Herstellung eines UV-Vis und Raman-Spektroskopie Immunoassay-Plattform

Zusammenfassung

Nanopartikel-basierte optische Sonden wurden als Vehikel für den Nachweis von Antigenen mittels Raman- und UV-Vis-Spektroskopie entwickelt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Vorbereitung solcher Sonden für einen UV-Vis/Raman-Spektroskopie-Immunoassay, um zukünftige Multiplexing-Fähigkeiten zu integrieren.

Zusammenfassung

Immunoassays werden verwendet, um Proteine ​​zu detektieren basierend auf dem Vorhandensein von assoziierten Antikörpern. Aufgrund ihrer umfangreichen Einsatz in Forschung und klinischen Umgebungen kann eine große Infrastruktur von Immunoassay Instrumenten und Materialien zu finden. Beispielsweise 96- und 384-Well-Polystyrol-Platten sind kommerziell erhältlich und haben eine Standard-Design-ultraviolett-sichtbare (UV-Vis) Spektroskopie Maschinen verschiedener Hersteller aufzunehmen. Darüber hinaus ist eine Vielzahl von Immunglobulinen, Nachweis-Tags, und Blockierungsmittel für individuelle Immunoassay Designs wie enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) zur Verfügung.

Trotz der bestehenden Infrastruktur, Standard-ELISA-Kits erfüllen nicht alle Forschungsbedarf und erfordert individualisierte Immunoassay-Entwicklung, die teuer und zeitaufwendig sein kann. Zum Beispiel haben ELISA-Kits niedriger Multiplexen (Nachweis von mehr als einem Analyten in einer Zeit) -Funktionen, wie sie üblicherweise auf Fluoreszenz oder col hängenorimetric Methoden für die Erkennung. Kolorimetrische und fluoreszenzbasierte Analysen haben Multiplexierungsfähigkeiten aufgrund breiten spektralen Spitzen begrenzt. Im Gegensatz dazu ist die Raman-Spektroskopie-basierte Methoden haben eine viel größere Fähigkeit zum Multiplexen aufgrund enger Emissionsspitzen. Ein weiterer Vorteil der Raman - Spektroskopie ist , dass Raman - Reporter erfahren deutlich weniger Photobleichens als Fluoreszenzmarkierungen ^1. Trotz der Vorteile, die Raman-Reporter haben über fluoreszierende und kolorimetrische Tags, um Protokolle herzustellen Raman-basierte Immunoassays begrenzt sind. Der Zweck dieser Arbeit ist es, ein Protokoll zu schaffen, funktionalisierte Sonden herzustellen in Verbindung mit Polystyrol-Platten für den direkten Nachweis von Analyten durch UV-Vis-Analyse und Raman-Spektroskopie verwendet werden. Dieses Protokoll wird es den Forschern ermöglichen, für die zukünftige Multi-Analyt-Detektion ein Do-it-yourself-Ansatz zu nehmen, während auf bereits etablierte Infrastruktur Kapital.

Einleitung

Typische Sandwich-Immunoassays Erkennung indirekt die Anwesenheit eines Antigens unter Verwendung zweier Antikörper. Der Capture-Antikörper an eine feste Oberfläche gebunden und bildet einen Antikörper-Antigen-Komplexes, wenn sie in der Nähe einer geeigneten Antigen. Ein Detektionsantikörper wird dann eingeführt und bindet an das Antigen. Die Antikörper / Antigen / Antikörper - Komplex bleibt nach dem Waschen, und wird von dem markierten Nachweisantikörper nachgewiesen , wie in 1A gezeigt. Typische Nachweis wird durch einen fluoreszierenden oder kolorimetrischen Detektor durchgeführt, Multiplexing zu 10 Analyten aufgrund breiten spektralen Peaks

Protokoll

1. Herstellung von Puffern

1. Phosphat - gepufferte Saline (PBS)
   1. Verdünnen Sie 50 ml 10x PBS mit 450 ml HPLC-Wasser, um eine 1x PBS Konzentration machen. Sterilfilter die Lösung mit einem 0,22 um-Filter.
   2. Shop-Lösung bei Raumtemperatur.
2. Herstellung von Tris Buffered Saline + Tween 20 (TBST)
   1. Verdünnen Sie 50 ml 10x Tris-gepufferte Salzlösung (TBS) mit 450 ml HPLC-Wasser, um eine 1x Konzentration machen. Hinzufügen 250 ul Tween-20 für eine 0,05% (v / v) Tween-20. Sterilfilter die Lösung mit einem 0,22 um-Filter.
   2. Bei Raumtemperatur lagern.
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Ergebnisse

In dieser Studie wurden 60 nm Goldpartikel wurden für UV-Vis-Spektroskopie verwendet. UV-Vis - Absorptionsspektren von 400 bis 700 nm gesammelt wurden und die Peakflächen für jede AuNP Konzentration Spektralanalyse - Software ⁸ eine Open - Source wurden ermittelt. Vor Integration zu Peak wurde das gesammelte Spektren Basislinienkorrektur ein Drei-Punkt-Polynomfit verwenden. Peakflächen wurden verwendet , um eine logarithmische Kalibrierungskurve zu erzeugen , wie in Figur 4 gezeigt. Es ist zu.......

