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Methodenartikel

Entwicklung eines Systems Hepatitis-B-Virus Reporter den frühen Stadien des Replikationszyklus zu überwachen

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DOI:

10.3791/54849

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1. Februar 2017

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1Research Center for Hepatitis and Immunology, National Center for Global Health and Medicine, 2Central Pharmaceutical Research Institute, Japan Tobacco Inc.

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier haben wir eine neu entwickelte Hepatitis B-Virus (HBV) Reportersystem beschreiben, die frühen Stadien des HBV-Lebenszyklus zu überwachen. Dieses in vitro System vereinfacht wird in das Screening von anti-HBV - Agenten unterstützen , eine Hochdurchsatz - Strategie.

Zusammenfassung

Derzeit ist es möglich, rekombinante Formen verschiedener Viren zu konstruieren, wie z.B. das humane Immundefizienzvirus 1 (HIV-1) und das Hepatitis-C-Virus (HCV), die fremde Gene wie einen Reporter oder ein Markerprotein in ihrem Genom tragen. Diese rekombinanten Viren ahmen in der Regel den Lebenszyklus des ursprünglichen Virus in infizierten Zellen originalgetreu nach und weisen die gleiche Abhängigkeit vom Wirtsbereich auf. Die Entwicklung eines rekombinanten Virus ermöglicht ein effizientes Screening von Inhibitoren und die Identifizierung spezifischer Wirtsfaktoren. Bisher war die Konstruktion des rekombinanten Hepatitis-B-Virus (HBV) jedoch aufgrund verschiedener experimenteller Einschränkungen schwierig. Die Haupteinschränkung ist die kompakte Genomgröße von HBV und eine ziemlich strenge Genomgröße, die 1,3 Genomgrößen nicht überschreitet und in Virionen verpackt werden muss. So sollte die Größe eines einzufügenden fremden Gens kleiner als 0,4 kb sein, wenn keine Deletion der Genom-DNA durchgeführt werden soll. Um diese Größenbeschränkung zu überwinden, ist daher die Deletion eines Teils der HBV-DNA erforderlich. In dieser Arbeit berichten wir über die Konstruktion von rekombinantem HBV, das für ein Reportergen kodiert, um das frühe Stadium des HBV-Replikationszyklus zu überwachen, indem ein Teil der HBV-Kern-kodierenden Region durch das Reportergen ersetzt wird, indem ein Teil der HBV-Pol-kodierenden Region gelöscht wird. Der Nachweis einer rekombinanten HBV-Infektion, der durch die Reporteraktivität überwacht wurde, war hochsensitiv und kostengünstiger als der Nachweis mit den derzeit verfügbaren konventionellen Methoden zur Bewertung der HBV-Infektion. Dieses System wird für eine Reihe von Anwendungen nützlich sein, einschließlich des Hochdurchsatz-Screenings zur Identifizierung von Anti-HBV-Inhibitoren, Wirtsfaktoren und virusanfälligen Zellen.

Einleitung

Chronische Infektion mit dem Hepatitis - B - Virus (HBV) ist ein wichtiger Risikofaktor für chronische Lebererkrankungen 1. Obwohl die derzeitigen therapeutischen Strategien auf Nukleotid - Analoga basieren, die HBV - pol Funktion und / oder die Verabreichung von Typ - I - Interferon hemmen , die diese Behandlungen können HBV nicht beseitigen Immunantworten bei infizierten Personen sowie indirekt Unterdrückung der HBV - Proliferation durch, 2 Funktionen Interferon-stimulierte Gen aktiviert DNA vollständig 3. Die Entstehung von HBVs Darüber hinaus, die Mittel anti-pol resistent sind von Belang ist 4. Die Verabreichung der kombinierten antiviralen Mitteln direkt die verschiedenen Schritte des humanen Immundefizienz-Virus (HIV) oder Hepatitis-C-Virus (HCV) Lebenszyklus wurde Targeting gezeigt, erfolgreich zu unterdrücken oder den Virus (es) zu beseitigen. Ähnlich wie diese Idee, die Entwicklung von anti-HBV-Mittel (n), die direkt auf den verschiedenen Stufen des H handelnBV Lebenszyklus ist wichtig für die Zukunft HBV Therapien zu etablieren.

