Diese Arbeit beschreibt einen fortgeschrittenen Arbeitsablauf zur genauen und schnellen Bestimmung der NK-Zellzahl (Natural Killer) und der Zytotoxizität von NK-Zellen in menschlichen Blutproben.
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Methodenartikel
Durchflusszytometrische Analyse von natürlichen Killerzellen lytische Aktivität in menschlichem Vollblut
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
NK-Zell-Cytotoxizität ist eine weit verbreitete Maßnahme, um die Wirkung der Intervention von außen auf NK-Zell-Funktion zu bestimmen. Jedoch kann die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des Assays instabil betrachtet werden, entweder weil der Benutzer-Fehler oder wegen der Empfindlichkeit von NK-Zellen auf experimentelle Manipulation. Um diese Probleme zu beseitigen, wird ein Workflow, der sie auf ein Minimum reduziert wurde etabliert und wird hier vorgestellt. Zu veranschaulichen, erhalten wir Blutproben zu verschiedenen Zeitpunkten, von Läufern (n = 4), die zu einem intensiven Trainingseinheit vorgelegt wurden. Zunächst werden NK-Zellen gleichzeitig identifiziert und isoliert durch CD56-Tagging und magnetische-basierte Sortierung, direkt aus Vollblut und von so wenig wie ein Milliliter. Die sortierten NK-Zellen sind von irgendwelchen Reagenz oder Capping-Antikörper entfernt. Sie können, um gezählt werden, eine genaue NK-Zellzahl pro Milliliter Blut zu schaffen. Zweitens können die sortierten NK-Zellen (Effektoren Zellen oder E) mit 3,3'-Diotade gemischt werdencyloxacarbocyanine Perchlorat (DIO) markierte K562-Zellen (Zielzellen oder T) bei einem Test-optimal 1: 5 T: E-Verhältnis, und analysiert, um eine Bildgebungs Durchflusszytometer verwenden, die für die Visualisierung jedes Ereignisses und die Beseitigung aller falschen positiven erlaubt oder falsch-negative Ergebnisse (wie Dubletten oder Effektor-Zellen). Dieser Arbeitsablauf kann in etwa 4 h vollendet werden, und ermöglicht eine sehr stabile Ergebnisse, selbst wenn sie mit menschlichen Proben arbeiten. Wenn verfügbar, Forschungsteams können mehrere experimentelle Eingriffe am Menschen zu testen und zu vergleichen, Messungen über mehrere Zeitpunkte, ohne die Datenintegrität zu beeinträchtigen.
Einleitung
Natürliche Killerzellen sind ein wesentlicher Bestandteil des angeborenen Immunsystems. Während sie sehr geregelt werden, haben sie die Fähigkeit , zu erkennen und abnormalen Zellen durch Zell-zu-Zell - Kontakt und ohne vorherige Aktivierung 1 beseitigen. Als solche bilden sie eine schnelle Verteidigungslinie gegen Infektionen. Exercise, besonders intensiv, wurde gezeigt , dass die transient das Immunsystem 2, 3, 4, 5 drücken. NK - Zellen sind besonders anfällig für diese Wirkung 4,....
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Protokoll
HINWEIS: Alle Blutsammelverfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien durchgeführt von der Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB) dargelegt.
1. Vollblut-Sammlung
- Haben Sie einen zertifizierten phlebotomist ziehen Blut nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation Richtlinien.
- Zeichnen Sie Blut in ein 4 ml Blutentnahmeröhrchen , das Di-Kalium Ethylendiamintetraessigsäure (K 2 EDTA). Invert-Blutsammelröhrchen nach den Anweisungen des Herstellers. Halten Sie Blutentnahmeröhrchen bei Raumtemperatur auf einem Benchtop-Rocker bis zur Trennung.
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Ergebnisse
Bestimmung der NK-Zellzahl
Die Wirkung von schweren Lauf auf NK - Zellzahl im Vollblut wurde gemessen, die Übung Protokoll in Abbildung 2 beschrieben ist . Blutproben wurden vor dem Training gezogen, unmittelbar nach dem Training, 1,5 Stunden nach dem Training, und schließlich 24 und 48 Stunden nach der ersten Blutentnahme. Die Konzentration von NK - Zellen pro Milliliter Vollblut wurde für jede Kufe (3A) gemessen und im Schnitt (Figur 3B)
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Diskussion
Das Verfahren in dieser Studie beschriebenen Maßnahmen direkt auf die spezifische Aktivität eines NK-Zellen des Individuums als Reaktion auf Reize (in diesem speziellen Fall längerer Übung). Typischerweise werden NK-Zellen aus einem das Blut unter Verwendung von Dichtegradienten oder eine Zelle durch die Verwendung einer Kombination von Markern Sortierung isoliert. Obwohl diese Verfahren weit verbreitet sind, haben sie viele Nachteile: sie zeitraubend sind, beinhalten mehrere Manipulationen und sind stark Benutzer abhän.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Dieses Projekt wurde unterstützt durch die Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant Nr. 2100-68003-30395 vom USDA National Institute of Food and Agriculture.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| K-562 Lymphoblasten | ATCC | CCL-243 | |
| Iscove's modifizierte Dulbecco's Medien | ATCC | 30-2005 | Hohe Glukose, mit L-Glutamin, mit HEPES, sterilgefiltertes |
| Alpha Minimum Essential Medium | ATCC | CRL-2407 | Ohne Ribonukleoside und Desoxyribonukleoside, aber mit 2 mM L-Glutamin und 1,5 g/l Natriumbicarbonat |
| Trypanblau-Lösung 0,4% | Amresco | K940-100ML | |
| Propridiumiodid-Färbelösung | BD Pharmingen | 51-66211E | |
| Vybranto DiO-Zellmarkierungslösung | Vybranto | V-22886 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| autoMACS Laufpuffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| autoMACS Waschpuffer | Miltenyi Biotec | 130-092-987 | |
| autoMACS Säulen | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Vollblut CD56 MikroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-875 | |
| ImageStream X Mark II Imaging Durchflusszytometer | EMD Millipore | ||
| Speedbeads | Amnis Corporation | 400030 | |
| 0,4-0,7 % Hypochlorit (Sterilisator) | VWR | JT9416-1 | |
| Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546929 | |
| 70 % Isopropanol (Debubbler) | EMD Millipore | 1.3704 | |
| D-PBS (Mantelflüssigkeit) | EMD Millipore | BSS-1006-B (1X) | Kein Calcium oder Magnesium |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Version Mark II, September 2013 | |
| Ideen Anwendungssoftware | EMD Millipore | Version 6.1, Juli 2014 |
Referenzen
- Cerwenka, A., Lanier, L. L. Natural killer cells, viruses and cancer. Nat Rev Immunol. 1 (1), 41-49 (2001).
- Nieman, D. C. Exercise, infection, and immunity. Int J Sports Med. 15, Suppl 3 131-141 (1994).
- Romeo, J., Warnberg, J., Pozo, T., Marcos, A.
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Nachdrucke und Genehmigungen
