Entwicklung eines Systems Hepatitis-B-Virus Reporter den frühen Stadien des Replikationszyklus zu überwachen

Chronische Infektion mit dem Hepatitis - B - Virus (HBV) ist ein wichtiger Risikofaktor für chronische Lebererkrankungen ^1. Obwohl die derzeitigen therapeutischen Strategien auf Nukleotid - Analoga basieren, die HBV - pol Funktion und / oder die Verabreichung von Typ - I - Interferon hemmen , die diese Behandlungen können HBV nicht beseitigen Immunantworten bei infizierten Personen sowie indirekt Unterdrückung der HBV - Proliferation durch, ² Funktionen Interferon-stimulierte Gen aktiviert DNA vollständig ^3. Die Entstehung von HBVs Darüber hinaus, die Mittel anti-pol resistent sind von Belang ist ^4. Die Verabreichung der kombinierten antiviralen Mitteln direkt die verschiedenen Schritte des humanen Immundefizienz-Virus (HIV) oder Hepatitis-C-Virus (HCV) Lebenszyklus wurde Targeting gezeigt, erfolgreich zu unterdrücken oder den Virus (es) zu beseitigen. Ähnlich wie diese Idee, die Entwicklung von anti-HBV-Mittel (n), die direkt auf den verschiedenen Stufen des H handelnBV Lebenszyklus ist wichtig für die Zukunft HBV Therapien zu etablieren.

Im Allgemeinen erleichtert die Schaffung eines einfachen in vitro - Kultursystem des Zielvirus die Entwicklung von Antivirusmitteln. Es gibt jedoch mindestens zwei Hindernisse für die Entwicklung von in vitro Kultursystemen anti-HBV - Mittel zu screenen. Die erste ist das Fehlen einer geeigneten in vitro - Zellkultursystem für die HBV - Infektion / Proliferation. Im Gegensatz zu anderen Viren, wie HIV und HCV, die in etablierten Zelllinien vermehrt werden, ist es schwierig , HBV in vitro zu kultivieren , da der experimentellen Beschränkungen einschließlich einer engen Wirtsbereich. Die Verwendung von spezifischen Zellkultursystemen wie dem menschlichen Hepatom - Zelllinie HepaRG, die HBV - Infektion empfänglich ist, ^{5, 6, 7} wurden , um diese Probleme zu überwinden , entwickelt. Darüber hinaus PXB Zellen, isoliert von Urokinase-type - Plasminogen - Aktivator transgenen / SCID - Mäuse mit primären humanen Hepatozyten (PHH) geimpft wurden zu einer HBV - Infektion und Replikation ⁸ bis anfällig gezeigt. HBV-Replikationsniveaus in HepaRG sind jedoch abhängig von dem zellulären Differenzierungszustand nach der Kultur, die inkonsistente und nicht reproduzierbare Ergebnisse der HBV-Infektion / Replikation Niveaus führen kann. PXB wird häufig für HBV-Infektion Experimenten verwendet, sondern wird durch die Verfügbarkeit begrenzt. Ein Tetracyclin induzierbare Expressions HBV Zellinie HepAD38, wurde ebenfalls weit verbreitet HBV - Replikation zu untersuchen, aber dieses System erlaubt nur Auswertung nach der Transkription und nicht am Eingang Schritt des HBV - Infektion ^9. Vor kurzem hat die Identifizierung von Natriumtaurocholat cotransporting Polypeptid (NTCP) als funktioneller Rezeptor für HBV ¹⁰ die Entwicklung einer Variablen HBV Kultursystem erlaubt. Tatsächlich NTCP Expression in nicht-empfindlichen hepatocarcinoma Zellen wie Huh7 undHepG2 ermöglicht HBV - Infektion ¹⁰ und somit die Wahl der HBV empfänglichen Zelllinien expandiert wurde, sind viele der experimentellen Beschränkungen lösen. Das zweite Problem ist das Fehlen eines einfachen Testsystems HBV-Infektion und Replikation zu bewerten. Bewertung der HBV-Infektion wird in der Regel durch die Analyse von HBV-DNA, RNA und Proteinen durchgeführt. Allerdings Quantifizierung dieser Virusmarker ist zeitraubend, oft teuer und nicht immer einfach. Daher kann die Entwicklung eines einfachen Testsystems, wie beispielsweise ein Reporter-Gen verwendet, Probleme mit dem HBV-Assay-Systeme assoziiert überwinden.