Im Allgemeinen erleichtert die Schaffung eines einfachen in vitro - Kultursystem des Zielvirus die Entwicklung von Antivirusmitteln. Es gibt jedoch mindestens zwei Hindernisse für die Entwicklung von in vitro Kultursystemen anti-HBV - Mittel zu screenen. Die erste ist das Fehlen einer geeigneten in vitro - Zellkultursystem für die HBV - Infektion / Proliferation. Im Gegensatz zu anderen Viren, wie HIV und HCV, die in etablierten Zelllinien vermehrt werden, ist es schwierig , HBV in vitro zu kultivieren , da der experimentellen Beschränkungen einschließlich einer engen Wirtsbereich. Die Verwendung von spezifischen Zellkultursystemen wie dem menschlichen Hepatom - Zelllinie HepaRG, die HBV - Infektion empfänglich ist, 5, 6, 7 wurden , um diese Probleme zu überwinden , entwickelt. Darüber hinaus PXB Zellen, isoliert von Urokinase-type - Plasminogen - Aktivator transgenen / SCID - Mäuse mit primären humanen Hepatozyten (PHH) geimpft wurden zu einer HBV - Infektion und Replikation 8 bis anfällig gezeigt. HBV-Replikationsniveaus in HepaRG sind jedoch abhängig von dem zellulären Differenzierungszustand nach der Kultur, die inkonsistente und nicht reproduzierbare Ergebnisse der HBV-Infektion / Replikation Niveaus führen kann. PXB wird häufig für HBV-Infektion Experimenten verwendet, sondern wird durch die Verfügbarkeit begrenzt. Ein Tetracyclin induzierbare Expressions HBV Zellinie HepAD38, wurde ebenfalls weit verbreitet HBV - Replikation zu untersuchen, aber dieses System erlaubt nur Auswertung nach der Transkription und nicht am Eingang Schritt des HBV - Infektion 9. Vor kurzem hat die Identifizierung von Natriumtaurocholat cotransporting Polypeptid (NTCP) als funktioneller Rezeptor für HBV 10 die Entwicklung einer Variablen HBV Kultursystem erlaubt. Tatsächlich NTCP Expression in nicht-empfindlichen hepatocarcinoma Zellen wie Huh7 undHepG2 ermöglicht HBV - Infektion 10 und somit die Wahl der HBV empfänglichen Zelllinien expandiert wurde, sind viele der experimentellen Beschränkungen lösen. Das zweite Problem ist das Fehlen eines einfachen Testsystems HBV-Infektion und Replikation zu bewerten. Bewertung der HBV-Infektion wird in der Regel durch die Analyse von HBV-DNA, RNA und Proteinen durchgeführt. Allerdings Quantifizierung dieser Virusmarker ist zeitraubend, oft teuer und nicht immer einfach. Daher kann die Entwicklung eines einfachen Testsystems, wie beispielsweise ein Reporter-Gen verwendet, Probleme mit dem HBV-Assay-Systeme assoziiert überwinden.

Da jedoch die Genomgröße, die in einer HBV - Kapsid verpackt werden kann , ist begrenzt - weniger als 3,7 kb 11 - die Größe eines Reportergens sollte so kurz wie möglich sein. Darüber hinaus ist die Anwesenheit von mehreren cis-Elemente über das Genom verstreut sind, die für die virale Replikation essentiell sind, begrenzt die verfügbaren Positionen in Einsetzen des Reportergens in das Genom. Mehrere Berichte haben fremde Gene einzuführen versucht, einschließlich HIV-1 Tat, grün fluoreszierendes Protein und DsRed, in das HBV - Genom 11, 12, 13. Jedoch sind diese rekombinanten HBVs nicht nützlich für das Screening von HBV-Infektion / Replikation, oder der Hochdurchsatz-Screening von Faktoren HBV-Infektion / Replikation zu beeinflussen. Dies ist vor allem wegen der geringen Produktivität von rekombinanten Viren und die reduzierte Intensität der Reportergenexpression durch ineffiziente Virusproduktion verursacht.

Um diese Probleme zu überwinden, bauten wir einen Reporter HBV mit einer hohen Ausbeute an Virusproduktion. Dieses Virus ist sehr empfindlich für die Überwachung der frühen Phasen des HBV-Replikationszyklus von der Eingabe auf die Transkription. Um dies zu erreichen, wurde NanoLuc (NL) als Marker-Gen ausgewählt, weil es eine kleine (171 Aminosäuren) wurde entwickelt, lumineszente reporterclass = "xref"> 14. Außerdem ist NL etwa 150-fach heller als firefly oder Renilla-Luciferase und die Lumineszenzreaktion ist ATP-unabhängig, was darauf hindeutet, dass die falsche Trefferrate niedrig sein wird für die Hochdurchsatz-Screening. Die Produktionseffizienz des rekombinanten HBV beträgt etwa 1/5 der Mutter HBV und ähnliche Ebenen für frühere HBV rekombinanten Viren berichtet; jedoch überwindet die Helligkeit NL Virus Produktivitätsprobleme, so dass es für das Massenscreening von anti-HBV-Mittel verwendet werden.

