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Methodenartikel

Biofilmentfernung Kohlendioxid Aerosols Verwendung ohne Stickstoffspülung

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⸱

DOI:

10.3791/54827

⸱

6. November 2016

 , 
1School of Mechanical and Nuclear Engineering, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Biofilme auf Oberflächen können effektiv und schnell entfernt werden, indem ein periodischer Strahl von Kohlendioxid-Aerosolen ohne Stickstoffspülung verwendet wird.

Zusammenfassung

Biofilme können in vielen Anwendungen ernsthafte Bedenken aufwerfen. Sie können nicht nur wirtschaftliche Verluste verursachen, sondern auch eine Gefahr für die öffentliche Gesundheit darstellen. Daher ist es sehr wünschenswert, Biofilme von Oberflächen zu entfernen. In vielen Studien zur Reinigung von CO2 -Aerosolen wurden Stickstoffspülungen eingesetzt, um die Effizienz der Biofilmentfernung zu erhöhen, indem die während der Reinigung entstehende Feuchtigkeitskondensation reduziert wird. In dieser Studie wurden jedoch periodische Strahlen von CO2 -Aerosolen ohne Stickstoffspülungen verwendet, um Pseudomonas putida-Biofilme von polierten Edelstahloberflächen zu entfernen. CO2 -Aerosole sind Gemische aus festem und gasförmigem CO2 -Aerosole entstehen, die entstehen, wennHochdruckgas adiabatisch durch eine Düse expandiert wird. Diese Hochgeschwindigkeits-Aerosole wurden auf einen Biofilm aufgebracht, der 24 Stunden lang gezüchtet worden war. Die Entfernungseffizienz lag zwischen 90,36 % und 98,29 % und wurde durch Messung der Fluoreszenzintensität des Biofilms bewertet, wobei die Behandlungszeit von 16 Sekunden bis 88 Sekunden variiert wurde. Wir führten auch Experimente durch, um die Abscheidegrade mit und ohne Stickstoffspülungen zu vergleichen. Die gemessenen Wirkungsgrade der Biofilmentfernung unterschieden sich nicht signifikant voneinander (t-Test, P > 0,55). Daher kann diese Technik verwendet werden, um verschiedene biologisch kontaminierte Oberflächen innerhalb einer Minute zu reinigen.

Einleitung

Biofilme sind komplexe bakterielle Gemeinschaftsstrukturen, in denen Bakterienzellen in selbst produzierte Matrizen aus extrazellulären polymeren Substanzen eingebettet, zusammengehalten und vor der äußeren Umgebung geschützt sind. Biofilme können ein Risiko für die öffentliche Gesundheit darstellen und wirtschaftliche Verluste verursachen, da sie sich auf verschiedenen Oberflächen bilden können, einschließlich medizinischer Implantatmaterialien und -geräte, Lebensmittelverarbeitungsanlagen und Wärmetauschern. Tatsächlich wurde festgestellt, dass Biofilme mit 65 % aller bakteriellen Infektionskrankheiten beim Menschen in Verbindung gebracht werden, so die Centers for Disease Control and Prevention1.

Autoklaven und Desinfektionsmittel wie Chlor wurden im Allgemeinen zur Inaktivierung von Biofilmen verwendet. Der Einsatz eines Autoklaven ist jedoch bei Oberflächen eingeschränkt, die weder Hochtemperaturdampf standhalten noch in den Autoklaven gestellt werden können. Desinfektionsmittel sind nicht für Oberflächen geeignet, die empfindlich auf chemische Behandlung reagieren oder zur Ansammlung giftiger Oxidationsprodukte neigen2. Darüber hinaus sollte der Biofilm nicht nur inaktiviert, sondern auch entfernt werden, um zu verhindern, dass sich neue Zellen an die Oberfläche anheften und dadurch ein neuer Biofilm3 bildet. Es ist jedoch schwierig, Biofilme mit Methoden zu entfernen, die auf viskoser Flüssigkeitsscherung basieren, da die Strömungsgeschwindigkeit in Oberflächennähe nahezu Null beträgt und die Scherkraft die Adhäsionskräfte von mikron- und submikrometergroßen Substanzen in der Regel nicht überwinden kann. Darüber hinaus ist bekannt, dass die Biofilmmatrix als physikalische und chemische Barriere wirkt1.

