Visualizzare gli effetti di espettorato su biofilm di sviluppo utilizzando un modello Chambered coprioggetti

Abstract

I biofilm sono costituiti da gruppi di batteri racchiusi in una matrice di auto-secreto. Essi svolgono un ruolo importante nella contaminazione industriale e nello sviluppo e la persistenza di molte infezioni salute correlati. Uno dei biofilm più ben descritti e studiati nelle malattie umane avviene in infezione cronica polmonare dei pazienti affetti da fibrosi cistica. Studiando biofilm nel contesto dell'ospite, molti fattori possono influenzare la formazione e lo sviluppo del biofilm. Al fine di individuare come fattori dell'ospite possono influenzare la formazione di biofilm e sviluppo, abbiamo usato un metodo coprioggetti Chambered statica a crescere biofilm in presenza di fattori dell'ospite-derivati ​​in forma di surnatanti espettorato. I batteri sono seminate nelle camere e esposti a filtrati espettorato. Dopo 48 ore di crescita, biofilm sono macchiate di un biofilm kit commerciale viabilità prima di microscopia e analisi confocale. A seguito di acquisizione delle immagini, le proprietà biofilm possono essere valutati utilizzando piattaforme software differenti.Questo metodo ci permette di visualizzare le proprietà principali della crescita di biofilm in presenza di sostanze diverse, tra cui antibiotici.

Introduction

biofilm batterici sono gruppi di microrganismi che sono attaccati l'uno all'altro e racchiuso in una matrice di auto-secreta. ^1,2 Classicamente, rappresentano i batteri fisicamente collegati a una superficie abiotico o biotico formata in condizioni di flusso. I biofilm hanno anche dimostrato di crescere in condizioni statiche (assenza di flusso) e distale da superfici, come ad esempio all'interfaccia aria-liquido di piscine termali o pellicole formate in provetta. Questi biofilm sono da tempo riconosciuti nell'ambiente e sono un grande danno per processi industriali, in quanto possono formare in serbatoi di acqua o in tubi, con conseguente biofouling, corrosione e blocchi. ^3,4

I biofilm sono anche critici in ambienti sanitari, in quanto è stato dimostrato essere coinvolti nelle infezioni correlate al catetere, infezioni polmonari nei pazienti affetti da fibrosi cistica, così come in numerose altre infezioni. ^5,6 Una delle caratteristiche di infezioni biofilm è la desgualcita sensibilità dei batteri agli antibiotici e compromessa rinvio del sistema immunitario innato. ^7-9 Il più studiati, scenari clinicamente rilevanti che coinvolgono infezione biofilm-based si verifica in pazienti affetti da fibrosi cistica (FC), che sono cronicamente infettati con Pseudomonas aeruginosa biofilm. P. aeruginosa può subire una serie di modifiche durante la creazione di infezione cronica che lo rendono molto difficile da trattare. ^10,11 I biofilm possono differenziale attivare l'immunità innata e guidare l'infiammazione. ^12-14 Poiché queste infezioni portano ad un aumento della morbilità e mortalità nei pazienti con FC, è fondamentale per capire i fattori che possono influenzare lo sviluppo del biofilm in questo contesto.

Un recente studio suggerisce che ospitano-fattori critici nella formazione di P. aeruginosa aggregati biofilm. ¹⁵ Questi biofilm contribuiscono alla ridotta sensibilità agli antibiotici e meccanismi di difesa dell'ospite. il PreseSNO di fattori dell'ospite-derivati, come elastasi neutrofila, così come i prodotti secreti da microrganismi presenti nel polmone CF, hanno il potenziale di modulare notevolmente la formazione di biofilm e sviluppo. ¹⁶ Inoltre, biofilm interagiscono con l'host di modulare l'espressione di numerosi percorsi e avviare l'infiammazione. Mentre i metodi high throughput, quali il test cristalvioletto standard possono fornire alcune informazioni per quanto riguarda il processo di biofilm, visualizzazione del biofilm in risposta a questi fattori fornire informazioni più approfondite.

In questo manoscritto si descrive un metodo per l'utilizzo di fattori dalla nell'espettorato di pazienti con FC per studiare lo sviluppo di biofilm in vitro. Questo metodo consente la visualizzazione rapida dei biofilm esposti a espettorato contenente fattori host utilizzando un kit di biofilm redditività commerciale. Questa tecnica può essere utilizzata per identificare visivamente i cambiamenti che si verificano durante la crescita di biofilm in presenza di exogenonoi prodotti, e rappresenta un metodo migliore per analizzare i cambiamenti nello sviluppo del biofilm in varie condizioni.

