HINWEIS: Eine detaillierte Syntheseverfahren für die Azid - Vorläufers (2) wurde in der vorherigen Papier 22 ausgewiesen.
    2. Man löst 1 mg Chloramin T in 20 ul 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH = 7,4).
    3. Man löst 2 mg Natriummetabisulfit in 20 & mgr; l H 2 O.
  2. preparation der Patrone
    1. Waschen Sie die TC18 - Kartusche mit 10 ml absolutem Ethanol , gefolgt von 10 ml H 2 O Trocknen Sie nicht die Matrix der Patrone mit Luft.

2. Radiosynthese des 125 I-markierten prosthetischen Gruppe Azid

  1. Radioiodierung Reaktion des Vorläufers
    1. Fügen Sie die Azid-Vorläufer-Lösung (1 mg in 150 ul absolutem Ethanol) und Essigsäure (10 ul) in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    2. Mit 150 MBq [125 I] NaI in 0,1 M NaOH (50 ul) zu dem Reaktionsgemisch.
    3. Fügen Sie eine Chloramin T-Lösung (1 mg in 20 ul 1x Phosphatpuffer-Salzlösung) und schließen Sie das Mikroröhrchen, das Reaktionsgemisch.
    4. Inkubieren der Reaktionsmischung bei Raumtemperatur für 15 min, bis die Radioiodierung Reaktion abgeschlossen ist.
    5. Fügen eine Natriummetabisulfit - Lösung (2 mg in 20 & mgr; l H 2 O) zu der Reaktionsmischungdie Radioiodierung Reaktion zu quenchen.
    6. Zurückzuziehen 0,2 & mgr; l des Rohproduktes und dann verdünnt mit 100 & mgr; l der Lösung (H 2 O / CH 3 CN, 1: 1) für die HPLC - Analyse.
      HINWEIS: Für alle HPLC - Experimente verwenden 0,1% Ameisensäure H 2 O (Lösungsmittel A) enthält , und 0,1% Ameisensäure enthält , Acetonitril (Lösungsmittel B) als Eluierungsmittel.
    7. Analysieren Sie den verdünnten Rohprodukt durch eine Umkehrphasen-analytische Radio-HPLC unter Verwendung von (C18-Umkehrphasensäule; Fließgeschwindigkeit: 1 ml / min; Eluent Gradient: 20% Lösungsmittel B für 0-2 min, 20-80% Lösungsmittel B 2-22 min, 80-100% Lösungsmittel B für 22-23 min und 100% Lösungsmittel B für 23-28 min; Retentionszeit: 16,4 min) (Abbildung 2).
  2. Reinigung des Rohprodukts mit einer präparativen HPLC
    HINWEIS: Für ausreichend Blei Abschirmung um HPLC Teile wie den Injektor, Säule, Detektor, Sammelfläschchen und der Behälter, in dem das Abwasser aufgefangen wird.
    1. Ziehen Sie the gesamte Reaktionsgemisch in eine HPLC-Phiole. Spülen Sie das Reaktionsrohr mit Acetonitril (0,5 ml) und die Spülung in die gleiche Injektionsvial hinzuzufügen. Man verdünnt das gesammelte Lösung mit H 2 O (1 ml).
    2. Spritzen Sie das Rohprodukt auf eine präparative HPLC-Radio (C18-Umkehrphasensäule; Fließgeschwindigkeit: 10 ml / min; Eluent Gradient: 20% Lösungsmittel B für 0-2 min, 20-80% Lösungsmittel B für 2-22 min, 80-100% Lösungsmittel B für 22-23 min und 100% Lösungsmittel B für 23-28 min).
    3. Sammeln Sie die radioaktiven Peak , die die 125 I-markiertem Azid (1) (t R unter diesen HPLC - Bedingungen ist 17,8 bis 18,8 min) in ein Glasteströhrchen (Abbildung 2).
    4. Messen Sie die radiochemische Ausbeute der Fraktion mit einer Radioaktivität Dosiskalibrator Verwendung gemäß dem Protokoll des Herstellers.
    5. Injizieren des gereinigten Produkts auf eine analytische HPLC-Radio unter Verwendung der gleichen HPLC-Bedingungen für die radiochemische Reinheit des Produkts zu bestimmen.
  3. Festphasenextraktion des Produkts
    1. Verdünne die Fraktion mit dem gewünschten Produkt (1) mit 40 ml reinem H 2 O.
    2. Fügen Sie die verdünnte Lösung in eine vorkonditionierte TC18 Patrone.
    3. Die Kartusche wird mit einem zusätzlichen 15 ml H 2 O.
    4. Eluieren des Produkts (1) eingefangen in der Kartusche mit 2 ml Aceton in einen 10-ml - Glasampulle , die durch eine Bleiabschirmung geschützt. Messen der Radioaktivität der eluierten Produkt eine Radioaktivität Dosiskalibrator Verwendung gemäß dem Protokoll des Herstellers.
      HINWEIS: Dimethylsulfoxid (DMSO) oder absolutem Ethanol kann auch zur Elution des Produkts aus der Patrone verwendet werden. Etwa 5-10% der Radioaktivität klebt normalerweise an der Patrone und der verbleibende radioaktiv markierte Produkt kann nicht vollständig durch die Verwendung von überschüssigen Mengen an organischen Lösungsmittel eluiert werden.
    5. Man dampft das Aceton mit einem Strom von Stickstoff oder Argongas.
    6. Man löst die Wiedersidue mit DMSO (100-200 ul) für den nächsten Schritt der radioaktiven Markierung.

