Visualisierung der Interrenal- Steroidogenic Gewebe und seine Vascular Mikromilieu in Zebrabärbling

Summary

Die Interrenal- Drüse in Zebrabärbling ist die Teleosteer Pendant der Säugetiernebenniere. Dieses Protokoll führt , wie das 3-β-Hydroxysteroid - Dehydrogenase (Δ ^5-4 Isomerase; 3β-Hsd) zur Durchführung enzymatischer Aktivitätstest, der differenzierte steroidogenen Zellen in der Entwicklungs Zebrabärbling erkennt.

Abstract

Dieses Protokoll führt ein, wie differenzierte interrenale steroidogene Zellen durch einen einfachen enzymatischen Aktivitätsassay nachgewiesen werden können. Die Identifizierung differenzierter steroidogener Gewebe durch chromogene histochemische Färbung von 3-β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase /Δ^{5-4-Isomerase} (3β-Hsd)-aktivitätspositiven Zellen ist entscheidend für die Überwachung der Morphologie und Differenzierung von Nebennierenrinden- und Internierengewebe bei Säugetieren bzw. Teleosten. Im Zebrafischmodell ermöglichen die optische Transparenz und die Gewebepermeabilität der sich entwickelnden Embryonen und Larven eine vollständige Färbung der 3β-Hsd-Aktivität. Dieses Färbeprotokoll, wie es an transgenen fluoreszierenden Reporterlinien durchgeführt wird, die die sich entwickelnden Pronephr- und Endothelzellen markieren, ermöglicht den Nachweis des steroidogenen Internierengewebes zusätzlich zur Niere und der benachbarten Gefäße. In Kombination mit Vibratomschnitten, Immunhistochemie und konfokaler Mikroskopie können wir die vaskuläre Mikroumgebung von interrenalen steroidogenen Geweben sichtbar machen und untersuchen. Der 3β-Hsd-Aktivitätsassay ist für die Untersuchung der Zellbiologie der Zebrafisch-Interniere unerlässlich, da bisher kein geeigneter Antikörper für die Markierung steroidogener Zellen des Zebrafisches zur Verfügung steht. Darüber hinaus ist dieser Assay schnell und einfach und bietet somit ein leistungsfähiges Werkzeug für Mutanten-Screenings, die auf genetische Erkrankungen der Nebennieren (Interniere) abzielen, sowie für die Bestimmung von Störungseffekten von Chemikalien auf die Steroidogenese in pharmazeutischen oder toxikologischen Studien.

Introduction

Die Nebenniere, eine entscheidende Komponente des Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse, sondert Steroide und koordiniert Steroid-Homöostase und die körperliche Reaktion auf Stress. Die Nebenniere besteht aus der äußeren Rinde, die Steroide in einer Zone spezifisch und innere Medulla, die Katecholamine synthetisiert absondert. Die Interrenal- Drüse in teleosts ist das Gegenstück der Nebenniere bei Säugetieren und ist steroidogenen Interrenal- und chromaffinen Zellen zusammengesetzt aus, die funktionale Äquivalente der Nebennierenrinde und Medulla sind jeweils ^1-3. Studien mit der Zebrabärbling - Modell durchgeführt , haben berichtet , dass beide steroidogenen und chromaffinen Zelllinien von molekularen und zellulären Mechanismen gebildet sind ähnlich denen hoch in Säugetieren ^1,2. Daher ist der Zebrabärbling ein potenziell leistungsfähiges Modell für genetische Erkrankungen zu studieren, neuroendokrinen Kontrolle und Systembiologie des Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren (Interrenal-) Achse.

