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Methodenartikel

Massen Histologie zu Quantifizieren Neurodegenerative Erkrankungen in

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⸱

DOI:

10.3791/54809

⸱

15. Dezember 2016

 , 
1Oregon Institute of Occupational Health Sciences, Oregon Health & Sciences University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Drosophila ist weithin als ein Modellsystem verwendet , Neurodegeneration zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, mit dem Degeneration, wie durch Vakuolenbildung im Gehirn bestimmt wird, kann quantifiziert werden. Es minimiert auch die Auswirkungen aufgrund der Versuchsdurchführung durch die Verarbeitung und sectioning Kontroll- und Versuchs Fliegen wie eine Probe.

Zusammenfassung

Progressive neurodegenerative Krankheiten wie Alzheimer-Krankheit (AD) oder Parkinson-Krankheit (PD) sind weltweit eine zunehmende Bedrohung für die menschliche Gesundheit. Obwohl Säugetiermodelle wichtige Einblicke in die zugrunde liegenden Mechanismen der Pathogenität zur Verfügung gestellt haben, begrenzen die Komplexität von Säugetiersystemen zusammen mit ihren hohen Kosten ihre Verwendung. Daher stellt die einfache , aber gut etablierte Drosophila - Modell-System eine Alternative für die molekularen Mechanismen zu untersuchen , die bei diesen Erkrankungen betroffen sind. Neben Verhaltensdefizite sind neurodegenerative Erkrankungen, die durch histologische Phänotypen wie neuronaler Tod und Axonopathie charakterisiert. Um neuronale Degeneration zu quantifizieren und zu bestimmen, wie sie durch genetische und Umweltfaktoren beeinflusst wird, verwenden wir einen histologischen Ansatz, der auf die Messung der Vakuolen in erwachsenen Fliege Gehirn basiert. Um die Auswirkungen der systematischen Fehler minimieren und direkt vergleichen Abschnitte von Steuerung und experimental Fliegen in einem Präparat, verwenden wir den 'Kragen' Methode für Paraffinschnitten. Neurodegeneration wird dann durch Messen der Größe und / oder Anzahl der Vakuolen beurteilt, die in der Flug Gehirn entwickelt haben. Dies kann entweder durch die Konzentration auf eine bestimmte Region von Interesse durchgeführt werden oder durch das gesamte Gehirn Analyse von Serienschnitten zu erhalten, die den gesamten Kopf erstrecken. Daher ermöglicht dieses Verfahren nicht nur eine schwere Degeneration zu messen, sondern auch relativ mild Phänotypen, die nur nachweisbar in einigen Abschnitten sind, wie während der normalen Alterung auftritt.

Einleitung

Mit der Zunahme der Lebenserwartung haben neurodegenerative Krankheiten wie Alzheimer oder Parkinson eine zunehmende Gesundheitsbedrohung für die allgemeine Bevölkerung geworden. Nach Angaben der National Institutes of Health, 115 Millionen Menschen weltweit sind voraussichtlich von Demenz im Jahr 2050 betroffen sein Obwohl erhebliche Fortschritte für viele von ihnen bei der Identifizierung von Genen und Risikofaktoren beteiligt in zumindest einige dieser Krankheiten gemacht worden, die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind noch nicht bekannt oder nicht gut verstanden.

Einfache invertebrate Modellorganismen wie Caenorhabditis elegans und Drosophila melanogaster bieten eine Vielzahl von experimentellen Vorteile , die Mechanismen von neurodegenerativen Erkrankungen zu untersuchen, einschließlich eines kurzen Lebenszyklus, eine große Anzahl von Nachkommen, und die Verfügbarkeit von gut etablierten und manchmal einzigartigen genetischen und molekularen Methoden 1 -12. Weiterhin sind diese Organismen zugänglich unvoreingenommeneInteraktion Bildschirme, die Faktoren, die zu diesen Krankheiten, die durch ihre erschwerende oder lindernde Wirkung auf neurodegenerative Phänotypen identifizieren können.

Die Analyse solcher genetischer Interaktionen und Beurteilung Alterungseffekte erfordert quantitative Protokolle Neurodegeneration zu erkennen und deren Schweregrad zu messen. Diese Bewertung kann relativ einfach durchgeführt werden , wenn Verhaltensaspekte in Drosophila, wie olfaktorische Lernen, negativ geotaxis oder schnelle Phototaxis zu messen, die 13-21 einen numerischen Leistungswert. Es ist auch möglich, die Wirkungen auf das neuronale Überleben durch Zählen Neuronen zu bestimmen. Dies ist jedoch nur möglich , wenn auf einer bestimmten Population konzentrieren , die eindeutig identifizierbar sind , wie die dopaminergen Neuronen, die bei Parkinson betroffen sind, und selbst dann waren die Ergebnisse umstritten 22-24.