Da jedoch die Genomgröße, die in einer HBV - Kapsid verpackt werden kann , ist begrenzt - weniger als 3,7 kb ¹¹ - die Größe eines Reportergens sollte so kurz wie möglich sein. Darüber hinaus ist die Anwesenheit von mehreren cis-Elemente über das Genom verstreut sind, die für die virale Replikation essentiell sind, begrenzt die verfügbaren Positionen in Einsetzen des Reportergens in das Genom. Mehrere Berichte haben fremde Gene einzuführen versucht, einschließlich HIV-1 Tat, grün fluoreszierendes Protein und DsRed, in das HBV - Genom ^{11, 12, 13.} Jedoch sind diese rekombinanten HBVs nicht nützlich für das Screening von HBV-Infektion / Replikation, oder der Hochdurchsatz-Screening von Faktoren HBV-Infektion / Replikation zu beeinflussen. Dies ist vor allem wegen der geringen Produktivität von rekombinanten Viren und die reduzierte Intensität der Reportergenexpression durch ineffiziente Virusproduktion verursacht.

Um diese Probleme zu überwinden, bauten wir einen Reporter HBV mit einer hohen Ausbeute an Virusproduktion. Dieses Virus ist sehr empfindlich für die Überwachung der frühen Phasen des HBV-Replikationszyklus von der Eingabe auf die Transkription. Um dies zu erreichen, wurde NanoLuc (NL) als Marker-Gen ausgewählt, weil es eine kleine (171 Aminosäuren) wurde entwickelt, lumineszente reporterclass = "xref"> 14. Außerdem ist NL etwa 150-fach heller als firefly oder Renilla-Luciferase und die Lumineszenzreaktion ist ATP-unabhängig, was darauf hindeutet, dass die falsche Trefferrate niedrig sein wird für die Hochdurchsatz-Screening. Die Produktionseffizienz des rekombinanten HBV beträgt etwa 1/5 der Mutter HBV und ähnliche Ebenen für frühere HBV rekombinanten Viren berichtet; jedoch überwindet die Helligkeit NL Virus Produktivitätsprobleme, so dass es für das Massenscreening von anti-HBV-Mittel verwendet werden.

Screening von anti-HBV-Mittel unter Verwendung von primären Hepatozyten, HepaRG, HepAD38 und NTCP transduzierten Hepatozyten können für das Screening von anti-HBV-Mittel durch herkömmliche Verfahren (n) nützlich sein. Jedoch das hier beschriebene System hat verschiedene Vorteile, wie einfache Handhabung, hohe Empfindlichkeit und geringe Kosten für das Screening. Diese Vorteile sind für Hochdurchsatz-Assays zu entwickeln und neue HBV Mittel für therapeutische Zwecke zu identifizieren.