in der Nebenniere, 3β-Hsd katalysiert die Umwandlung von Progesteron aus Pregnenolon, 17α-Hydroxyprogesteron aus 17α-hydroxypregnelolone und Androstendion aus Dehydroepiandrosteron ^4,5. 3β-HSD wichtig, alle Klassen der hormonellen Steroide für die Biosynthese, nämlich Progesteron, Glucocorticoide, Mineralocorticoiden, Androgene und Östrogene. Die beiden menschlichen 3β HSD Isoenzyme HSD3B1 und HSD3B2 sind differentiell exprimiert ^6. HSD3B1 wird in der Plazenta und peripheren Geweben exprimiert, während HSD3B2 in der Nebennierenrinde und Gonaden exprimiert wird. Menschliche HSD3B1 und HSD3B2 co-Orthologe von Zebrabärbling hsd3b1, die am Interrenal- Gewebe und adulte Gonaden exprimiert wird; Zebrabärbling hsd3b2 ist ein maternal exprimierte Gen , dessen Transkripte verschwinden vor organogenesis ^7. Das Protokoll des gesamten Montage 3β-Hsd enzymatischen Aktivitätstest für Zebrabärbling durch Modifizieren Levy-Verfahren entwickelt wurde, eins von Milano et al. , Auf Gefrierschnitten von acht Teleostier Arten ^8. Aufgrund der Gewebedurchlässigkeit und optische Transparenz der Entwicklungs Zebrabärbling, Vollmontage 3β-Hsd Histochemie kann erfolgreich für die feste Zebrafischembryo und Larven und speziell die differenzierten Interrenal- Gewebe abzugrenzen verwendet werden.

Dieses empfindliche und schnelle Assay wurde auf verschiedenen Mutanten und morphants angewendet wurden verschiedene Arten von Interrenal- dysmorphogenesis demonstriert. Die Interrenal- 3β -HSD - Aktivität im Embryo abwesend wo Spezifikation des Interrenal- Gewebe durch eine bestimmte Zuschlags des FF1b Transkriptionsfaktor gestört ist und verringert so die Interrenal- Differenzierung durch eine Zuschlags des FF1b coregulator Prox1 ^9,10 betroffen ist. Bemerkenswert ist , kann der 3β-HSD in Mutanten mit schweren frühzeitig Defekte wie einäugige Stecknadelkopf und schielen, wo der 3β-H detektiert werdensd histochemistry umreißt , wie die Interrenal- Zellmigration ¹¹ betroffen. Die Differenzierung des Interrenal- Gewebe wird nicht einmal in der vollständigen Abwesenheit von Blut und Vaskulatur kompromittiert. Deshalb, wie Endothel-abgeleiteten Signale die Entwicklung Interrenal- Organ formen kann ^12,13 bestimmt werden. Insgesamt ist dieser histochemischen Assay zur Untersuchung der Spezifikation, Differenzierung und Migration von steroidogenen Zellen im Zebrafisch Modell erfolgreich verwendet wurde. Daher sollte ein effizientes und zuverlässiges Werkzeug für jede genetische oder chemische Bildschirme Targeting Nebennieren- und Interrenal- Organstörungen sein.

Protocol

Ethikerklärung: Alle experimentellen Verfahren auf Zebrabärbling wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee von Tunghai University (IRB Zulassung NO 101-12.) Genehmigt und in Übereinstimmung mit den genehmigten Richtlinien durchgeführt.

1. Stammlösungen für 3β -HSD enzymatischen Aktivität Färbung

1. Vorbereitung trans-Dehydroandrosteron [10 mg / ml in Dimethylsulfoxid (DMSO)].
2. Bereiten β-Nicotinamidadenindinucleotid-Hydrat (1,2 mg / ml in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,2).
3. Bereiten Nicotinamid (Vitamin B3, 50 mg / ml in H ₂ O).
4. Herstellung von 4-Nitroblau-Tetrazolium (50 mg / ml in 70% Dimethylformamid).
5. Aliquotieren alle diese Komponenten in Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 ° C.
   HINWEIS: Nach unserer Erfahrung wiederholtem Einfrieren und Auftauen der Aliquots aller vorgenannten Lösungen haben keinen Einfluss auf die Intensität der 3β-HSD-Färbung.