Das hier beschriebene Protokoll verwendet den Kragen Methode Paraffin Serienschnitte durchzuführen, ein Verfahrendas ursprünglich von Heisen und Böhl entwickelt, der es verwendet , um das Gehirn anatomisch Mutanten von Drosophila 25 isolieren. Die Verwendung des Kragens Methode wurde anschließend angepasst, in Kryoschnitten einschließlich Vibratom Abschnitte und Kunststoffprofile 26-28. Hier wird diese Methode Serienschnitte des gesamten Fliegenkopf zu erhalten , verwendet werden , die dann dazu verwendet werden kann , die Vakuolen zu messen , die 16,21,29-32 in Fliegen mit neurodegenerative Phänotypen zu entwickeln. Diese Messungen können in bestimmten Gehirnbereichen durchgeführt werden oder kann das gesamte Gehirn bedecken; der letztere Ansatz ermöglicht es, selbst schwache degenerative Phänotypen zu identifizieren, da während des Alterns beobachtet. Wenn schließlich der Kragen verwendet wird, kann bis zu 20 Fliegen wie einer Zubereitung verarbeitet werden, die nicht nur weniger zeitaufwendig, sondern ermöglicht auch die Analyse von Kontroll- und experimentellen Fliegen in der gleichen Zubereitung, Artefakte aufgrund von geringen Änderungen minimiert in die Vorbereitung.

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Protokoll

1. Befestigung des Kopfes auf Krägen und Einbettung in Paraffin

Hinweis: Alle Schritte in dem Fixierungsprozess sollte in einem Abzug durchgeführt werden. Methylbenzoat, während kein gesundheitliches Risiko darstellen, hat einen sehr deutlichen Geruch, die überwältigend sein kann, wenn nicht in einem Abzug behandelt.

  1. Bevor die Fliegen anesthetizing, bilden 50 ml Carnoy-Lösung durch Zugabe von 15 ml Chloroform und 5 ml Eisessig auf 30 ml 99% Ethanol (nicht das Chloroform mischen und Essigsäure). Gießen Sie es in einem Glasbehälter mit einem flachen Boden, wie ein Kristallierschale, um sicherzustellen, dass die Kragen flach legen kann und vollständig von der Lösung bedeckt.
  2. Anesthetize die Fliegen mit CO 2 oder Äther.
  3. Thread Fliegen (bis zu 20 bei den meisten Krägen) durch den Hals in die Krägen mit einer Pinzette. Denken Sie daran , alle Köpfe in der gleichen Orientierung auszurichten, wie in 1A zu sehen ist , und sanft sein , um sicherzustellen , dass keine Beschädigung des Kopfes oder der Augen auftritt.
  4. Umfassen sine oculis Fliegen (Pfeile, 1A) an zufälligen Positionen so dass die Reihenfolge der Fliegen können leicht in den Abschnitten identifiziert werden. Darüber hinaus, wenn die experimentellen Fliegen einen hellen oder weißen Augenfarbe haben, Gewinde einige rote Augen Fliegen, wie Wildtyp, zwischen ihnen, dass genügend Pigment, um sicherzustellen, vorhanden ist, um die Folie zu färben. Notieren Sie sich die Reihenfolge der Fliegen auf einem Protokollblatt zusammen mit dem Bund Nummer, wenn mehr als ein Kragen verwendet wird.
  5. Sobald ein Kragen abgeschlossen ist, legen Sie sie in die vorbereitete Carnoy-Lösung für 3,5 - 4 Std.
  6. Dump die Carnoy-Lösung in den entsprechenden Entsorgungsbehälter und die Ethanol wäscht beginnen. Stellen Sie sicher, langsam zu gießen, um nicht die Platzierung der Krägen in dem Behälter zu stören.
  7. Waschen Sie die Kragen für 30 min in 99% Ethanol zweimal.
  8. Waschen Sie die Krägen in 100% Ethanol für 1 h. Achten Sie darauf, die Waschungen auf Zeit zu ändern overdehydration zu verhindern.
  9. Setzen Sie die Kragen in methylbenzoateO / N bei RT. Abdichten des Behälters mit Parafilm die Verdampfung des methylbenzoat zu verhindern.
  10. Gießen Sie die methylbenozate in die richtige Einwegbehälter in der Abzugshaube. Fügen Sie eine zuvor hergestellte Mischung von 1: 1 mit niedrigem Schmelzpunkt (56 - 57 ° C) Paraffinwachs und methylbenzoate. Von diesem Zeitpunkt an müssen die Kragen in einem Inkubator bei 65 ° C gehalten werden, um sicherzustellen, dass das Paraffin nicht aushärtet.
  11. Gießen Sie die methylbenozate und Paraffingemisch in die richtige Einwegbehälter, und gießen geschmolzene reine Paraffinwachs, gehalten bei 65 ° C, auf den Kragen.
  12. Ändern Sie das Paraffin nach 30 Minuten und wiederholen Sie diesen mindestens 5-mal. Mindestens 6 - 8 Waschungen durchgeführt werden sollte.
  13. Sobald die Waschungen abgeschlossen sind, legen Sie die Kragen in einen Gummieiswürfelschale mit Schlitzen in etwa die Größe der Kragen. Gießen geschmolzene Paraffin über sie, bis sie vollständig bedeckt und lassen Sie es O zu härten / N (versuchen Sie Luftblasen zu vermeiden).
  14. Entfernen Sie die Paraffinblöcke containing die Kragen aus dem Eiswürfelschale. Trennen Sie den Paraffinblock vom Kragen mit einer Rasierklinge, sanft den Kragen abbrach. Die Köpfe werden im Paraffinblock, während die Körper im Kragen bleiben. Die Blöcke können bei Raumtemperatur gehalten werden.
  15. Um die Kragen reinigen, genießen sie in einem deparafinization Mittel bei 65 ° C, um das Paraffin, sauber und mit Licht Wäsche zu entfernen und waschen in Ethanol vor der Wiederverwendung.