Screening von anti-HBV-Mittel unter Verwendung von primären Hepatozyten, HepaRG, HepAD38 und NTCP transduzierten Hepatozyten können für das Screening von anti-HBV-Mittel durch herkömmliche Verfahren (n) nützlich sein. Jedoch das hier beschriebene System hat verschiedene Vorteile, wie einfache Handhabung, hohe Empfindlichkeit und geringe Kosten für das Screening. Diese Vorteile sind für Hochdurchsatz-Assays zu entwickeln und neue HBV Mittel für therapeutische Zwecke zu identifizieren.

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Protokoll

1. Herstellung von rekombinanten HBV die Reporter-Protein kodiert

  1. Herstellung von HepG2 - Zellen
    1. Bereiten Zellkulturmedium (Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 100 U / ml nicht-essentiellen Aminosäuren).
    2. Platte 4 x 10 6 HepG2 - Zellen in einer 10-cm kollagenbeschichtete Schale in 10 ml des Kulturmediums am Tag vor der Transfektion. Inkubieren HepG2 - Zellen bei 37 ° C in einem befeuchteten 5% CO 2 -Inkubator.
      HINWEIS: Bei ca. 4 x 10 6 HepG2 - Zellen in einem 10 cm Kollagen-beschichtete Schale in 10 ml Kulturmedium plattiert sind, werden sie 70-90% konfluent am nächsten Tag.
  2. Transfection
    1. Transfizieren HepG2 - Zellen mit 5 ug pUC1.2HBV delta epsilon 15 und 5 ug pUC1.2HBV / NL 15 eine Transfektion unter Verwendung vonReagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    2. Am nächsten Tag, entfernen Sie das Kulturmedium und 10 ml frisches Kulturmedium hinzuzufügen.
    3. Eine Woche nach der Transfektion übertragen das Kulturmedium, das rekombinante HBV in ein 50 ml-Röhrchen mit und gehen zu Schritt 1.3.1. 10 ml frisches Kulturmedium auf die Platte, die transfizierte Zellen enthalten.
      HINWEIS: Die Produktion des rekombinanten HBV wird 4 Wochen aufrechterhalten. Das Kulturmedium rekombinanter HBV enthält, kann für 1 Monat bei 4 ° C gelagert werden.
  3. Reinigung rekombinanter HBV
    1. Entfernen Zelltrümmer aus dem Kulturmedium rekombinanter HBV durch Zentrifugation (2.300 × g für 5 min) enthält.
    2. Führen Sie den Überstand durch ein 0,45 um Membranfilter.
    3. Ein gleiches Volumen von 26% PEG / 1,5 M NaCl (Polyethylenglykol 6000: 130 g NaCl, 49 g, 1 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 und 5 ml 1 M HEPES, pH 7,6 in 500 ml) zu dem Kulturmedium enthaltend rekombinantesanft HBV und mischen. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C.
    4. Zentrifuge bei 2.300 xg für 20 min bei 4 ° C.
    5. Überstand verwerfen und lösen Sie das Pellet in 0,5 ml TNE (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
    6. Entfernen der Trümmer durch Zentrifugation bei 2.300 xg für 5 min.
    7. Belastung 0,5 ml TNE rekombinanten HBV auf 0,8 ml 20% Saccharose in TNE enthält.
    8. Zentrifuge bei 100.000 × g für 3 Stunden bei 15 ° C.
    9. Verwerfen, so viel von dem Überstand wie möglich, und das Pellet speichern. Resuspendieren in 1 ml serumfreiem DMEM pro 40 ml Kulturmedium zu starten.
    10. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C.
    11. Man filtriert durch ein 0,45 um-Filter. Bereiten Sie 0,5 ml Aliquots und bei -80 ° C.
      HINWEIS: Wenn Reporterprotein Kontamination des ursprünglichen Virusprobe beobachtet wird, reinigen das Virus durch Dichtegradientenzentrifugation Ultrazentrifugation von 5-30% Saccharose in TNE bei 100.000 × g für 2 Stunden, oder CsCl Dichte ins Gleichgewicht gebracht Zentrifugation from 1,1-1,6 g / ml bei 150.000 xg für 50 Std.