2. WLoch-Mount-3β-HSD-Färbung

HINWEIS: Die 3β-Hsd enzymatische Aktivität ist nachweisbar in Zebrabärbling Embryonen bereits 28 Stunden nach der Befruchtung (hpf) bei Kultivierung bei 28,5 ° C, die mit dem Beginn der mRNA - Expression von hsd3b1 ^2,7 konsistent ist. Die ganze Montage 3β-HSD Färbeprotokolls in dieser Studie basiert auf einem zuvor beschriebenen Verfahren ⁸ und wurde in der Entwicklung von Zebrafisch bis zu 7 Tage nach der Befruchtung ⁹ erfolgreich zu sein bestimmt. Für die vaskuläre Mikroumgebung des Interrenal- steroidogenen Gewebe zu analysieren, Vollmontage 3β-HSD - Färbung muss transgenen Linien exprimieren Endothel-spezifische Fluoreszenz, wie Tg angewendet werden (kdrl: EGFP) ^{S843 14} und Tg (kdrl: mCherry) ^{CI5 15} . Zur Analyse der Interrenal- steroidogenen Gewebe unter Berücksichtigung Zebrabärbling Nierenentwicklung kann 3β-HSD-Färbung sein Anwened auf die Tg (wt1b: GFP) ^LI1 Fisch ^16, wobei die Bildung der Glomeruli und Tubuli pronephric abgegrenzt ist.

1. Behandeln Sie die Entwicklung von Zebrafisch, indem sie in 0,03% Phenylthioharnstoff in Ei Wasser (0,06 mg / L Riff Salz in demineralisiertem Wasser) Inkubation von einer Stufe zwischen 12 und 24 hpf beginnen, Pigmentbildung zu hemmen.
2. Fix dechorionated Embryonen oder Larven in (A) 4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), supplementiert mit 0,1% Tween 20 (PFAT) für 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT) oder (B) 2% PFAT über Nacht bei 4 ° C oder für 2 Stunden bei 4 ° C, um 4 h lang bei RT verfolgt.
   Achtung: PFA ist giftig beim Einatmen und bei Hautkontakt. Es ist schädlich für die Haut, der Schleimhäute, der Augen und der oberen Atemwege.
3. Waschen Sie die Embryonen 4x 10 min mit PBS mit 0,1% Tween 20 (PBST) bei RT ergänzt.
   HINWEIS: Es ist wichtig, nicht die Proben trocknen, während die Waschlösungen zu verändern.
4. Frisch herstellen, die staining Lösung vor den Reaktionen (Tabelle 1). Vorbereiten, Wirbel und Zentrifugenteile A und B in getrennten Röhren.
   HINWEIS: alle Komponenten Hinzufügen gerade in einem einzigen Rohr würde heftige Niederschläge verursachen.
5. Fügen Sie die gesamte Lösung von Teil A auf die gesamte Lösung von Teil B, gut mischen die Färbung Lösung herzustellen, und sofort zu verteilen 1 ml in jedes Mikroröhrchen, das fixiert und gewaschen Embryonen.
6. Wrap-Mikrozentrifugenröhrchen mit Aluminiumfolie zum Schutz vor Licht und Ort entweder auf einem Rotator oder einem Wippschüttler für sanftes Schütteln bei RT.
7. Empirisch bestimmen durch Überwachung chromogenen Signale durch Mikroskopie, die Reaktionszeit. Leichte Fällungen wird im Laufe der Zeit entwickeln; aber sie werden nicht mit dem Reaktionsprozess stören.
   HINWEIS: Bei Embryonen bei 25 ° C für 4 Stunden bei 28 HPF, Färbung fixiert erzeugt ein klares Signal an die Interrenal- Gewebe.
8. Die Reaktion durch 4x Waschen für 10 min in PBST. ichf keine weiteren immunhistochemischen (IHC) Analyse erforderlich ist, post-fix die gefärbten Embryonen mit 4% PFAT für 60 min bei RT. Andernfalls speichert die gewaschenen Embryonen bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung.
9. Für Ganz Mount Mikroskopie, deaktivieren Sie die gefärbten, post-fixiert und gewaschen Embryonen mit 50% Glycerin in PBS, orientieren sie mit der Rückenseite auf einer Folie nach oben und beobachten ein aufrechtes Mikroskop unter Hellfeldbeleuchtung verwendet wird.
   HINWEIS: Um ein hochauflösendes Bild des Interrenal- Gewebemorphologie, flach-Mount-Analyse der 3β-HSD-gefärbt und deyolked Embryo wird empfohlen. Da die Interrenal- steroidogenen Gewebe direkt über dem Dottersack positioniert ist, ermöglicht eine ventrale flach-Mount - Analyse des Interrenal- Gewebe eine direkte und klare Beobachtung der Interrenal- Morphologie ^17.