Protocol

Si noti che la ricerca Consiglio di etica (REB) è necessario per raccogliere e conservare campioni di espettorato da soggetti umani. Questi studi sono stati approvati dal Hospital for Sick Children REB # 1.000.019,444 mila.

1. preparazione dei campioni dell'espettorato CF

1. Raccogliere campione di espettorato dai pazienti durante le visite di routine alla clinica fibrosi cistica e tenere in ghiaccio.
2. Trasporto del campione di espettorato sul ghiaccio entro la prima ora di raccolta, al laboratorio di ricerca, di sottoporsi a trattamento.

2. dell'espettorato Processing

1. Registrare il volume del campione di espettorato ottenuti. Aggiungere tampone fosfato salino (PBS) per 2 volte il volume del campione (ad esempio, 2 parti di PBS, 1 parte di campione).
2. Mescolare il campione bene con una pipetta di trasferimento. Vortex il campione sul valore massimo per 1 minuto per miscelare completamente.
3. Aliquota 1 ml della miscela sopra nel numero provette da 1,5 ml microcentrifuga appropriati e spin down a 5.000 xg per20 min a 4 ° C.
4. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e scartare il pellet.
5. Filtro sterilizzare il surnatante attraverso un filtro di 0,22 micron e raccogliere in una provetta pulita.
   NOTA: La sterilità del filtrato viene testato da placcatura su LB agar e inoculando mezzi liquidi.
6. Conservare il surnatante dell'espettorato a -80 ° C per un uso futuro.
   NOTA: L'espettorato da più pazienti possono anche essere raggruppati dopo la filtrazione.
7. Prima dell'uso, diluire espettorato filtrato 1/10 v / v (100 ml di espettorato, 900 l di media) a supporto desiderato.
   NOTA: Qui, è stato utilizzato il brodo lisogenia standard (LB) media.

3. Metodo Chambered coprioggetti per la formazione di biofilm

1. Crescere isolato batterico di interesse overnight a supporto desiderato a 37 ° C con agitazione (200 rpm).
   Nota: sono stati utilizzati una serie di diversi batteri, tra isolati clinici Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,Complesso Burkholderia cepacia e xylosoxidans Achromobacter. Scelta dei supporti dipende dalle tensioni e le condizioni di interesse, ma i media LB possono essere utilizzati per gli esperimenti iniziali.
2. Dalla cultura overnight, inserire 40 ml di coltura in 4 ml di mezzi freschi e crescere per 3-4 ore a 37 ° C con agitazione (200 rpm) per ottenere una coltura con una densità ottica a 600 nm (OD ₆₀₀₎ di circa 0,5 -0.6.
3. Diluire la cultura dal punto 3.2 a 1/5 nel supporto desiderato con il 10% espettorato filtrato o senza filtrato espettorato (come controllo). Altro concentrazione di espettorato filtrato può essere testato (cioè, 50% o 100%).
4. Utilizzare 200 ml di diluizione per seminare pozzi di camere di diapositive.
5. Permettere ai batteri di attaccare per 4 ore a 37 ° C senza agitazione.
6. Dopo 4 ore, rimuovere il supporto e lavare delicatamente il biofilm con mezzi freschi 1x. Sostituire con 200 ml di mezzi freschi.
   NOTA: Per studiare gli effetti della sputo sul biofilm, i fresh media dovrebbero contenere espettorato surnatante.
7. Consentire biofilm di crescere per quantità desiderata di tempo a 37 ° C senza agitazione, sostituirà supporti ogni 12 ore, senza lavaggio fino al momento per microscopia.
   NOTA: Per studiare l'effetto dei sovranatanti di espettorato su biofilm sensibilità agli antibiotici, gli antibiotici vengono aggiunti ai media dopo 24 ore di crescita di biofilm e sono mantenute nella media fino a quando la colorazione e l'imaging di biofilm.