Viele physikalische und mechanische Techniken wurden entwickelt, um Biofilme von Oberflächen zu entfernen, einschließlich Ultraschallschwingungen1, elektrische Ströme4, Laserbestrahlung5 und Hochdruckwassersprays6. Jede Technik hat ihre eigenen Vor- und Nachteile. Ultraschallvibrationen und elektrischer Strom können verwendet werden, um die Bildung von Biofilmen zu steuern. Sie erfordern jedoch eine bestimmte Konfiguration bzw. leitfähige Oberflächen, die eine zusätzliche Schubspannung1, 4 erfordern. Die Laserbestrahlung kann auf einen begrenzten Bereich und auf harte Oberflächen angewendet werden. Einige lebende und tote Zellen verbleiben jedoch auf der Oberfläche5. Hochdruckwassersprays entfernen effektiv Biofilme; Ihr hoher Impuls kann jedoch zu Schäden an weichen Substratenführen 6.

Die Entfernung von Biofilmen mit CO2 -Aerosolen wurde bereits vorgeschlagen. Es hat vielversprechende Ergebnisse gezeigt, mit hohen Abscheidegraden innerhalb kurzer Zeit7-11. CO2 -Aerosole werden durch adiabatische Expansion eines Hochdruck-CO2 -Gases durch eine Düse erzeugt und auf die mit einem Biofilm kontaminierten Oberflächen aufgebracht. Diese Reinigungstechnik nutzt die Impulsübertragung von festen CO2 -Partikeln und die Lösungsmittelwirkung der geschmolzenen CO2 -Flüssigkeiten, gefolgt von der aerodynamischen Scherkraft des CO2 -Gases12. Im Vergleich zu Hochdruck-N2-Gasstrahlen sind CO2 -Aerosolstrahlen bei gleichem Stagnationsdruck viel effektiver bei der Entfernung von E. coli-Biofilmen 7. Obwohl der Impuls des festen CO2 , der an die Bakterien abgegeben wird, beträchtlich hoch ist, ist der Impuls des gesamten Aerosolstrahls, der auf die feste Oberfläche angewendet wird, wesentlich geringer als der von Wasserstrahlen. Daher ist mit dieser CO2 -Aerosoltechnik eine beschädigungsfreie Reinigung möglich.

In diesem Protokoll wurden periodische Strahlen von CO2 -Aerosolen ohne Stickstoffspülungen verwendet, um Pseudomonas putida Biofilme von einer polierten Edelstahloberfläche zu entfernen. In der Tat wurden Stickstoffspülungen in vielen CO2 -Aerosolstudien eingesetzt, um die Abscheideeffizienz zu erhöhen, indem die während der Reinigung erzeugte Feuchtigkeitskondensation reduziert wurde, obwohl auch das Heizen mit einer Heizplatte oder Infrarotlampen und der Einsatz von Trockenboxen eingeführt wurden12. Im Folgenden werden die Oberflächenbiofilmbildung und die optimierten Reinigungsverfahren beschrieben. Die Entfernungseffizienz wurde durch Messung der Fluoreszenzintensität des Biofilms auf der Oberfläche bewertet.

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Protokoll

1. Vorbereitung der Oberfläche für die Bildung von Biofilmen

  1. Cut 1 mm dicken 304 Edelstahlplatten in Chips (10 × 10 mm 2) mit einem mechanischen Schneider.
  2. Führen Ultraschallreinigung der Chips in Aceton, Methanol und deionisiertem (DI) Wasser nacheinander für jeweils 10 min. Verwenden, um einen lösungsmittelbeständigen Behälter, die aus Substanzen wie Glas, organische Verunreinigungen zu entfernen.
  3. Spülen Sie die Chips mit DI-Wasser für 3-5 sec fließt.
  4. Trocknen Sie die Chips N 2 Gasfluss für 3-5 sec verwenden.