3. IHC Analyse von 3β-HSD-gefärbten Embryonen

Hinweis: Für die vaskuläre Mikroumgebung des steroi Analysedogenic Gewebe, die 3β-HSD-gefärbten Embryonen mit einer transgenen Endothel-spezifischen Fluoreszenzreporter werden ^12,18 Vibratom Schnitte und anschließender IHC Analyse der Quer unterworfen.

1. Post-Fixierung
   1. Post-fix die 3β-HSD-gefärbt und gewaschen Embryonen mit 2% PFA, ergänzt mit 1% Triton X-100 für 1 Stunde bei 4 ° C und waschen 4x 10 min in PBS mit 1% Triton X-100 (PBSTx) bei RT.
2. Verankerung
   1. Bereiten Sie 4% niedrig schmelzenden Agarose durch die Agarose in PBS Auflösung bei 95 ° C, aliquoten in Mikrozentrifugenröhrchen, und lagern bei 4-8 ° C.
   2. Schmelzen Sie eine aliquote Menge von 4% niedrig schmelzenden Agarose bei 70 ° C für 10 min, und halten Sie dann die aliquoten bei 47 ° C. Einbetten von jedem Embryo in geschmolzenem 4% niedrigschmelzender Agarose in einem frei stehenden Kappe aus einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, die als Form dient, und lassen, bis sie fest zu kühlen.
3. Vibratom Sectioning
   1. Kleben Sie ein Stück Papier, Klebeband auf die trockene platform des Vibratom.
   2. Entfernen Sie den gehärteten Agaroseblock aus der Form durch eine Rasierklinge. Bewerben superglue auf das Papierband auf der Plattform, und befestigen Sie die Agarose-Block auf das Papierband, mit der vorderen Seite der Probe nach oben zeigt. Trimmen der Agarose-Block in eine trapezPrismenForm mit ca. 4 mm und 8 mm auf jeder Seite der oberen und unteren Flächen, respectively.
   3. Spülen Sie die Probe enthaltenden Agarose-Block mit kaltem PBS, ergänzt mit 0,5% Triton X-100 (0,5% PBSTx) durch eine Pipette verwenden.
   4. Schneiden Sie die Agarose-Block in 100 & mgr; m Abschnitte entsprechend der Bedienungsanleitung des Vibratom. Spülen Sie ständig die Agarose-Block Austrocknen zu verhindern. Da jede Scheibe geschnitten wird, entfernen Sie sie aus dem Vibratom eine 26 G Spritzennadel verwenden und übertragen auf einer Tüpfelplatte kalt 0,5% PBSTx (500 & mgr; l / Well) enthält.
   5. Sammeln Sie die 3β-HSD-positive Gewebeschnitte von unter einem Präpariermikroskop prüft, und übertragen Sie die Abschnitte durch eine piPette Spitze mit seinem Ende cut-off (ca. 1 mm Innendurchmesser an der Öffnung) in einer 96-Well-Platte mit kaltem 0,5% PBSTx (150 & mgr; l / Well). Die Gewebeproben in der Regel aus dem Agarose-Block nach diesem Schritt distanzieren.
4. Permeabilisierungs und Waschen
   1. Waschen Sie die Scheiben für 15 min in 0,5% PBSTx bei RT, 10 min in PBS 6x, 4x und für 10 min in PBS mit 1% Rinderserumalbumin / 1% DMSO ergänzt / 0,1% Triton X-100 (PBDTx).
5. Blockierung
   1. Inkubieren Scheiben für 1 h in 2% fötalem Kälberserum (FCS) in PBDTx bei RT.
6. Primäre Antikörper-Reaktion
   1. Inkubieren Scheiben für 1,5 Tage in PBDTx einen primären Antikörper enthält (zB polyklonale Kaninchen - Anti-Human - Fibronektin und Maus - anti-human focal adhesion kinase) bei 4 ° C.
7. Waschen
   1. Waschen Sie die Scheiben für 10 min in PBDTx bei RT 6x.
8. Blockierung
   1. Inkubieren Sie die Scheiben für 1 h in 2% FCS in PBDTx bei RT.
9. Sekundär-Antikörper-Reaktion
   1. Inkubieren Scheiben für 1,5 Tage in PBDTx einen sekundären Antikörper (Fluorophor-konjugierten Ziege-anti-Kaninchen- oder anti-Maus-IgG) bei 4 ° C enthält.
10. Waschen
    1. Waschen Sie die Scheiben für 10 min in PBDTx bei RT und 4x für 10 min in PBST bei RT 6x.
       HINWEIS: Für die konfokale mikroskopische Analyse, deaktivieren Sie die Proben mit 50% Glycerin in PBS.