4. colorazione biofilm e Microscopia confocale

1. Dopo il tempo di crescita desiderato (24-48 hr funziona meglio), rimuovere i supporti da pozzi da camera e lavare delicatamente ciascuna camera due volte con 300 ml di PBS sterile.
2. Preparare la miscela di colorazione per biofilm mescolando 1 ml di ciascun colorante (fornito nel kit fattibilità) per ogni ml di soluzione necessaria. Fai la tintura in acqua o mezzi soluzione.
   NOTA: L'acqua è consigliato dal produttore.
3. Aggiungere 200 ul di miscela colorante in ciascun pozzetto della covergla chamberedss ed incubare a temperatura ambiente, al buio per 45 min.
4. Rimuovere miscela colorazione dalle camere e lavare bene ogni con 300 ml di PBS sterile. Rimuovere PBS e sostituirlo con acqua dolce o media.
5. Procedere con la visualizzazione di biofilm mediante microscopia confocale.

5. Visualizzazione biofilm con Microscopia confocale

1. Leggi biofilm macchiati in camere immediatamente dopo la colorazione (entro 1 ora). Minimizzare ritardo nella visualizzazione delle diapositive colorando 1 a 2 camere 8 pozzetti alla volta.
2. Eseguire l'imaging utilizzando microscopio confocale con i laser per l'eccitazione e di filtro set per l'acquisizione.
   NOTA: Qui, il disco di sistema confocale di filatura con i laser Borealis spettrali (Verde: 491nm, colore rosso: 561 nm) sono stati utilizzati per l'eccitazione. filtro per le emissioni set di 515/40 e 624/40 sono stati usati per visualizzare le macchie dal kit biofilm viabilità.
3. Prendere le immagini utilizzando un obiettivo 25X acqua sul microscopio confocale con la macchina fotografica.
4. Prendere 3-5 immagini da ogni pozzetto.
   NOTA: Così per un 8 coprioggetti ben camerata, 24-40 immagini saranno generate.
5. Salvare le immagini per l'analisi.
   NOTA: Le immagini devono essere salvati come file OME-TIFF per essere analizzati utilizzando COMSTAT ^18,19. Istruzioni per l'analisi delle immagini biofilm possono essere trovati a http://www.comstat.dk/. Una volta che le immagini vengono importate, parametri come spessore medio, biomassa e la copertura di superficie per ogni canale (rosso e verde) possono essere analizzati.

Representative Results

Il disegno complessivo di questo esperimento è rappresentata in figura 1. L'uso di questo protocollo fornisce un metodo conveniente per visualizzare le variazioni di biofilm coltivate per diversi periodi di tempo (ad esempio, 24, 48 o 72 hr). È importante sottolineare che i segnali esogeni, quali espettorato filtrati, possono essere aggiunti per visualizzare i cambiamenti nello sviluppo biofilm. Come si vede nella figura 2, la presenza del 10% filtrati dell'espettorato può cambiare l'architettura del biofilm (Figura 2A, pannelli inferiori). ¹⁶ Queste immagini possono essere analizzati utilizzando il software COMSTAT per ottenere matrici biofilm chiave, tra cui spessore medio del biofilm, biomassa totale e la copertura della superficie. Ciò si riflette in un aumento globale spessore biofilm (Figure 2B e 3). ¹⁶ Gli effetti degli antibiotici sulla biofilm nell'espettorato presenza è illustrato nella figura 3. Con visuali zing i cambiamenti nello sviluppo del biofilm, si può meglio apprezzare come fattori possono influenzare la crescita biofilm, in misura molto meglio di saggi biofilm tradizionali, come macchie cristalvioletto.