2. Sectioning und Montage

  1. Aufzuwärmen eine Heizplatte auf 50 ° C. Legen Sie die Objektträger (oder Metallmontageblöcke) und Rasierklingen auf der Platte und lassen Sie sie erwärmen.
  2. Je nach der gewünschten Ausrichtung zum Schneiden, befestigen den Block Paraffin entweder mit den Köpfen in Richtung der Seite (für horizontale Segmente) oder nach oben (zum frontalen Abschnitte) zu einem beheizten Befestigungsblock (kurz den Block an der Kontaktseite Schmelzen). Entfernen Sie den Block von der Heizplatte und lassen Sie es mindestens 10 mi abkühlenn, um sicherzustellen, dass das Paraffin für eine einwandfreie Abdichtung auf den Befestigungsblock genügend ausgehärtet ist. Halten Sie die Reihe der Köpfe parallel ausgerichtet mit der Oberfläche des Blocks so viel wie möglich Unebenheiten zu verhindern.
  3. Nehmen Sie eine Rasierklinge und schneiden Sie das überschüssige Paraffin weg von den Fliegenköpfen, so dass nur eine kleine Reihe mit den eingebetteten Köpfen bleibt (der Rasierklinge bis zum leichteren Trimmen erwärmt werden). Achten Sie darauf, nicht zu viel zu trimmen, so dass das Paraffin nicht während des Schneidens (mehr Trimmen kann während des Schneidens erfolgen) nicht bricht.
  4. Platzieren des Montageblocks in den Objekthalter des Mikrotoms und sicherzustellen, dass die Ausrichtung der Reihe von Köpfe möglichst parallel zu dem Rand der Klinge.
  5. Bereiten Sie Mikroskop-Objektträger, indem sie mit einer dünnen Schicht aus Poly-L-Lysin (PLL) Lösung abdeckt und lassen Sie sie für 5 Minuten trocknen lassen. Decken Sie sie mit Wasser kurz vor dem Gebrauch.
  6. Schneiden 7 um Abschnitte und übertragen das Band der Abschnitte mit dem Schlitten auf dem Wasser schwimmen.
    Hinweis: Um das gesamte Gehirn für horizontale Schnitte zu erhalten, sammeln wir das Band von beim Start in das Auge zu schneiden, bis der Kopf vollständig geschnitten wurde (von den Rüssel in das Gehirn schneiden). Mehr als eine Folie kann für den gesamten Kopf benötigt werden.
  7. Legen Sie die Folie auf einer Heizplatte bei 37 ° C und lassen Sie das Band für ca. 1 min zu erweitern.
  8. Entfernen Sie überschüssiges Wasser (Aus- oder mit einem Gewebe Gießen) und trocknen Sie die Dias O / N.
  9. Entfernen Sie das Paraffinwachs aus dem Schlitten durch die Folien in einem hohen, vertikalen Schiebe Färbeküvette mit einem deparafinization Mittel gefüllt platzieren (vollständig die Abschnitte abdeckt). Führen Sie 3 Waschungen von 30 min - 60 min je.
  10. Entfernen Sie die Folie aus der letzten Wäsche. Platz 2 Tropfen Einbettungsmittel auf die Folie und decken Sie es mit einem großen Deckglas.