1. Herstellung von rekombinanten HBV die Reporter-Protein kodiert

1. Herstellung von HepG2 - Zellen
   1. Bereiten Zellkulturmedium (Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 100 U / ml nicht-essentiellen Aminosäuren).
   2. Platte 4 x 10 ⁶ HepG2 - Zellen in einer 10-cm kollagenbeschichtete Schale in 10 ml des Kulturmediums am Tag vor der Transfektion. Inkubieren HepG2 - Zellen bei 37 ° C in einem befeuchteten 5% CO ₂ -Inkubator.
      HINWEIS: Bei ca. 4 x 10 ⁶ HepG2 - Zellen in einem 10 cm Kollagen-beschichtete Schale in 10 ml Kulturmedium plattiert sind, werden sie 70-90% konfluent am nächsten Tag.
2. Transfection
   1. Transfizieren HepG2 - Zellen mit 5 ug pUC1.2HBV delta epsilon ¹⁵ und 5 ug pUC1.2HBV / NL ¹⁵ eine Transfektion unter Verwendung vonReagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   2. Am nächsten Tag, entfernen Sie das Kulturmedium und 10 ml frisches Kulturmedium hinzuzufügen.
   3. Eine Woche nach der Transfektion übertragen das Kulturmedium, das rekombinante HBV in ein 50 ml-Röhrchen mit und gehen zu Schritt 1.3.1. 10 ml frisches Kulturmedium auf die Platte, die transfizierte Zellen enthalten.
      HINWEIS: Die Produktion des rekombinanten HBV wird 4 Wochen aufrechterhalten. Das Kulturmedium rekombinanter HBV enthält, kann für 1 Monat bei 4 ° C gelagert werden.
3. Reinigung rekombinanter HBV
   1. Entfernen Zelltrümmer aus dem Kulturmedium rekombinanter HBV durch Zentrifugation (2.300 × g für 5 min) enthält.
   2. Führen Sie den Überstand durch ein 0,45 um Membranfilter.
   3. Ein gleiches Volumen von 26% PEG / 1,5 M NaCl (Polyethylenglykol 6000: 130 g NaCl, 49 g, 1 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 und 5 ml 1 M HEPES, pH 7,6 in 500 ml) zu dem Kulturmedium enthaltend rekombinantesanft HBV und mischen. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C.
   4. Zentrifuge bei 2.300 xg für 20 min bei 4 ° C.
   5. Überstand verwerfen und lösen Sie das Pellet in 0,5 ml TNE (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
   6. Entfernen der Trümmer durch Zentrifugation bei 2.300 xg für 5 min.
   7. Belastung 0,5 ml TNE rekombinanten HBV auf 0,8 ml 20% Saccharose in TNE enthält.
   8. Zentrifuge bei 100.000 × g für 3 Stunden bei 15 ° C.
   9. Verwerfen, so viel von dem Überstand wie möglich, und das Pellet speichern. Resuspendieren in 1 ml serumfreiem DMEM pro 40 ml Kulturmedium zu starten.
   10. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C.
   11. Man filtriert durch ein 0,45 um-Filter. Bereiten Sie 0,5 ml Aliquots und bei -80 ° C.
       HINWEIS: Wenn Reporterprotein Kontamination des ursprünglichen Virusprobe beobachtet wird, reinigen das Virus durch Dichtegradientenzentrifugation Ultrazentrifugation von 5-30% Saccharose in TNE bei 100.000 × g für 2 Stunden, oder CsCl Dichte ins Gleichgewicht gebracht Zentrifugation from 1,1-1,6 g / ml bei 150.000 xg für 50 Std.

2. Infektion von rekombinanten HBV

1. Kultur HepG2 - Zellen stabil exprimieren NTCP (HepG2 / NTCP) ¹⁵ , das mit 10% FBS ergänzt HBV - Infektion in DMEM anfällig sind, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 250 ug / ml G-418 und 100 U / ml nicht - essentielle Aminosäuren bei 37 ° C in einem befeuchteten 5% CO ₂ -Inkubator.
2. Einen Tag vor der Infektion, Platte ca. 5 x 10 ⁴ HepG2 / NTCP Zellen ¹⁴ in eine 96-Well - Kollagen - beschichtete Platte in 0,1 ml Kulturmedium.
3. Thaw rekombinante HBV in einem 37 ° C Wasserbad, bis ein kleines Stück Eis in der Flasche bleiben.
4. Vorbereiten des Mediums für eine Infektion durch Vereinigen der folgenden: 10 & mgr; l von 40% PEG8000 in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), 2 & mgr; l Dimethylsulfoxid (DMSO), 10 ul rekombinanter HBV und 78 & mgr; l frisches Kulturmediumpro Well einer 96-Well-Platte.
5. 100 l rekombinanten HBV-Lösung in eine Vertiefung der 96-Well-Platte.
6. Einen Tag nach der Infektion, waschen Sie die infizierten Zellen 3-mal mit 300 & mgr; l PBS pro Vertiefung der verunreinigenden Reporterprotein aus der Virusfraktion zu entfernen.
7. Inkubieren infizierten Zellen in 200 ul Kulturmedium, das 2% DMSO für eine Woche oder weniger.

3. Analyse

1. Eine Woche nach der Infektion, waschen Sie die infizierten Zellen 3 mal mit PBS.
2. Zugabe von 50 & mgr; l Lysepuffer zu den infizierten Zellen.
3. Rock the Kulturplatte für 5 Minuten, und dann Zentrifuge bei 2000 xg für 5 min.
4. In 50 ul des Reportersubstrat in das Luminometer Platte.
5. In 20 ul Zelllysat zu einem Luminometer Platte das Reportersubstrat enthält. Mischen Sie durch kurzes Vortexen.
6. Die Platte wird in das Luminometer und initiieren ¹⁵ zu lesen.

Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung des HBV - Genoms transkribiert RNAs, Virusproteine und deren codierende Region auf dem Genom. Das Reportergen und seine Position in dem Genom sind ebenfalls angegeben. Abbildung 2 zeigt die HBV - Reporterplasmid und Helferplasmid das Reportergen enthält. Die pUC1.2HBV / NL Reporter wurde durch Deletieren Nukleotidpositionen 223-811 konstruiert von der Transkriptionsinitiationsstelle des precore mRNA von pUC1.2HBV 16 und dann das Reportergen einzufügen. Die pUC1.2HBVdelta mit Punktmutationen in der Enkapsidierungssignals Sequenz wurde durch ortsgerichtete Mutagenese PCR erzeugt. Reporter - Plasmid (pUC1.2HBV / NL) und Helferplasmid (pUC1.2HBVdelta) wurden mit HindIII und EcoRI verdaut und dann einer Gelelektrophorese unterworfen. Die erwarteten Bands, die 3,0 kb für das pUC - Plasmid und 3,5 kb für 1.2HBV / NL oder 1.2HBVdelta, sind in Figure 2B. Abbildung 3 zeigt HepG2 - Zellen NTCP infiziert mit rekombinanten HBV exprimiert. An HepG2-Zellen NTCP stabil exprimieren, HepG2-Zellen wurden transfiziert mit pcan-NTCP-myc-Codierung NTCP-myc und ein Neomycin-resistentes Gen herzustellen. G418-resistente Zellklone wurden ausgewählt und expandiert. Die HepG2-NTCP-myc-clone22 ist auf HBV-Infektion anfällig. Die Lysate von HepG2 oder HepG2-NTCP-myc-clone22 wurden Western-Blot unterzogen. NTCP ist ein Glykoprotein von 349 Aminosäuren, mit einer extrazellulären N-Terminus, die zwei N-gebundene Glykosylierungsstellen (Asn5 und Asn11). Die 43 kDa Bande von unglycosylierten NTCP und die 65 kDa - Bande von glykosylierten 10 sind in 3A dargestellt. HepG2-NTCP-myc-clone22 Zellen NTCP exprimieren, aber nicht HepG2-Zellen, waren anfällig für rekombinante HBV-Infektion. Figur 4 zeigt die Kinetik des Reportergens (A und B), Virus - RNA und DNA (A) -Spiegel in rekombinanten HBV-infizierten HepG2-NTCP-myc-Klons22 (A) oder primären humanen Hepatozyten (PHH) Zellen (B). Die Niveaus der HBV-RNA und Reporteraktivität wurden 3 Tage nach der Infektion in HepG2-NTCP-myc-clone22 oder PHH Zellen erhöht. Im Gegensatz dazu gab es keine Veränderung in der DNA-Niveaus auf 9 Tage nach der Infektion durch rekombinante HBV für die funktionelle Kern und pol defizient ist, die eine wichtige Rolle in der intrazellulären DNA-Replikation Stoffwechselweg haben. Abbildung 5 zeigt die Hemmung von rekombinanten HBV durch Hepatitis - B - Immunglobulin (HBIG), Heparin und IFN-β. Entry-Inhibitoren wie HBIG und Heparin stark unterdrückt die Reporteraktivität von weniger als 10% bei 75 U / ml und 150 U / ml jeweils, während IFN-β die Reporteraktivität von weniger als 50% bei 1.000 U / ml unterdrückt. Die inhibitorische Wirkung dieser Inhibitoren war dosisabhängig. Figur 6 zeigt den Lebenszyklus von HBV.