2. Infektion von rekombinanten HBV

  1. Kultur HepG2 - Zellen stabil exprimieren NTCP (HepG2 / NTCP) 15 , das mit 10% FBS ergänzt HBV - Infektion in DMEM anfällig sind, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 250 ug / ml G-418 und 100 U / ml nicht - essentielle Aminosäuren bei 37 ° C in einem befeuchteten 5% CO 2 -Inkubator.
  2. Einen Tag vor der Infektion, Platte ca. 5 x 10 4 HepG2 / NTCP Zellen 14 in eine 96-Well - Kollagen - beschichtete Platte in 0,1 ml Kulturmedium.
  3. Thaw rekombinante HBV in einem 37 ° C Wasserbad, bis ein kleines Stück Eis in der Flasche bleiben.
  4. Vorbereiten des Mediums für eine Infektion durch Vereinigen der folgenden: 10 & mgr; l von 40% PEG8000 in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), 2 & mgr; l Dimethylsulfoxid (DMSO), 10 ul rekombinanter HBV und 78 & mgr; l frisches Kulturmediumpro Well einer 96-Well-Platte.
  5. 100 l rekombinanten HBV-Lösung in eine Vertiefung der 96-Well-Platte.
  6. Einen Tag nach der Infektion, waschen Sie die infizierten Zellen 3-mal mit 300 & mgr; l PBS pro Vertiefung der verunreinigenden Reporterprotein aus der Virusfraktion zu entfernen.
  7. Inkubieren infizierten Zellen in 200 ul Kulturmedium, das 2% DMSO für eine Woche oder weniger.

3. Analyse

  1. Eine Woche nach der Infektion, waschen Sie die infizierten Zellen 3 mal mit PBS.
  2. Zugabe von 50 & mgr; l Lysepuffer zu den infizierten Zellen.
  3. Rock the Kulturplatte für 5 Minuten, und dann Zentrifuge bei 2000 xg für 5 min.
  4. In 50 ul des Reportersubstrat in das Luminometer Platte.
  5. In 20 ul Zelllysat zu einem Luminometer Platte das Reportersubstrat enthält. Mischen Sie durch kurzes Vortexen.
  6. Die Platte wird in das Luminometer und initiieren 15 zu lesen.

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Ergebnisse

Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung des HBV - Genoms transkribiert RNAs, Virusproteine und deren codierende Region auf dem Genom. Das Reportergen und seine Position in dem Genom sind ebenfalls angegeben. Abbildung 2 zeigt die HBV - Reporterplasmid und Helferplasmid das Reportergen enthält. Die pUC1.2HBV / NL Reporter wurde durch Deletieren Nukleotidpositionen 223-811 konstruiert von der Transkriptionsinitiationsstelle des precore mRNA von pUC1.2H...

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Diskussion

Das HBV - Genom hat vier primäre offene Leserahmen (ORFs) , einschließlich des Kerns, Polymerase, Oberflächen und X ORFs (Abbildung 1). Die Transkription dieser vier HBV ORFs dicht durch vier Promotoren reguliert wird: die Precore / Kern - Promotor - Enhancer enthält , II, S1 - Promotor, S2 Promotor und X - Promotor enthält Enhancer I 18. Die 3,5 kb und 3,4 kb mRNAs werden in Precore und Core Proteine ​​übersetzt sind. Die große Hüllprotein (L) von der größten subgenomischen mRNA...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise durch das Forschungsprogramm für Hepatitis der Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) und durch Grants-in-Aids für wissenschaftliche Forschung des japanischen Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Nano-Glo Luciferase Assay RegentPromegaN1110
Penicillin-Streptomycin MischlösungNacalai tesque09367-34 
MEM Lösung für nicht-essentielle AminosäurenThermo FisherScientific 11140050
DMEMThermo Fisher Scientific11995065
Opti-MEM I Reduziertes Serum MediumThermo FisherScientific 31985070
100 mm/kollagenbeschichtete SchaleIwaki4020-010
Lipofectamine 3000 TransfektionsreagenzThermo Fisher ScientificL3000001 
Polyethylenglykol (PEG) 6000 Sigma-Aldrich81255
Polyethylenglykol (PEG) 8000 Sigma-Aldrich89510
NaClNacalai tesque31319-45 
0,5 mol/L EDTA LösungNacalai tesque06894-14
Tris-HClNacalai tesque35434-21
Millex-HP, 0,45 μ m, Polyethethersulfon, FilterMerck MilliporeSLHP033RS
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma-AldrichD2650
Kollagenbeschichtete 96-Well-PlatteCorningNO3585
Passive Lyse 5x PufferPromegaE1941
GloMax 96 Mikrotiterplatten-LuminometerPromegaE6501
SaccharoseNacalai tesque30403-55
LuminometerplatteGreiner bio-one655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22--Referenz 15
pUC1.2HBV delta epsilon--Referenz 15
pUC1.2HBV/NL--Referenz 15
50 ml TubeViolamo1-3500-02
Anti-Myc AntikörperSigma-AldrichC3956
HBIGJapan Blood ProductsOrganization-IFN
-βMochidaPharmaceutical 14987224005413
HeparinSigma-AldrichH3393