3. Fotografieren und Analyse der Bereiche

  1. Lassen Sie die vorbereiteten Objektträger 1 zum Trocknen - 2 d. Dann untersuchen sie auf einem Fluoreszenz Microscope unter blauem Licht.
  2. Verwenden Sie eine niedrigere Vergrößerung der Ausrichtung der Fliegen zu bestimmen und die Region von Interesse zu finden, wenn auf eine bestimmte Region konzentrieren.
    HINWEIS: Für die sws Fliegen (siehe Abbildung 2), finden wir den Abschnitt, der die große Kommissur enthält und ein Bild nehmen ( in der Regel bei 40 - facher Vergrößerung). Wenn das gesamte Gehirn Analyse (wie in Abbildung 3), blättern wir durch alle Abschnitte aus einem Kopf und entweder fotografieren Sie den Abschnitt mit den schwersten Phänotyp oder alle Abschnitte , die Vakuolen zeigen.
  3. Für eine Doppelblind-Analyse nehmen und die Anzahl Bilder, ohne den Genotyp zu kennen und den Kragen Nummer und Position des Kopfes in der Reihe aufnehmen um sie später zu identifizieren.
  4. Sobald die Bilder aufgenommen wurden, analysieren sie eine Imaging-Software verwenden.
  5. Zählen Sie die Anzahl der Vakuolen pro Abschnitt oder pro Kopf. Um die Vakuole Größe messen, öffnen Sie die Bilder in einem Software-Programm und wählen Sie die Vakuolen mit einer Auswahl zul. Bestimmen die Anzahl der Pixel in der ausgewählten Vakuolen.
  6. Für die Umstellung auf & mgr; m 2, nehmen Sie ein Foto von einem Stufenmikrometer Kalibrierungsdia an der Vergrößerung für den Erwerb von Fotos verwendet. Bestimmung der Menge von Pixeln in 100 & mgr; m 2 einen Umrechnungsfaktor zu berechnen.
  7. Wandeln die Gesamtpixelzahl in & mgr; m 2 durch die Anzahl der Pixel mit dem Umrechnungsfaktor in dem obigen Schritt berechnet dividiert wird .

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Ergebnisse

Mit Hilfe der beschriebenen Methode führt in Serienschnitten durch das Auge Pigment gefärbt 33, die das gesamte Fliegenkopf umfassen. Ein Teil davon ist in 1B gezeigt, wobei die Abschnitte von einem einzelnen Kopf von oben nach unten dargestellt. Die Abschnitte aus verschiedenen Fliegen werden in diesem Beispiel nach rechts gesehen links. Zur Orientierung und Identifizierung der Fliegen zu erleichtern, ein eyeless fly (sine oculis) als Marker an Posit...

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Diskussion

Das beschriebene Verfahren stellt ein Mittel Neurodegeneration im Gehirn von Drosophila zu quantifizieren. Während andere Methoden, wie einen spezifischen Zelltyp zu zählen, kann die Neurodegeneration zu identifizieren, verwendet werden, ist der Vorteil dieses Verfahrens, dass es im Allgemeinen angewendet werden kann. Zählen erfordert, dass Zellen können diese Zellen zuverlässig identifiziert werden unter Verwendung entweder eines spezifischen Antikörpers oder die Expression eines zellspezifischen Marker, der n...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse an D.K. von der Medical Research Foundation of Oregon und von NIH/NINDS (NS047663) unterstützt. E.S. wurde durch ein Ausbildungsstipendium von den NIH (T32AG023477) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Name des Reagenzien-/GeräteherstellersKatalognummer
HalsbandGenesee ScientificTS 48-100Wir verwenden maßgeschneiderte Halsbänder, die aus einem Stück Metall hergestellt werden, anstatt Schichten wie die von Genesee. Eine Beschreibung, wie man Halsbänder herstellt, finden Sie unter http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html 
Gummi-Eiswürfelschale zum EinbettenHaushaltsspeicherDie Größe kann durch Einkleben zusätzlicher Wände angepasst werden.
KristallisationsschaleFisher Scientific Company08-762-3
EtherFisher Scientific CompanyE138-1
EthanolDecon Laboratories Inc.2701
CholoroformFisher Scientific CompanyC298-500
EisessigFisher Scientific CompanyA38-212
MethylbenzoatFisher Scientific CompanyM205-500Ausgeprägter Geruch - Verwendung im Abzug!
Paraffinwachs mit niedrigem SchmelzpunktFisher Scientific CompanyT565Stellen Sie sicher, dass Sie das geschmolzene Wachs in einem 65° halten; C Wasserbad
MikrotomLeica BiosystemsReichert Jung 2040 Autocut
Mikroskop ObjektträgerFisher Scientific Company12-550D
Mikroskop DeckglasFisher Scientific Company12-545-M
SafeClearFisher Scientific Company314-629Drei verschiedene Behälter zum Waschen
Vertikales Färbeglas mit TitelbildTed Pella Inc. 432-1
PermountFisher Scientific CompanySP15-500
Poly-L-Lysin-Lösung (PLL)Sigma Life ScienceP8290-500

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