2. Herstellung der Bakterien-Kultur

  1. Nehmen Sie einen P. putida KT2440 (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Sung Kuk Lee, UNIST, Südkorea) Lager gelagert in einem -80 ° C Gefrierschrank.
  2. Tauen Sie nach 1 min bei Raumtemperatur und die obere Schicht der gefrorenen Stammlösung wird zu Matsch. Tauchen Sie eine Schleife in die geschmolzene Schicht der Stammlösung.
  3. Verwenden Sie diese Schleife zu Streifen, die Bakterien auf eine Luria-Bertani (LB) Platte, die 1,5% Agar.
  4. Die Platte über Nacht bei 30 ° C, um die Bakterienkolonien wachsen.
  5. Wählen Sie eine einzelne Kolonie von der Platte eine frische Schleife.
  6. Beimpfen von 10 ml LB-Brühe in einem 50 ml konischen Röhrchen mit der Schleife die einzelnen Bakterienkolonie enthält.
  7. Inkubieren Sie die Brühe in einem Schüttel-Inkubator für 16 Stunden bei 30 ° C und 160 Umdrehungen pro Minute.

3. Bildung von Biofilmen auf der Oberfläche

  1. Pick-up jeder der hergestellten Chips mit einer Pinzette und tauchen sie in 70% Ethanol 5 mal für 1-2 sec je, um die Oberfläche jedes Chips zu sterilisieren. Stellen Sie sicher, dass die Chips mit einer Pinzette während des Eintauchens gehalten werden.
  2. Tauchen Sie jeden Chip in autoklavierten DI-Wasser und in LB-Brühe sequentiell, 5-mal für 1-2 sec je, um die verbleibenden Ethanol zu entfernen.
  3. Legen Sie diese Chips in 6-Well-Kulturplatten mit 2 Chips und 5 ml LB-Medium pro Vertiefung.
  4. Verdünne die Bakterienkultur, bis die Konzentration in der LB-Brühe Lauf8 × 10 8 Zellen / ml (optische Dichte bei 600 nm Wellenlänge: ~ 0.8).
  5. Impfen jede Vertiefung mit 50 ul der verdünnten Bakterienkultur.
  6. Inkubiere die Platten bei 30 ° C ohne von Biofilmen für 24 h zur Bildung Schütteln.

4. CO 2 Aerosol Reinigung

  1. Tauchen Sie die Biofilm-gebildeten Chips in 10 mM Ammoniumacetat-Puffer (flüchtig) 5-mal zu entfernen lose befestigt und planktonischen Bakterien.
  2. Trocknen Sie diese Chips in einem Bio-Sicherheitsschrank, wo die Luft mild fließt.
  3. Unmittelbar nach dem Trocknen, stellen einen Chip auf dem Ladeplatz, der sich entlang der Achse des Strahls 20 mm von der Düse CO 2 ist. Kippen Sie die Strahlachse auf einen Winkel von 40 °.
  4. Stellen Sie die Staudrücke von CO 2 und N 2 -Gas auf 5,3 MPa und 0,7 MPa bzw. Gasdruckregler verwendet wird .
  5. Wenden Sie den Aerosolstrahl auf den zentralen Teil des Chips. Weiß Aerosole einschließlich der festen CO 2 solltesichtbar sein. Schalten "auf" das Magnetventil für CO 2 für 5 Sekunden, und schalten Sie es "off" für 3 sec (Zyklus: 8 sec) in regelmäßigen Abständen einen manuell gesteuerten Schalter. Wenn eine Stickstoff - Spülung verwendet werden muss, schalten das Magnetventil für eine kontinuierliche Zufuhr von N 2.
  6. Behandeln Sie die Chips mit CO 2 Aerosole für 16, 40 und 88 sec mit und ohne Stickstoffspülungen. Bewahren Sie Chips ohne Behandlung als negative Kontrollen.