4. Die konfokale Analyse

1. Beachten Sie die ganze Berg Embryo und den Abschnitt mit einem konfokalen Mikroskop mit 10X / 0.5 und 20x / 0,75 Objektiv.
2. Zur gleichzeitigen Detektion der Fluoreszenz und dem 3β-Hsd Färbung, stellen Sie den mehrspurigen Modus wie folgt: 488 nm Argon-Laser und 505-530 nm-Bandpassfilter für die Detektion von GFP; 543 nm Helium-Neon-Laser und 560-615 nm-Bandpassfilter für den Nachweis von mCherry; und Lichtkanal für den Nachweis von 3β-Hsd Färbung übertragen.Die Pinholegröße 1 Airey Einheit und die Auflösung beträgt 1.024 x 1.024 Pixel.
3. Montieren Sie die z-Stacks (mit 6 & mgr; m-Intervall) als 3D-Projektion und verschmelzen die Projektion und das Hellfeld, mit Hilfe der eingebauten in der konfokalen Software.

Results

Um zu bestimmen , wie die steroidogenen Interrenal- Gewebe codevelops mit der pronephric Niere Glomeruli und seiner im Entstehen begriffenen Gefäße, die 3β -HSD enzymatische Aktivität Assay auf der doppelt transgenen Tg (wt1b: GFP) durchgeführt wurde , ^LI1; Tg (kdrl: mCherry) ^CI5 Embryo bei 34 HPF (Abbildung 1). In diesem Stadium wird die 3β-HSD-positive steroidogenen Gewebe rechts der Mittellinie liegt und unmittelbar kaudal der N...

Discussion

Die Signalstärke des 3β -HSD-Aktivität erhöht sich im Laufe der Reaktion. Klare Signale der 3β-HSD wurden nach 4 Stunden Reaktions für die Stufen von 28 HPF weiter erkannt. Jedoch erfordert die Reaktionsdauer empirische Bestimmung, abhängig von dem Zweck des Assays. In Fällen, in denen die Färbung über Nacht Verarbeitung erfordert, neigt eine leicht bläuliche Hintergrund auf den Proben zu entwickeln. Dieses Problem kann durch Erhöhen der Fixationsdauer (beispielsweise 4 Stunden in 4% PFAT bei RT) vor der 3β-Hsd...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Konfokalmikroskop	Carl Zeiss	LSM510
DMSO	Sigma	D8418
Glycerol	USB	US16374
Hyclone Fetal Calf Serum	GE Healthcare Life Sciences	SH30073
Nicotinamid	Sigma	N0636
β-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Hydrat	Sigma	N1636
4-Nitroblau-Tetrazolium	Promega	S380C
Nusieve GTG	Lonza	50081
Paraformaldehyd	Sigma	P6148
Phenylthioharnstoff	sigma	P7629
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Sigma	P4417-100Tab
PYREX Spot Plate	Corning	7220-85
Riffsalz	AZOO	AZ28001
trans-Dehydroandrosteron	Sigma	D4000
Triton X-100	Sigma	T8787
Tween 20	Sigma	P9416
Vibratome	Leica	VT1000M