3. Synthese von DBCO-Gruppe konjugierte Goldnanopartikel

  1. Die Oberflächenmodifikation von 13 nm großen Goldnanopartikeln mit DBCO-Gruppen enthaltenden Polyethylenglykol
    1. Bereiten Natrium-Citrat-stabilisierten Goldnanopartikel (3) (durchschnittliche Größe = 13 nm) nach einem früheren Bericht 24.
    2. Hinzufügen einer wässrigen Lösung von Tween 20 (1 mM, 1,5 ml) zu den Citrat stabilisiertem Goldnanopartikel (10 nM, 15 ml). Schütteln Sie die Lösung für 20 Minuten auf einem Orbitalschüttler.
    3. Hinzufügen, um eine wässrige Lösung von DBCO gruppenhaltigen Polyethylenglykol-thiol (durchschnittliches Molekulargewicht = 5.000, 100 uM, 1,5 ml). Schütteln Sie die Lösung für 2 Stunden auf einem Schüttler.
  2. Reinigung der Goldnanopartikel DBCO gruppenmodifizierte
    1. Reinige die DBCO-Gruppe-modifizierten Goldnanopartikeln (4) </ Strong> durch aufeinanderfolgende Zentrifugation (11.400 · g, 15 min x 3).
    2. Den Überstand abgießen und fügen Sie reines Wasser für Aufwirbelung der Gold-Nanopartikel-Pellets.