5. Analyse für Abscheideleistung

  1. Bereiten 1 uM grüne Fluoreszenz Nukleinsäurefarbstoff (Anregungs- / Emissionswellenlänge: 480/500 nm) in DI-Wasser zu Bakterienzellen an der Steuerung und Aerosol behandelten Späne färben.
  2. Legen Sie die Chips in der Färbungslösung.
  3. Inkubieren der Chips in einem Inkubator ohne Licht bei 37 ° C für 30 min.
  4. Im Anschluss an die Inkubation spülen Sie vorsichtig die Chips mit DI-Wasser fließt übermäßige fluoreszierenden Farbstoff zu entfernen.
  5. Trocknen Sie die Chips with N 2 Gasstrom.
  6. Nehmen Sie fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von 5 zufällige Sichtfelder (321 × 240 & mgr; m 2) für jeden Chip ein Epifluoreszenz - Mikroskop mit einer 40 - fach Objektivlinse und einer CCD - Kamera.
  7. Besorgen Sie sich die Fluoreszenzintensität für jedes Bild eine Bildverarbeitungssoftware wie ImageJ. In ImageJ und nutzen die "Subtract Background" -Funktion im Menü "Bearbeiten" und wählen Sie "Integrierte Dichte" in der "Set Messungen" Fenster in der "Analyse" -Menü. Haben die "Messung" im "Analyze" Menü, um die Fluoreszenzintensität zu erhalten.
  8. Berechnen Sie die Biofilmentfernungseffizienz nach der folgenden Formel: 100% × (I Kontrolle Chips - ich der behandelten Chips) / (I von Kontroll - Chips), wo ich die berechneten Fluoreszenzintensität ist.
  9. Besorgen Sie sich die durchschnittliche Abscheidegrade und Standardabweichungen. Verwenden Sie beimindestens 4-Chips für jeden Fall.

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Ergebnisse

CO 2 Aerosole wurden verwendet , um die zu entfernen , P. putida Biofilme aus SUS304 Flächen (Abbildung 1). Die meisten der Oberflächen wurden mit dem Biofilm nach 24 h Wachstum bedeckt. Der größte Teil des Biofilms wurde mit der CO 2 Aerosole (Abbildung 2) entfernt. Wie erwartet, 3 zeigt einen Anstieg der Biofilm - Entfernungseffizienz als die erhöhte Aerosolbehandlungszeit CO 2. Für die Behandlungszeit von 88 sec wurde die Ent...

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Diskussion

Zuvor haben wir Optimierungsstudien zum CO2 -Gasdruck, zum Strahlwinkel und zum Abstand zur festen Oberfläche bei der Reinigung von CO2 -Aerosolen durchgeführt7. Im Gegensatz zu unseren vorherigen Studien war in der vorliegenden Studie eine Stickstoffspülung nicht im Aerosol enthalten (Abbildung 1). Darüber hinaus wurde in diesem Protokoll Edelstahl 304 verwendet, da er zu den gebräuchlichsten Edelstählen gehört und in der Lebensmittelindustrie weit verbreitet ist. Die po...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Forschung wurde vom Basic Science Research Program durch die National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, finanziert vom Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunftsplanung (# 2015R1A2A2A01006446).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Edelstahl 304Steelni
(Südkorea)		Polierte und gewürfelte Ultraschallreiniger
Branson
(USA)		5510E-DTH
Luria-Bertani (LB)Becton, Dickinson and Company
(USA)		244620500 g
AgarBecton, Dickinson and Company
(USA)		214010500 g
6-well KulturplatteSPL Life Sciences
(Südkorea)		32006
Ammoniumacetat-PufferSigma-Aldrich
(USA)		66740410 mM
Dual-Gas-EinheitApplied Surface Technologies
(USA)		K6-10DGEine Düse für CO2 Gas
& 8 Düsen für N2 Gas
SYTO9Thermo Fissher Scientific
(USA)		InvitrogenExcitaion: 480 nm
Emission: 500 nm
Epifluoreszenzmikroskop Nikon (Japan)Eclipse 80i
40X ObjektivNikon
(Japan)		Plan FluorNA: 0.75
CCD Kamera Photometrics
(USA)		Cool SNAP HQ2Monochrom

Referenzen

  1. Jain, A., Gupta, Y., Agrawal, R., Khare, P., Jain, S. K. Biofilms - A microbial life perspective: A critical review. Crit. Rev. Ther. Drug. 24 (5), 393-443 (2007).
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Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Pseudomonas putidaEdelstahloberflächenFluoreszenzmikroskopieAerosolbehandlungszeitEntfernungseffizienzDrei-Phasen-Reinigungbiokontaminierte Oberflächen
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