Diskussion

In dem detaillierten Protokoll gibt es mehrere kritische Punkte abdecken. Ein Problem ist die Wahl der Raman-Reporter und Gold-Nanopartikel. Obwohl das Protokoll für den individuellen Gebrauch angepasst werden geschrieben wurde, wurde das Raman-Reporter DTTC als Beispiel verwendet. DTTC eine positiv geladene Reporter und bindet an negativ geladenen Oberflächen, wie Citrat capped AuNPs. Dieses Protokoll kann mit einer positiven Oberflächenladung durch Verwendung von Gold-Nanopartikeln für negativ geladene Reporter angepa.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
60 nm Gold-Nanopartikel	Ted Pella, Inc.	15708-6	Hierbei handelt es sich um Citrat-gedeckelte Gold-Nanopartikel. Bitte lesen Sie die Diskussion über die Beziehung zwischen Raman-Reporter und AuNP-Oberflächenladung und ihre Bedeutung für die richtige Auswahl von AuNP und/oder Raman-Reporter.
Natriumbicarbonat	Fisher Scientific	S233-500
Methanol	Pharmco-Aaper	339000000
Tris gepufferte Kochsalzlösung (10x) pH 7,5	Scy Tek	TBD999
Flaschenverschluss-Filtrationseinheit	VWR	97066-202
Tween 20 (Polysorbat 20)	Scy Tek	TWN500	Wird als Emulgator für Waschschritte verwendet.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 10x Konzentrat, pH 7,4	Scy Tek	PBD999
Protein LoBind Tube 2,0  ml	Eppendorf Tubes	22431102	LoBind Tubes verhindern die Bindung von Proteinen und AuNPs an die Oberflächen der Tubes.
Protein LoBind Tube 0,5  ml	Eppendorf Tubes	22431064	LoBind Tubes verhindern die Bindung von Proteinen und AuNPs an die Oberflächen der Tubes.
Mikrotiterplatten-Geräte UniSeal	GE Healthcare	7704-0001	Wird zum Versiegeln und Aufbewahren funktionalisierter Platten verwendet.
Assay-Platte, mit niedrigem Verdampfungsdeckel, 96 Well flacher Boden	Costar	3370
Wasser in HPLC-Qualität	Sigma Aldrich	270733-4L
3,3′-Diethylthiatricarbocyaniniodid (DTTC)	Sigma Aldrich	381306-250MG	Raman-Reporter
mPEG-Thiol, MW 5.000 - 1 Gramm	Laysan Bio, Inc.	MPEG-SH-5000-1g
OPSS-PEG-SVA, MW 5.000 - 1  Gramm	Laysan Bio, Inc.	OPSS-PEG-SVA-5000-1g	OPSS-PEG-SVA hat ein NHS-Ende.
Maus-IgG, Ganzmolekülkontrolle	Thermo Fisher Scientific	31903	Antigen-Ziege
Anti-Maus-IgG (H+L) Kreuzadsorbierter Sekundärantikörper	Thermo Fisher Scientific	31164	Antikörper
Humanes Serumalbumin-Blockierungslösung	Sigma Aldrich	A1887-1G	Rinderserumalbumin kann stattdessen verwendet werden.
Mini-Zentrifuge	Fisher Schientific	12-006-900
UV-Vis Spektralphotometer	Thermo Scientific	Nanodrop 2000c
UV-Vis Spektralphotometer	BioTek	Synergy 2
Entsalzungssäulen	Thermor Scientific	87766
Eigenbau 785  nm inverse Raman-Mikroskopeinheit	N/A	N/A	Ein inverses Raman-Mikroskop eignet sich am besten für die korrekte Fokussierung auf die Oberfläche der Well-Platte. Andernfalls wird aufgrund der Höhe der 96-Well-Platte eine sehr geringe Vergrößerung verwendet. Es wurde ein selbst gebautes System verwendet, da es billiger war als der Kauf bei einem Anbieter. Es kann jedoch jedes handelsübliche inverse Raman-Mikroskopsystem verwendet werden.