Fi Abbildung 1: Schematische Darstellung des HBV-Genoms und die relative Lage von Virus-RNA und Proteinen auf dem Genom. HBV-DNA wird durch einen Lichtbogen in schwarz dargestellt. Die Lage des Enhancer und Promotoren für die Transkription von Virus-RNAs auf den Lichtbogen ist in gelb dargestellt. Die Lage der viralen RNAs und Proteine ​​auf dem Genom sind durch Pfeile mit gepunkteten blauen Linien (RNA) und mit farbigen Pfeilen (Proteine) dargestellt sind. Virus - RNAs nach Größe unterschieden werden: 3,5 kb und 3,4 kb mRNAs zeigen precore / C und prägenomischen RNA / Kern bzw. 2,5 und 2,1 kb RNAs darstellen preS1 und preS2 / S sind, und das 0,8 kb RNA zeigt X - Gen 17. Ein Reporter-Gen wird durch die entsprechende Größe der Kern kodierenden Sequenz ersetzt. Das Reportergen wird von einem Kern-Promotor angetrieben Enhancer II. Pro: Promoter, EnhI / pro: Enhancer I / Promotor, EnhII / Pro: EnhancerII / Promotor, Pol: Polymerase, S: Oberflächenantigen. target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Schematische Darstellung zur Erzeugung von rekombinanten HBV. (A) Die blauen Linien zeigen die pregenome RNA. Die "A" stretch bedeutet Poly A am 3'-Terminus. Blaue Kästen zeigen die kodierende Region für jeden Virusprotein. Der rote Kasten zeigt ein Reporter-Gen von seinem eigenen Initiationscodon übersetzt. Der Reporter Plasmid kann nicht Precore und Pol, und das Helferplasmid mit 2 Mutationen im Enkapsidierungssignals (CTGTGCC zu CTATGTC) produzieren drückt alle HBV-Proteine. E: Enkapsidierungssignals. (B) Das Reporterplasmid, Helferplasmid und pUC - Plasmid wurden mit EcoRI und HindIII verdaut. Diese verdauten Plasmide wurden einer Gelelektrophorese unterzogen.ad / 54849 / 54849fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Die rekombinante HBV infiziert HepG2 exprimiert NTCP. (A) Eine stabile Zellinie NTCP exprimierte , wurde durch Transfektion von HepG2 Zellen mit einem Plasmid , codierend Myc-markiertes NTCP durch Selektion mit 500 ug / ml G418 für 3 Wochen gefolgt etabliert. Die Höhe der NTCP-Myc in HepG2 Zellen, die stabil NTCP exprimieren (HepG2-NTCP-Myc-clone22) Zellen wurde durch Western-Blot-Anti-Myc-Antikörper unter Verwendung bestimmt (1: 1000 Verdünnung). (B) HepG2-NTCP-Myc-clone22 Zellen wurden mit rekombinanten HBV in Gegenwart von 2% DMSO und 4% PEG8000 infiziert. Bei 72 Stunden nach der Infektion wurde das Niveau der Reporteraktivität durch Reporterassay bestimmt. Die Ergebnisse sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente und Fehlerbalken zeigen the Standardabweichungen der Mittel. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4: Zeitlicher Verlauf der rekombinanten HBV - Infektion. (A) HepG2-NTCP-Myc-clone22 Zellen wurden mit rekombinanten HBV in Gegenwart von 2% DMSO und 4% PEG8000 infiziert. Die Höhe der HBV-Infektion wurde bei drei von Reporteraktivität (schwarze Linie) bestimmt, 6 oder 9 Tage nach der Infektion. Levels von HBV - RNA (blaue Linie) und DNA (orange Linie) gemessen wurden gleichzeitig mittels RT-PCR und PCR 15, die jeweils an jeder Infektion Zeitpunkt. (B) Primäre humane Hepatozyten (PHH), isoliert vom Urokinase-Typ Plasminogenaktivator transgenen / SCID - Mäusen mit PHH inokuliert, die mit rekombinanten HBV in der Presenc infiziert warene von 2% DMSO und 4% PEG8000. Die Höhe der HBV-Infektion wurde bei 3, 6 durch Reporteraktivität bestimmt oder 9 Tage nach der Infektion. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5: Wirkung der bekannten anti-HBV - Mittel auf rekombinante HBV - Infektion. HepG2-NTCP-Myc-22-Zellen wurden mit rekombinanten HBV in Gegenwart von HBIG, Heparin und IFN-β in den Dosen angegeben, sowie 2% DMSO und 4% PEG8000 infiziert. Die Höhe der HBV - Replikation (A) und die Lebensfähigkeit der Zellen (B) wurde durch die Reporteraktivität 6 Tage nach der Infektion bestimmt. HBIG ist ein Antikörper, HBV-Infektion neutralisieren und Heparin ist ein Inhibitor für umhüllte Viren. Die Ergebnisse sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente, und Fehlerbalken zeigen die Standardabweichungen der Mittel. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6: Schematische Darstellung des HBV Lebenszyklus. HBV tritt in Zellen durch Virus-Rezeptoren einschließlich NTCP. Capsid-assoziierte entspannte zirkuläre DNA (rcDNA) unbeschichtet und umgewandelt kovalent geschlossene zirkuläre DNA (cccDNA) im Zellkern. cccDNA Funktionen als Matrize für mRNA Transkription. Die genomische RNA ist, um das Virus-Capsid eingekapselt durch mit Proteinen für Kern und pol Zusammenbauen. Bevor weiter mit HBS-Proteine ​​der Montage wird das Kapsid bei der Verstärkung der HBV-DNA durch einen Prozess beteiligt genannt cccDNA Replikationsprozess. Viruspartikel mit HBS Proteine ​​schließlich zusammengebaut sind außerhalb der Zelle freigesetzt.om / files / ftp_upload / 54849 / 54849fig6large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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