4. Die radioaktive Markierung von DBCO-group-modifizierten Goldnanopartikeln über die Kupferfreie Klick-Reaktion

  1. Synthese von 125 I-markiertem Goldnanopartikel mit dem 125 I-markiertes Azid (1)
    1. Bereiten Sie eine konzentrierte Lösung von DBCO-group-modifizierten Goldnanopartikeln durch Zentrifugation (11.400 · g, 15 min), und stellen Sie die Konzentration der Goldnanopartikel zu 2 uM.
    2. Hinzufügen 4,1 MBq des 125 I-markiertem Azid (1) in DMSO (5 & mgr; l) wurde zu einer Suspension von Goldnanopartikeln (4) (2 & mgr; M, 50 & mgr; l).
    3. Inkubieren der resultierenden Reaktionsmischung bei 40 ° C für 60 min.
    4. Ziehen Sie eine aliquote Menge (0,2 ul) aus dem Rohprodukt und wenden sie auf eine Silica-coATED Dünnschichtchromatographie (TLC) Platte.
    5. Entwickeln Sie die DC-Platte unter Verwendung von Ethylacetat als mobile Phase.
    6. Legen Sie die DC - Platte auf einem Radio-TLC - Scanner und führen Sie den Scanner die Radiomarkierungsreaktion (Abbildung 3) nach dem Protokoll des Herstellers zu überwachen.
  2. Die Reinigung des Rohproduktes
    1. Reinige das Reaktionsgemisch die 125 I-markierten Goldnanopartikel (4) durch Zentrifugation (11.400 xg, 15 min) enthielt.
    2. Den Überstand abgießen und fügen Sie reines Wasser für Aufwirbelung der Gold-Nanopartikel-Pellets.
    3. Ziehen Sie eine aliquote Menge (0,2 ul) aus dem gereinigten Produkt und wenden sie auf eine Silica-beschichteten TLC-Platte.
    4. Entwickeln Sie die DC-Platte unter Verwendung von Ethylacetat als mobile Phase.
    5. Legen Sie die DC - Platte auf einem Radio-TLC - Scanner und führen Sie den Scanner die radiochemische Ausbeute und radiochemische Reinheit des 125 I-markierten gol zu bestimmend Nanopartikel (4) (Figur 3) nach dem Protokoll des Herstellers.

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Results

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Die Radioiodierung Reaktion des stannylierten Vorläufers (2) wurde unter Verwendung von 150 MBq [125 I] NaI, Essigsäure und Chloramin - T bei Raumtemperatur für 15 min das radiomarkierte Produkt bereitzustellen (1). Nach präparativer HPLC-Reinigung des rohen Gemisches wurde das gewünschte Produkt mit 75 ± 10% (n = 8) von radiochemischer Ausbeute. Analytische HPLC zeigte , dass die radiochemische Reinheit des 125 I-markierte Produkt ...

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Discussion

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Im allgemeinen ist die beobachtete radiochemischer Ausbeute des gereinigten 125 I-markiertem Azid (1) betrug 75 ± 10% (n = 8). Die radioaktiven Markierung wurde mit 50-150 MBq Radioaktivität durchgeführt, und die radiochemische Ergebnisse sind recht konsistent. Wenn [125 I] Nal (t 1/2 = 59,4 d) , die den radioaktiven Zerfall seit mehr als einem Monat unterzog sich in der Radioiodierungsverfahren Reaktion verwendet wird , wurde die radiochemische Ausbeute von

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Research Foundation of Korea unterstützt, die von der Regierung der Republik Korea finanziert wurden (Fördernummern 2012M2B2B1055245 und 2012M2A2A6011335) und vom RI-Biomics Center des Korea Atomic Energy Research Institute.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Chloramin-T-TrihydratSigma402869
[125I]NaI in aq. NaOHPerkin-ElmerNEZ033A010MC
Natriummetabisulfit SigmaS9000
AmeisensäureSigma251364
Sep-Pak tC18 plus KartuscheWasserWAT036800
Dimethylsulfoxid SigmaD2650
AcetonSigma650501
EthanolSigma459844
Gold(III)-chlorid-TrihydratSigma520918
Tween 20 SigmaP1379
DBCO PEG SH (MW 5.000)NANOCSPG2-DBTH-5k
DC-Kieselgel 60 F254Merck
Analytische HPLCAgilent1290 InfinityModellnummer
Präparative HPLCAgilent1260 InfinityModellnummer
Analytische C18 UmkehrphasensäuleAgilentZorbax Eclipse XDB-C18
Präparative C18 UmkehrphasensäuleAgilentPrepHT XDB-C18
Radio TLC ScannerBioscanAR-2000Modellnummer
RadioisotopendosiskalibratorCapintec, IncCRC -25R DosiskalibratorModellnummer

References

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