Figura 1: Disegno generale di esperimento. Diagramma di flusso di protocollo di base. Una notte (O / N) cultura viene diluito 1 / 1.000 e permesso di crescere ad un diametro finale ₆₀₀ del 0.5. Questo viene ulteriormente diluito 1 / 1.000 e 200 ml è seminato in pozzo di coprioggetti a camera e ha permesso di collegare per 3-4 ore. A seguito di questo, il supporto viene rimosso e sostituito con mezzi freschi. I biofilm sono autorizzati a crescere per il tempo desiderato. Media, prodotti esogeni o antibiotici possono essere aggiunti ai biofilm. A seguito della crescita, i media viene rimosso, biofilm sono macchiati e viene eseguita confocale.ge.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagini rappresentative di sviluppo del biofilm a seguito di esposizione a filtrati espettorato. (A) Immagini rappresentative della Burkholderia cepacia (BCC) isolati clinici seguenti 48 ore di crescita in coprioggetti a camera con le sole (pannelli superiori) dei media o in presenza di 10 filtrati% di espettorato (pannelli inferiori) seguita da colorazione con kit di biofilm viabilità. 1 unità scala rappresentano 19.68 micron. (B - C) Spessore medio di isolati (B) e morti: rapporto vivo (C) delle immagini multiple di BCC isolati coltivato per 48 ore in camera di diapositive in assenza (barre bianche) o presenza (barre nere) di espettorato filtrati. Ogni barra rappresenta la media di 45 immagini tracciatecon l'errore standard della media. ** P <0,001 rispetto al controllo (supporti da solo) utilizzando test di Kruskal-Wallis. Figura adattato da Kennedy et al. ¹⁶ Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Immagini rappresentative della terapia antibiotica su biofilm esposti al filtrato espettorato. (A) Immagini di isolati clinici Burkholderia vietnamiensis dopo 48 ore di crescita in coprioggetti a camera con i soli mezzi di comunicazione (a sinistra) o in presenza di 10% filtrati espettorato (a destra) con o senza 1.000 mg / m di tobramicina. I biofilm sono state coltivate per 24 ore in mezzi da solo o multimediale integrato con il 10% (v / v) espettorato filtrati. Dopo 24 ore, i media è stato rimosso e sostituito con mediun (+/- espettorato) contenenti antibiotici. 1 unità scala rappresentano 19.68 micron. (B - C) Spessore medio di isolati (B) e morti: rapporto vivo (C) di immagini multiple (n = 9) di B. vietnamiensis isolati coltivato per 48 ore in camera di diapositive in assenza o presenza di espettorato filtrati. Ogni barra rappresenta la media di 45 immagini tracciate con l'errore standard della media. ** P <0,001 rispetto al controllo (0 mg / ml) mediante test di Kruskal-Wallis. Figura adattato da Kennedy et al. ¹⁶ Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

I metodi qui descritti consentono la visualizzazione dei biofilm batterici cresciute in presenza di prodotti esogeni. Non sorprendentemente, la produzione dei exoproducts è di importanza quando si utilizza questo tipo di sistema. Per esempio, ditiotreitolo (DTT), è spesso usato su campioni di espettorato umani per aiutare a liquefare i campioni. Tuttavia, l'effetto di DTT solo può diminuire sviluppo biofilm e vitalità (dati non mostrati). Quindi, controlli appropriati per tutte le condizioni sono necessarie. Inoltre, l'aggiunta di prodotti dell'espettorato umani crea variabilità intrinseca l'esperimento a causa del fatto che l'espettorato di ogni paziente ha una microbiome unico. Per regolare per questo, abbiamo utilizzato campioni di espettorato in pool per evitare risultati specifici del paziente. Inoltre, la scelta di appropriati mezzi è importante quando si usa un sistema modello. supporti standard per la crescita di biofilm dell'organismo previsto sono consigliate per la configurazione iniziale del sistema. Se l'obiettivo dell'esperimento è quello di identIfy come i prodotti esogeni stanno interessando la formazione di biofilm, un nutriente rich media che fornisce un'adeguata formazione di biofilm è suggerito. Questo permetterà la nutrizione sufficiente per la crescita, pur determinare come i fattori esogeni possono influenzare il biofilm. Altri media, quali mezzi minimali o definiti, possono essere utilizzate a determinate condizioni migliori mimici. Altri media sono stati utilizzati con buoni risultati in questo sistema (dati non mostrati). L'attaccamento dei biofilm al coprioggetti camerati è robusto, per quanto grande cura deve essere presa durante la rimozione / aggiunta di supporto o durante le fasi di lavaggio dei biofilm per evitare che interrompere i biofilm.

L'uso della macchia live-morti secondo il protocollo del produttore ha dato buoni risultati per il sistema descritto. Un certo numero di fattori che possono influenzare il rapporto di fluorescenza delle immagini (compresa colorante assorbimento di batteri, densità relativa di impostazioni biofilm e di guadagno del rivelatore), tuttavia, questo metodo dovrebbe riferirsi a quanto osservato nell'immagineS. Altre misure potrebbero essere usate per rappresentare la quantità relativa di morti biofilm / live, come la biomassa dalle cellule morte come rapporto tra la biomassa totale presente nel biofilm (come derivato da COMSTAT). Utilizzando conta batterica per confermare la vitalità del biofilm in esperimenti ripetuti si consiglia di confermare le osservazioni visive di questo modello. A causa della eterogeneità del biofilm, immagini multiple da ciascuna camera e camere multiple devono essere utilizzati per ciascuna condizione in un esperimento. Ciò aumenta il costo e la durata di questi esperimenti.