Referenzen

  1. Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors. Gastroenterology. 127 (5), Supple 1 35-50 (2004).
  2. Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. Global strategies are required to cure and eliminate HBV infection. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 13 (4), 239-248 (2016).
  3. Wursthorn, K., et al. Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B. Hepatology. 44 (3), 675-684 (2006).
  4. Stuyver, L. J., et al. Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region. Hepatology. 33 (3), 751-757 (2001).
  5. Ochiya, T., Tsurimoto, T., Ueda, K., Okubo, K., Shiozawa, M., Matsubara, K. An in vitro system for infection with hepatitis B virus that uses primary human fetal hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (6), 1875-1879 (1989).
  6. Galle, P. R., Hagelstein, J., Kommerell, B., Volkmann, M., Schranz, P., Zentgraf, H. In vitro experimental infection of primary human hepatocytes with hepatitis B virus. Gastroenterology. 106 (3), 664-673 (1994).
  7. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  8. Murakami, Y., et al. Discovering novel direct acting antiviral agents for HBV using in silico screening. Biochem. Biophys. Res. Commun. 456 (1), 20-28 (2015).
  9. Ladner, S. K., et al. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrob. Agents. Chemother. 41 (8), 1715-1720 (1997).
  10. Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. Elife. 3, (2012).
  11. Wang, Z., et al. Replication-competent infectious hepatitis B virus vectors carrying substantially sized transgenes by redesigned viral polymerase translation. PLoS. One. 8, 60306(2013).
  12. Chaisomchit, S., Tyrrell, D. L., Chang, L. J. Development of replicative and nonreplicative hepatitis B virus vectors. Gene. Ther. 4 (12), 1330-1340 (1997).
  13. Hong, R., et al. Novel recombinant hepatitis B virus vectors efficiently deliver protein and RNA encoding genes into primary hepatocytes. J. Virol. 87 (12), 6615-6624 (2013).
  14. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS. Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).
  15. Nishitsuji, H., et al. Novel reporter system to monitor early stages of the hepatitis B virus life cycle. Cancer. Sci. 106 (11), 1616-1624 (2015).
  16. Sugiyama, M., et al. Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and extracellular expression of viral DNA and antigens. Hepatology. 44 (4), 915-924 (2006).
  17. Seeger, C., Zoulim, F., Mason, W. Hepadnaviruses. Field Virology. Volume 1. Knipe, D., Howley, P. , Wolters Kluwer. 2185-2221 (2013).
  18. Moolla, N., Kew, M., Arbuthnot, P. Regulatory elements of hepatitis B virus transcription. J. Viral. Hepat. 9 (5), 323-331 (2002).
  19. Cattaneo, R., Will, H., Schaller, H. Hepatitis B virus transcription in the infected liver. EMBO. J. 3 (9), 2191-2196 (1984).
  20. Enders, G. H., Ganem, D., Varmus, H. Mapping the major transcripts of ground squirrel hepatitis virus: the presumptive template for reverse transcriptase is terminally redundant. Cell. 42 (1), 297-308 (1985).
  21. Haines, K. M., Loeb, D. D. The sequence of the RNA primer and the DNA template influence the initiation of plus-strand DNA synthesis in hepatitis B virus. J. Mol. Biol. 370 (3), 471-480 (2007).
  22. Hirsch, R. C., Lavine, J. E., Chang, L. J., Varmus, H. E., Ganem, D. Polymerase gene products of hepatitis B viruses are required for genomic RNA packaging as well as for reverse transcription. Nature. 344 (6266), 552-555 (1990).

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