L'acquisizione delle immagini è importante prima dell'analisi dei dati di questi esperimenti. Bisogna fare attenzione a non saturare le immagini e quando si determina la configurazione microscopio. A seconda del livello di dettaglio richiesto e il microscopio disponibili, diversi obiettivi (10X, 25X, 40X e 63X) può essere usata per acquisire immagini, anche se si trova che obiettivo 25X fornisce immagini migliori. Lo spessore tegli Z-stack può anche influire sulla qualità dell'immagine e livello di dettaglio. Avere immagini scattate ogni 0,5-1 micron sembra fornire immagini nitide a 25X obiettivo, pur mantenendo le immagini Z-stack in un formato che può essere analizzato da COMSTAT su sistemi di computer standard.

Questi esperimenti sono più costose e lunghe di altri saggi di fissaggio, e non può essere fatto in modo elevato throughput. In questa procedura, i batteri attaccano ad una superficie borosilicato, che non è riflettente di una condizione in vivo e può influenzare la formazione e lo sviluppo del biofilm. Tuttavia, essi forniscono informazioni aggiuntive e in grado di generare ipotesi di meccanismo relative al biofilm resistenza agli antibiotici e la risposta fisiologica al segnale esogeno. Se l'obiettivo dell'esperimento è quello di capire come biofilm cambiano in risposta a diversi fattori, piuttosto che identificare composti anti-biofilm utilizzando metodi high-throughput per esempio, le informazioni aggiuntive acquisite utilizzando tla sua tecnica rende il metodo utile. Pertanto, il metodo attuale è un avanzamento significativo rispetto ai precedenti test fissaggio limitate, come il test cristalvioletto, che è più comunemente utilizzato per studiare biofilm.

I passaggi critici di questa procedura sono: 1) Assicurare il trattamento tempestivo dei campioni di espettorato per evitare il degrado; 2) Essere gentile con i cambiamenti dei media sui biofilm per evitare perturbazioni del biofilm e 3) fare misurazioni ripetute di immagini biofilm al fine di garantire una rappresentazione accurata dello spessore biofilm a causa della eterogeneità della formazione di biofilm.

Una volta che il sistema è predisposto per una determinata specie batteriche, si può verificare un certo numero di differenti condizioni, inclusi gli effetti di fattori esogeni su diversi isolati clinici. Questo sistema è stato utilizzato per studiare l'effetto degli antibiotici sui biofilm esposto a espettorato umano ¹⁶ e di confrontare isolati clinici alta resistenza e resistenti intermedia. ¹⁷ Modifiche coprioggetti incamerata, come rivestimento basso con mucina o collagene micro-scaffold (ad esempio, puracol), possono estendere ulteriormente la gamma di esperimenti possibili. Può essere possibile adattare questo sistema per studiare le interazioni dirette, come quelle tra le cellule epiteliali e batteri, o tra diverse specie batteriche. Questo è un'espansione del modello descritto da Jurcisek et al. ²⁰ Il metodo utilizza crescita camera di scorrimento simile a quella descritta qui e utilizza formalina per fissare biofilm prima visualizzazione. In alternativa, in questo metodo visualizziamo biofilm subito dopo la colorazione e non usiamo un fissativo. Inoltre, aggiungiamo fattori esogeni per testare l'effetto di antibiotici su biofilm. Questo modello ha quindi le potenzialità per favorire notevolmente la nostra comprensione dei biofilm batterici nelle malattie umane.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well	Thermo Sicher Scientific	155409
Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit	Thermo Fisher Scientific	L10316
Blood agar plates	Thermo Fisher Scientific	R10215	Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation
COMSTAT	Availble software online		COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Standard media for overnight gowth/biofilm growth
Millex-GV Syringe Filters	Millipore	SLGV013SL	Filtering of sputum supernants
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)	Oxoid	BR0014G	Washing of biofilm chambers after media removal
Zeiss AxioVert 200M	Carl Zeiss
Hamamatsu C9100-13 EM-CCD	QS Technologies Inc.
Spectral Borealis	Qs Technologies Inc.
Perkin Elmer Volocity	QS Technologies Inc.		Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf