Modifizierte MicroSecure Vitrifikation: Eine sichere, einfache und sehr effektive Kryokonservierung Verfahren für Human Blastozysten

Summary

MicroSecure Vitrification wurde als nicht-kommerzielles, aseptisches, geschlossenes Vitrifikationssystem entwickelt, das den guten Herstellungs- und Gewebehandhabungspraktiken der FDA entspricht. Aufgrund der Rücknahme von hydrophoben verstopften Embryonalhalmen aus der Industrie wurde das Vitrifikationsverfahren dahingehend geändert, dass eine innere Versiegelung vor dem standardmäßigen internen Baumwollstopfen vorgesehen ist.

Abstract

Klinische Embryo Vitrifikation mit der Entwicklung von einzigartigen Vitrifikation Geräte im ^21. Jahrhundert und mit der falschen Vorstellung entwickelt , dass extrem schnelle Abkühlung in einem "offenen" System (dh direkte LN ₂ Kontakt) war eine Notwendigkeit Vitrifikation Erfolg zu optimieren. Das Dogma die Bedeutung der Kühlraten rund um führte zu unsicheren Praktiken vorbehaltlich der technischen Veränderung und zur Schaffung von Vitrifikation Geräte , die wichtige Qualitätskontrollfaktoren (zB einfache Bedienung, Wiederholbarkeit, Zuverlässigkeit, Kennzeichnung Sicherheit und Lagersicherheit) nicht berücksichtigt. Das Verständnis der Qualitätskontrolle Mängel anderer Geräte für die Entwicklung eines sicheren, reproduzierbaren erlaubt und zuverlässige uS-VTF Methode zur Minimierung richtet intra- und inter Techniker Variation. Ebenso wichtig ist, kombiniert es die Verfügbarkeit von zwei bestehenden FDA-konformen Geräten: 1) ein 0,3-ml-Ionomerharz Embryo Stroh mit internalisiert, zweifarbige, manipulations pDach Kennzeichnung mit wiederholbaren Dichtschweißung Potential; und 2) verkürzt, häufig verwendete, 300 & mgr; m ID sterile flexipettes, um direkt den Embryo zu laden (s), um eine hocheffiziente globale Vitrifikation Gerät zu erstellen. Wie andere aseptisch, geschlossen Vitrifikation Systeme (zB High Security Vitrifikation (HSV), Rapid-I und VitriSafe) effektiv in der Reproduktionsmedizin verwendet, microSecure Vitrifikation (uS-VTF) hat bewiesen , dass es eine hohe post-Erwärmung Überleben und Schwangerschaft erreichen können Ergebnisse mit seiner Aufmerksamkeit auf Einfachheit und geringere technische Variation. Obwohl die 0,3-ml Embryo Stroh eine interne hydrophobe Stecker enthalten, im Handel mit einem Standard-Samen Stroh ersetzt wurde besitzen Baumwoll Polyvinylpyrrolidon (PVP) Stecker, behielt er seine Ionomerharz Zusammensetzung Schweiß Abdichtung zu gewährleisten. Jedoch können die Wattestopfen fluid embryo Inhalte der flexipettes bei Kontakt Docht aus. Eine modifizierte uS-VTF Verfahren wurde angepasst, um eine zusätzliche innere Schweißnaht zu schließenversiegeln, bevor die Stecker auf dem Gerät Ladeseite. Der zusätzliche technische Schritt zum uS-VTF Verfahren hat seine erfolgreiche Anwendung nicht betroffen, da hohe Überlebensraten (> 95%) und die Schwangerschaftsraten heute fortsetzen.

Introduction

Vitrifikation ist seit der Entwicklung der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion die einflussreichste assistierte Reproduktionstechnologie in der In-vitro-Fertilisationsindustrie (IVF). Heute werden Blastozysten kryokonserviert, ohne den Verlust an Lebensfähigkeit der Embryonen, der früher mit herkömmlichen Methoden des langsamen Einfrierens verbunden war¹. Mit einem zuverlässigen Überleben der Embryonen nach der Erwärmung wandelt sich die Unfruchtbarkeitsindustrie zur bevorzugten Verwendung von kryokonservierten Embryotransferzyklen, die ähnliche oder höhere Schwangerschaftsergebnisse erzielen als der traditionelle Transfer frischer Embryonen. In Verbindung mit der Blastozystenbiopsie und dem genetischen Präimplantationsscreening (PGS) ist die Vitrifikation zu einem wichtigen klinischen Instrument geworden, um gesunde Lebendgeburtsergebnisse durch euploiden Einzelembryotransfer zu optimieren^2,3.

Die Vitrifikation von murinen Embryonen wurde Mitte der 1980er Jahre entwickelt^4,5 und bis 1990 an die Tierhaltung angepasst⁶. Basierend auf der Prämisse, dass Vitrifikationslösungen einen metastabilen glasartigen Zustand bilden, der frei von schädlicher Eiskristallbildung ist, hat sich gezeigt, dass die vollständige zelluläre Integrität von Embryonen effizienter erhalten bleibt. Interessanterweise wurde die vielversprechende Akzeptanz der Vitrifikation in der menschlichen Embryologie erst im 21^. Jahrhundert realisiert. Frühe Publikationen, die die Verwendung der Vitrifikation förderten, fielen mit der Entwicklung einzigartiger "offener" Systemgeräte zusammen^7,8,9. Die Einführung der Vitrifikation in die klinische Praxis verlief jedoch nur langsam, da sie zu einer Zeit erfolgte, in der auch Verbesserungen beim langsamen Einfrieren von Blastozysten zu verzeichnen waren. Das erfolgreiche konventionelle Einfrieren mit langsamer Rate wurde zusätzlich zur Vitrifikation mit Verbesserungen in den Embryokultursystemen sowie mit der Einbeziehung von Blastocoele-kollabierenden Ansätzen in Einklang gebracht, die sowohl das Gesamtüberleben des Trophektoderms als auch in der Folge die Implantation verbesserten¹⁰.

In den letzten zehn Jahren hat die Vitrifikationstechnologie die herkömmlichen Gefrierpraktiken rapide verdrängt. Dies war zu einem großen Teil auf die Entwicklung spezialisierter Vitrifikationsgeräte zurückzuführen. Einige dieser Geräte haben die allgemeine Sicherheit, Effizienz und Wirksamkeit der klinischen Vitrifikation beeinträchtigt, indem sie inhärente Konstruktionsfehler bei den in der IVF-Industrie verwendeten Geräten eingeführt haben¹¹. In der Tat führen die Nuancen der verschiedenen Geräte zu erheblichen technischen Unterschieden zwischen den Programmen, die allgemein als "technische Signaturen" bezeichnet werden¹². Daher können wissenschaftliche Zeitschriften wie das Journal of Visuald Experiments (JoVE) als wertvolle Ressource für die Demonstration technischer Details dienen, die dazu beitragen, Ergebnisvariationen zu reduzieren. Ein weiteres anhaltendes Problem besteht darin, dass einige Embryologen auch heute noch falsch informiert sind, basierend auf der Behauptung, dass "die ultraschnelle Abkühlung von Embryonen oder Eizellen in einem 'offenen Vitrifikationssystem' (d.h. direkter Kontakt des Embryos mit flüssigem Stickstoff (LN₂)) eine Voraussetzung für die Optimierung der Erfolgsraten ist." Dieser Glaube ist eindeutig ungenau, basierend auf dem nachgewiesenen Erfolg aseptischer geschlossener Systeme^{13, 14,15}.

Basierend auf den kryobiologischen Prinzipien der Vitrifikation hängt die Wirksamkeit der Vitrifikation stärker von den Erwärmungsraten als von den Kühlraten ab^16,17,18. Unabhängig vom verwendeten Vitrifikationsgerät muss die Erwärmungsrate in der Regel die Abkühlgeschwindigkeit überschreiten, um hohe Überlebensraten zu gewährleisten. Hohe Erwärmungsraten minimieren die Möglichkeit von Eiswachstum (d.h. die Rekristallisation von kernhaltigen Verunreinigungen in Kryolösungen) während der Entglasungsphase der Erwärmung. Zugegeben, die Stabilität der Vitrifikationslösung (d. h. die Art und Konzentration der verwendeten Kryoprotektivien) kann einen verwirrenden Effekt haben, aber dies wird in einer separaten Veröffentlichung behandelt¹¹. Unter Berücksichtigung der Probleme der Kühl-Erwärmungsrate wurde MicroSecure Vitrification (μS-VTF) im Jahr 2008 als kostengünstige, nicht-kommerzielle, FDA-konforme Methode entwickelt, die die Qualitätskontrollaspekte der Vitrifikation optimiert. Es war insofern einzigartig, als es eine manipulationssichere, verinnerlichte, zweifarbige Etikettierung bot. Darüber hinaus wurden durch das Laden und Lagern der Embryonen direkt in der sterilen Flexipette, die zum Pipettieren verwendet wird (d. h. ohne Pipettieren auf eine sekundäre Geräteoberfläche) und durch die Verwendung von Ionomerharz-Strohhalmen, die die Versiegelung mit einem automatisierten Versiegelungsgerät vollständig verschweißen, technische Variationen effektiv eliminiert.

Bei der Beurteilung der Vollständigkeit von Vitrifikationsgeräten für eine mögliche Verwendung gibt es mehrere Qualitätskontrollfaktoren, die berücksichtigt werden sollten, darunter: 1) Kennzeichnungspotenzial – Können Etiketten sicher geklebt werden? Sind sie manipulationssicher? Bieten sie eine zweifarbige Kennzeichnungsmöglichkeit? Ist ein sekundäres Etikett erforderlich, und kann das Etikett nach dem Aufwärmen zu Aufzeichnungszwecken (z. B. zur Patientenverifizierung) leicht entfernt werden? 2) Technisch einfach – Können Embryonen einfach und zeitnah in das Gerät geladen und nach der Erwärmung einfach identifiziert und verfolgt werden? 3) Verfahrenseinfachheit/Wiederholbarkeit – Bietet die Vitrifikationsmethode Einfachheit und Zuverlässigkeit, die eine einfache Wiederholbarkeit ermöglicht, wodurch die Schwankungen zwischen Technikern (intern) und Programmen (extern) minimiert werden? 4) LN₂ Speicherkapazität – Können die Geräte einfach und sicher gehandhabt und identifiziert werden? Ist ihr Lagerpotenzial platzsparend? Bietet das Gerät als aseptisches geschlossenes System Sicherheit und Schutz vor physischen Schäden oder möglichen Verunreinigungen? 5) Wiederherstellungspotenzial / Überlebensfähigkeit – Ist das Gerätedesign anfällig für potenzielle Probleme bei der garantierten Gewinnung von Embryonen und werden sie zuverlässig vitrifizieren und die vollständige zelluläre Integrität nach der Erwärmung aufrechterhalten? Das letztgenannte spezifische Qualitätsproblem, die Wiederfindungsrate, wurde in veröffentlichten Berichten überraschenderweise minimiert; Dies geschieht, indem das ungünstige Ergebnis (d. h. der Verlust des Embryos oder der Eizelle) in der Regel in typischerweise guten Überlebensraten verborgen wird. Jedes Gerät, das zu einer inkonsistenten Wiederherstellung (<99 %) neigt, ist schwerwiegend fehlerhaft und stellt eine verfahrensrechtliche Haftung dar.

Unsere aseptische, geschlossene μS-VTF-Methode wurde strategisch entwickelt, um jede Qualitätskontrollmaßnahme zu berücksichtigen. Nach 5 Jahren überlegenen klinischen Erfolgs und Validierung¹⁴) musste das Verfahren jedoch geändert werden. Die ursprünglichen 0,3-ml-Embryonenstrohhalme (mit einem hydrophoben Pfropfen) wurden aus der IVF-Industrie entfernt und durch einen 0,3-ml-Samenhalm ersetzt, der einen Standard-Baumwoll-/PVP-Stöpsel besaß (d. h. als Samen-/Embryo-Strohhalm umetikettiert). In diesem Verfahrensdokument werden die spezifischen Schritte und Strategien beschrieben, die für eine sichere, einfache und effektive Implementierung von μS-VTF erforderlich sind. Darüber hinaus heben wir die Modifikation(en) hervor, die erforderlich sind, um Versorgungsengpässe zuverlässig zu berücksichtigen, bis ein alternativer idealer Strohbehälter wieder in das klinische Labor eingeführt wird.

Protocol

Die Entwicklung des μS-VTF-Verfahrens wurde im Rahmen einer genehmigten Studie des Institutional Review Board (IRB) in den Jahren 2008-2009 (Aspire IRB, Santee, CA) zur Kryokonservierung von menschlichen Eizellen und Embryonen durchgeführt. Das Verfahren wird seitdem routinemäßig bei der klinischen Behandlung von Unfruchtbarkeitspatientinnen angewendet, die Einverständniserklärungen unterschrieben haben.

1. Überlegungen zur Qualitätskontrolle

1. Verwenden Sie verschiedene Farben (z. B. Stifte, Etiketten oder Identifikationsstäbe oder -stecker), um Patienten zu unterscheiden, wenn Sie mehr als eine Gruppe von Embryonen an einem Tag kryokonservieren.
2. Verwenden Sie für jeden Patienten unterschiedliche Schalen und Pipetten. Minimieren Sie das Volumen des übertragenen Mediums, wenn die Blastozysten von einer Lösung in eine andere bewegt werden.
3. Kryokonservieren Sie eine Blastozyste pro Strohhalm oder Gerät. Behalten Sie die aseptische/sterile Technik bei und halten Sie sich an alle Sicherheitsvorkehrungen.
4. Bestätigen Sie das Überweisungsformular des Arztes und die unterschriebene Patienteneinwilligung, bevor Sie mit den Eingriffen beginnen. Überprüfen Sie die Disposition des/der Embryo(s) der Patientinnen im Inventar.
5. Verwenden Sie eine "Haftungsfreistellung und Zustimmung zum Transport", wenn die Blastozysten in eine andere Einrichtung überführt werden sollen. Stellen Sie sicher, dass alle Unterschriften vor Ort beglaubigt oder notariell beglaubigt werden.
6. Bestätigen Sie gegebenenfalls die ordnungsgemäßen Qualitätskontrollmaßnahmen für das Medium und die Proteinzusätze, einschließlich Bioassays, Endotoxinbestimmungen sowie Überprüfung und Verfolgung von Verfalls-/Chargennummern.
7. Festlegung kritischer Grenzwerte (d. h. geringer Besorgnis) für die Überwachung und Bewertung der klinischen Kryokonservierungsergebnisse, wie z. B. Wiederfindungsraten: < 95 %, Überlebensraten: < 80 % und klinische Schwangerschaftsraten mit einzeleuploiden Blastozysten: < 50 %.

2. Verfahren zur Kryokonservierung

1. Präparat
   1. Füllen Sie die entsprechenden Unterlagen aus, einschließlich der Eingabe von Daten in die Arbeitsblätter, die Kryokonservierungsdatenbank und die Inventarprotokolle.
   2. Bereiten Sie frische Kryokonservierungslösungen zu oder verwenden Sie eine kommerzielle Quelle (unter Einhaltung der vom Hersteller empfohlenen Lagerungs- und Haltbarkeitsbedingungen).
   3. Zubereitung des Strohhalms.
      1. Öffnen Sie die Etikettierseite der individualisierten Sterilpackungen. Nehmen Sie die Fülldüse ab, die sich auf dem herkömmlichen 0,3-ml-Embryostrohhalm befindet, indem Sie ihn gegen die Verpackung fassen und den Strohhalm teilweise anheben und herausziehen. Dadurch wird das Etikettenende den Umgebungsbedingungen ausgesetzt, während der Strohhalm aseptisch in der Kunststoffverpackung ruht.
         1. (Modifikation) Bei 0,3-ml-Samen-/Embryohalmen schieben Sie den Stopfen 0,5 cm nach unten. Bringen Sie eine interne Versiegelung vor dem Baumwoll-PVP-Stopfen an, indem Sie einen einfachen Tisch-Impulsschweißer verwenden.
         2. Legen Sie den Strohhalm auf die Teflonoberfläche der Elektrode, direkt vor dem Stecker. Drücken Sie den Griff, um die Hitze zu aktivieren. Lassen Sie den Griff los, wenn das rote Licht aufleuchtet. Um eine vollständige Schweißnaht zu gewährleisten, erhitzen Sie auf eine Temperatur, die die gegenüberliegenden Oberflächen ausreichend abflacht, drehen Sie es dann um 180° und versiegeln Sie die gegenüberliegende Oberfläche nach Bedarf erneut¹⁹.
   4. Beschriften Sie mit einem Kryomarker jeden Strohhalm/jedes Gerät und jeden Kryobecher mit dem Patientennamen, einer eindeutigen ID-Nummer (z. B. SSN, Geburtsdatum oder Patienten-ID-Nummer) und dem Datum des Einfrierens. Fügen Sie auch eine eindeutige Nummer auf jedem Strohhalm/Gerät hinzu (z. B. 1, 2, 3 usw.).
      1. Befestigen Sie das Etikett (vorzugsweise farbig) auf einem farbgewichteten ID-Stab, um es in einen 0,3-ml-Embryohalm einzuführen und zu versiegeln. Geben Sie den Strohhalm bis zur Verwendung in die sterile Einzelverpackung zurück.
         Anmerkung: Wenn nur 30 mm farbgewichtete ID-Stangen verfügbar sind, ist der zusätzliche Einsatz von zwei Kugellagern erforderlich, die an jeder Seite der ID-Stange nebeneinander liegen.
   5. Identifizieren Sie jeden Stock mit einer eindeutigen eingeschriebenen ID-Nummer. Geben Sie die Nummer des LN 2-Lagertanks und eine Kanisternummer an, in dem die Proben jedes Patienten langfristig gelagert werden können.
   6. Bereiten Sie frische Kryoschalen (100 mm) zu, indem Sie die Unterseite mit dem Patientennamen, der Lösungs-ID und der Embryo-/Haltetröpfchen-ID beschriften (Abbildung 1A). Konkret stellen Sie 4 Reihen Tröpfchen auf: isotonisches hepesgepuffertes Medium (oben), V1 (Äquilibrierungslösung (ES)), V2 (Zwischenlösung (IS)), V3 (Vitrifikationslösung (VS); unten). Schreiben Sie die Embryo-ID auf die obere rechte Seite mit beschrifteten Spalten.
      Anmerkung: Eine Reihe von 25 bis 50 μl großen Waschtröpfchen (n = 3) wird verwendet, um sicherzustellen, dass jedes einzelne endgültige 10 bis 15 μl Haltetröpfchen/Lösungstyp (d. h. V1, V2 oder V3) rein und unverdünnt ist. Mit diesem Ansatz können bis zu fünf einzelne Embryonen mit einer einzigen Schale vitrifiziert werden. Bewahren Sie jede Schüssel abgedeckt auf, wenn sie nicht verwendet wird, um eine Verdunstung/Dehydrierung der Tröpfchen bei Raumtemperatur zu vermeiden.
   7. Bereiten Sie sterile Flexipetten vor, indem Sie 3 cm von ihrem unteren Ende abschneiden (als "VTF-Spitzen" bezeichnet). Führen Sie sie auf einzelne Pipetten (eingestellt auf 3 μl) ein und setzen Sie die Pipetten-VTF-Spitzen aufrecht in ein Styroporröhrchengestell (Abbildung 1B).
2. Auswahl der Embryonen
   1. Bestätigung der Patienten-/Probenidentifikation.
   2. Mit einem inversen Mikroskop (200- - 400-fache Vergrößerung) klassifizieren und klassifizieren Sie die Blastozysten gemäß dem Gardner-Bewertungssystem²⁰, wobei eine numerische Klassifizierung von 1 bis 6 für frühe bis geschlüpfte Blastozysten und eine A-, B- oder C-Klasse für die innere Zellmasse (ICM) und das Trophektoderm (TE) verwendet wird.
      Anmerkung: Zur Vorbereitung auf die Blastozystenbiopsie und Euploidie-Analyse wird die Zona pellucida an Tag 3 durch Laserablation vorgeschlüpft, um die frühe Herniation der TE zu fördern, und erfordert daher eine modifizierte Einstufungsklassifikation². Kurz gesagt, vollwertige Blastozysten Grad 3 weisen bis zu 10 % TE-Herniation auf, expandierte Blastozysten Grad 4 sind zu 10 - 50 % geschlüpft und Blastozysten grad 5 haben > 50 % TE-Extrusion (Abbildung 2A-C).
      >Anmerkung: Wir bevorzugen es, Blastozysten des Grades 3 oder höher von ≥BB-Qualität an Tag 5 oder 6 zu kryokonservieren. Vitrifizierte Blastozysten von geringerer Qualität (C) und Embryonen nach der Verdichtung in früheren Stadien (einschließlich Blastozysten der späten Morula bis Grad 1 oder 2) können jedoch die Erwärmung völlig intakt überleben und lebensfähige Embryonen hervorbringen, die in der Lage sind, Lebendgeburten zu ermöglichen.
   3. Kollapsieren Sie das Blastocoele jeder Blastozyste vor Beginn des Kryodilutionsprozesses durch Mikropunktion eines Trophektodermübergangs oder durch Durchführung einer Laserpulsablation einer trophektodermalen Zelle²¹ bei Verwendung von Vitrifikationslösungen mit niedriger Molarität (< 6,5 M oder 40 % v/v).
      Anmerkung: Die Notwendigkeit, die Blastozysten zu kollabieren, ist nicht geräteabhängig. In unserer eigenen frühen Entwicklung von μS-VTF (2008) setzten wir zunächst erfolgreich Ethylenglykol (EG)/DMSO-Lösungen mit Eizellen ein (1 von 1 Vollzeitschwangerschaften), aber ein suboptimales (< 80%) Überleben/Entwicklung von Maus-Blastozysten¹⁶ wurde von anderen beobachtet²¹. Da in unserem aktuellen VTF-System (seit 2009) hochmolare Glycerin-basierte Lösungen (über 7,9 M) verwendet werden, ist ein physikalischer Blastocoele-Kollaps unnötig. Generell ist jedoch das selektive Schlüpfen von geschlüpften Blastozysten ratsam.
3. Kryodilution und Blastozystenbeladung
   1. Nehmen Sie die Patientenkulturschale aus dem Inkubator und bestätigen Sie die Identifizierung des Patienten/der Probe mit einer anderen Person (d. h. von einer Sekundärquelle bezeugt), bevor Sie den/die Embryo(n) entfernen, der/die vitrifiziert werden soll.
   2. Bestätigen Sie die Blastozystenentwicklung gemäß Schritt 2.2.2, aktualisieren Sie das Kryo-Datenblatt und pipettieren Sie unter Stereomikroskopie Blastozysten(en) aus der Kulturschale in ein isotonisches Haltetröpfchen der Kryoschale.
   3. Bewegen Sie jede Blastozyste mit der Vitrifikationsflexipette (d. h. der VTF-Spitze) in einzelne Haltetröpfchen.
   4. Bewegen Sie jede Blastozyste in V1 (ES) -Lösung.
      1. Füllen Sie die Flexipette mit V1-Lösung (3 μl) und geben Sie die Hälfte des Inhalts auf den Embryo.
      2. Aspirieren Sie den Embryo und begeben Sie sich zum ersten von drei V1-Waschtröpfchen (siehe Schritt 2.1.6), pipettieren Sie den Embryo 2 - 3 Mal um den Umfang herum und reinigen Sie den Pipetteninhalt im Tröpfchen (um Blasenbildung zu vermeiden) oder außen auf der Oberfläche der Schale.
   5. Füllen Sie die VTF-Spitze mit dem nächsten V1-Waschtropfen und wiederholen Sie die Aspiration des Embryos bzw. der Embryonen. Wiederholen Sie dies ein drittes Mal und bewegen Sie die Blastozyste(n) zu einem einzelnen V1-Haltetropfen. Die Verdünnungs-/Waschschritte sollten 30 bis 45 s dauern. Belasten Sie jede VTF-Spitze mit der nächsten Lösung (z. B. V2), setzen Sie die Pipette in ein Gestell ein und verwenden Sie die nächste Pipette (gemäß den Einstellungen in Schritt 2.1.7) (Abbildung 1B).
      Anmerkung: Da die Gesamtexpositionszeit in Nicht-Dimethylsulfoxid (DMSO), die V1- und V2-Lösungen enthalten, jeweils 5 Minuten beträgt, sollte das Pipettieren einzelner Blastozysten gleichmäßig innerhalb dieses Intervalls gestaffelt werden, wobei zu berücksichtigen ist, dass der letzte V3-Schritt mindestens 1 Minute pro Blastozyste benötigt. Wenn es zum Beispiel 4 Blastozysten in einer Vitrifikationsgruppe gibt, pipettieren Sie die Blastozysten #1-2-3-4 im Abstand von 75 s.
      Anmerkung: Das oben beschriebene Verdünnungsprotokoll von Innovative Cryo Enterprises (ICE) unterscheidet sich deutlich von den meisten anderen kommerziellen Vitrifikationsverfahren, bei denen im Allgemeinen DMSO-haltige Lösungen verwendet werden. Diese Protokolle erreichen die gleichen schrittweisen Verdünnungen durch eine allmähliche, aber weniger kontrollierte Verschmelzung von Waschlösung (d. h. isotonischem Medium), ES und VS.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.4 und 2.3.5 mit V2-Lösungen.
   7. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.4 und 2.3.5 mit V3 (VS)-Lösungen.
   8. Nachdem Sie jede Blastozyste in das V3-Haltetröpfchen gelegt haben, entfernen Sie die restliche Lösung und die Blasen von der VTF-Spitze (außerhalb des Tröpfchens) und füllen Sie dann die Spitze vollständig mit sauberem V3 um den Embryo herum. Stoßen Sie etwa ein Drittel des Volumens (1 μl) aus und pipettieren Sie die Blastozyste(n) und das verbleibende V3 vollständig in die VTF-Spitze.
   9. Nehmen Sie die VTF-Spitze aus der Pipette, wischen Sie die Spitze mit einem sterilen Mullpad von V3-Resten auf der Außenfläche trocken und führen Sie die Spitze mit dem Ende voran in das offene Ende des voretikettierten Halms ein. Eine "trockene Spitze" ist entscheidend, um ein mögliches Anhaften des inneren Strohhalms zu verhindern.
   10. Drehen Sie den Strohhalm um (Etikettenende nach unten), beobachten Sie die Spitze am inneren Stopfen oder Verschluss und verschließen Sie das offene Ende sicher mit 1 cm Luftraum. Verwenden Sie vorzugsweise eine automatische Siegelvorrichtung (z. B. Syms I), um technische Abweichungen zu vermeiden.
       Anmerkung: Der Vorteil der Verwendung von Strohhalmen, die aus einem ionomanischen Kunststoff bestehen (z. B. HSV oder μS-VTF), besteht darin, dass die Verwendung eines ordnungsgemäß funktionierenden Heißsiegelgeräts eine zuverlässige "Schweißnaht"-Versiegelung erzeugt, wie in Schritt 2.1.3.1 beschrieben.
   11. Nach dem Verschließen wird der geschlossene Strohhalm in einem Dewarkolben aus Edelstahl direkt in LN₂ getaucht und der (die) Halm(e) zur Aufbewahrung in den offenen Becher gelegt, der am Stock des Patienten befestigt ist.
       Anmerkung: Da μS-VTF-Halme 40-mm-gewichtete ID-Stäbe verwenden, um den Auftrieb des luftgefüllten Halms auszugleichen, ist die Verwendung von umgekehrten Bechern oder leeren Kryofläschchen zum Abdecken der Probe(n) nicht erforderlich, es sei denn, es handelt sich um einen Transport.
4. Erwärmung und Elution/Verdünnung von Kryolösungen
   1. Bestätigen Sie das Überweisungsformular des Arztes bezüglich des Datums des Transfers des vitrifizierten Embryos, der geplanten Zeit und der Embryonendetails (Anzahl der aufzutauenden/zu übertragenden Embryonen, spezifische Embryonennummer, wenn PGS getestet wurde usw.).
   2. Bereiten Sie frische Warmhaltelösungen (1,0 M Saccharose-Stammlösung) vor und/oder verwenden Sie eine kommerzielle Quelle (empfohlen 1 Woche-1 Monat Haltbarkeit nach Gebrauch, 4 °C Lagerung).
      1. Aliquotieren Sie 17,1 g Saccharose in 50-ml-Sterilkolben nach dem ersten Öffnen (z. B. wöchentliche Vorratsquelle) aufgrund des Risikos einer Endotoxinakkumulation in Saccharosegranulaten bei wiederholter Exposition bei Umgebungstemperatur.
      2. Mischen Sie vorgewogene körnige Saccharose in die Lösung (1,0 M Stamm = 3,42 g/10 mL hepesgepufferte humane Eileiterflüssigkeit [H-HTF]) und erwärmen Sie die Lösung auf bis zu 37 °C, um die Löslichkeit des Granulats zu erhöhen. Drehen Sie den Behälter wiederholt um, um das endgültige Mischen zu beschleunigen und abzuschließen.
         Anmerkung: Die Filtration (0,22-μm-Filter) mit Überdruckfiltrationseinheiten wird für viskose Lösungen (> 0,5 M Saccharose) oder große Volumina empfohlen. Handdruckpumpen sind ausreichend und kostengünstig, während eine elektrische Pumpe laut ist, Vibrationen verursacht und einfach nicht erforderlich ist.
   3. Erhitzen (37 °C) je ein 10-ml-Röhrchen mit 1,0 M Saccharoselösung und H-HTF-Medium pro Patient für die Verwendung im μS-VTF-Warmhaltebad.
   4. Bereiten Sie frische Auftaugerichte (6-Well-Platte) zu, indem Sie die Abdeckfläche mit dem Patientennamen und den Lösungs-IDs beschriften.
      Anmerkung: In diesem Fall haben wir verwendet: (1) T1 Wash (200 μL ohne Ölauflage), (2) T1 (100 μL) mit 1 mL Öl, (3) T2 (100 μL) mit Öl, (4) T3 (100 μL) mit Öl, (5) T4 (100 μL) mit Öl und (6) T5/200 μL isotonisches HEPES-gepuffertes Medium mit 10 % Humanserumalbumin (HSA) oder 20 % Serumersatz ohne Ölüberlagerung. Wenden Sie ein Step-down-Protokoll für universelle Saccharoselösung an - T1 = 1,0 M, T2 = 0,5 M, T3 = 0,25 M und T4 = 0,125 M -, wenn die ICE oder eine andere kommerzielle Quelle nicht verfügbar ist, wie für langsam gefrorene Embryonen vorgeschlagen²². Weiterhin ist zu beachten, dass die anfängliche T1-Spülung und die abschließende T5-Äquilibrierung in 30-mm-Petrischalen und der 4-Well-Schale, die für die obigen Schritte 2-5 verwendet wird, mit einer Ölüberlagerung durchgeführt werden können.
   5. Tauen Sie jeweils nur einen oder mehrere Embryonen der Patientin auf.
      1. Überprüfen Sie das Überweisungsformular des Arztes und bestätigen Sie den Zyklus, bevor Sie die angegebene Anzahl (d. h. 1 oder 2 Blastozysten) erwärmen; beurteilen Sie das Überleben/die wahrscheinliche Lebensfähigkeit, indem Sie osmotische Veränderungen (d. h. Schrumpfung und Rehydratation) und intakte Membranen beobachten, und, falls fraglich, kontaktieren Sie den Arzt und/oder Patienten, bevor Sie eine andere Blastozyste erwärmen.
   6. Bestätigen Sie die Identifizierung von Patienten/Proben mit einem Kollegen (d. h. von einer Sekundärquelle bezeugt).
   7. Legen Sie den Patientenstock in einen mit LN₂ gefüllten Dewarkolben und isolieren Sie den zu erwärmenden Strohhalm.
   8. Bringen Sie die 6-Well-Verdünnungsschale in die Mitte des Stereomikroskoptisches. Stellen Sie eine 60-mm-Petrischale zur Seite (d. h. je nach Vorliebe für die linke oder rechte Hand des Technikers) und fügen Sie die erwärmte Saccharose (1,0 M) und die H-HTF-Lösung hinzu, um ein 0,5 M Saccharose-Warmbad (unbedeckt) zu erzeugen.
      Anmerkung: VTF-Spitzen werden nur in 0,5 M Saccharoselösungen erwärmt, um die Lebensfähigkeit des Embryos im seltenen Fall zu gewährleisten, dass ein Embryo bei schneller Erwärmung ausgestoßen wird²².
   9. Halten Sie die obere Halmdichtung über den Flüssigkeitsspiegel, um die Identität zu bestätigen, und fassen Sie dann den Strohhalm mit einer Mayo-Schere unter den internen Stopfen und befestigen Sie ihn (die VTF-Spitze sollte noch in LN₂ eingetaucht sein).
      1. Klopfen Sie mit der Schere fest auf den Dewargefäß (ein paar Mal), um die VTF-Spitze von der inneren Seitenwand des Strohhalms zu entfernen. Wenn die VTF-Spitze haftet, sorgt das Klopfen dafür, dass die Spitzenbasis auf das abgedichtete Ende gegenüber dem beschrifteten Ende abfällt, wodurch ein Luftraum in der Nähe des Steckerendes entsteht.
   10. Heben Sie den Strohhalm mit der Schere in horizontaler Position (neben oder unter der Stereoskopoberfläche) in die Umgebungsluft und fassen Sie das unbeschriftete Ende (Etikett auf der rechten Seite). Schneiden Sie den Strohhalm am inneren Stöpsel oder Verschluss ab und heben Sie ihn über die wärmende Badeschale. Gießen Sie die VTF-Spitze in einem Winkel von 60° in das warme Saccharosebad, bis sie vollständig extrudiert und schnell erwärmt ist (> 6.000 °C/min); Der Boden der Flexipette liegt über der Seitenwand der Schüssel auf.
       1. Lassen Sie die VTF-Spitze frei in die Badewanne fallen. Klopfen Sie vorsichtig auf die obere Strohhalmfläche, wenn die Spitze nicht sofort herauskommt. Wenn er nur auf halbem Weg zu sehen ist, helfen Sie bei der Extrusion, indem Sie den Schaft der Flexipette mit der Schere oder einer feinen Pinzette greifen.
   11. Fassen Sie nach 5 - 10 s den Pipettenboden und führen Sie ihn in ein Einweg-Pipettiergerät ein; ein Loch im Kolben entlastet den Druck beim Einführen. Decken Sie das Zwiebelloch mit einem Zeigefinger ab und drücken Sie die Zwiebel vorsichtig zusammen, um die vitrifizierte Blastozyste in die T1-Waschung (#1) freizusetzen, während Sie sie stereomikroskopisch betrachten. Nach der Bestätigung die restliche V3 (VS)-Lösung und die Blasen durch Überdruck reinigen und den Inhalt in die mittige, unbenutzte Vertiefung entsorgen. Starten Sie einen 5-Minuten-Timer.
       Anmerkung: Alle Schritte der Saccharoseverdünnung werden bei Raumtemperatur (21 ± 2 ºC) durchgeführt.
   12. Entfernen Sie die VTF-Spitze und setzen Sie sie auf eine Pipette. Fahren Sie fort, indem Sie den Embryo für die verbleibende Zeit (ca. 3 - 4 Minuten) unter Öl in T1 #2 bringen.
       1. Wenn eine zweite Blastozyste für den Transfer erforderlich ist, erwärmen Sie sofort einen zweiten Strohhalm und eine VTF-Spitze (Wiederholung der Schritte 2.4.9 - 2.4.11) vom Patienten, bevor Sie mit Schritt 2.4.12 beginnen. Bewegen Sie beide Blastozysten zusammen für eine minimale Elution in T1 (1,0 M Saccharose) von mindestens 3 min.
   13. Füllen Sie die Flexipette mit der nächsten Lösung vor und bewegen und verdünnen Sie dann die Blastozyste(n) in T2, T3 und T4 in Abständen von 3 Minuten. Wenn die Zona pellucida zuvor nicht mit dem Laser abliert (d. h. geschrafft) wurde, tun Sie dies in T4. Stellen Sie die Schale auf den Tisch eines inversen Mikroskops und bilden Sie den Embryo auf einem Computermonitor ab. Richten Sie die Zona innerhalb eines bestimmten roten Kreises aus und aktivieren Sie 2 oder 3 Impulse eines Diodenlasers (beginnend am Rand des perivitellinischen Raumes und nach außen), um eine Öffnung zu erzeugen^2,19.
   14. Die Blastozysten in T5 (d.h. isotonischem Medium) für 5 min auf einer warmen Oberfläche (37 °C) äquilibrieren.
   15. Beurteilung des anfänglichen Überlebens des Embryos auf der Grundlage des überwiegenden Vorhandenseins intakter Zellmembranen mit gleichmäßigen, durchscheinenden Zytoplasmen ohne pyknotische Verdunkelung. Den Embryo bzw. die Embryonen werden 2 - 6 Stunden vor dem Embryotransfer in Kultur gebracht, wobei die Entwicklung/das Überleben des Embryos erneut bewertet und dokumentiert werden sollte.
       Anmerkung: Wenn zum Zeitpunkt des Transfers mehr als 1 lebensfähige Blastozyste vorhanden ist und der Patient sich dafür entscheidet, mit nur 1 Blastozyste fortzufahren, kann die zusätzliche Blastozyste durch Wiederholung der Schritte 2.3.3 - 2.3.11 erfolgreich revitrifiziert werden (rVTF). Wir haben mehrere bestätigte Lebendgeburten nach einzelnen rVTF-Ereignissen.
       Hinweis: rVTF wurde experimentell bis zu 5 Mal durchgeführt, ohne dass ein signifikanter Einfluss auf das Überleben/die Lebensfähigkeit von Aneuploidie-Blastozysten von Menschen bestand, die in einer metastabilen Glycerin-basierten Lösung vitrifiziert wurden.

Results

1.341 vitrifizierte Blastozysten wurden zwischen 2012 und Juni 2014 erwärmt, und 1.341 Embryonen erholten sich (100%), während 1.316 überlebten (98,1%). Biopsierte Blastozysten hatten ein Überleben von über 99,5 %. Beim Transfer von überwiegend einzelnen, genetisch getesteten, euploiden vitroiden Embryonen konnten wir einige der höchsten Einnistungsraten und Lebendgeburtenraten in den USA erzielen, unabhängig vom Alter (Abbildung 3)²⁰, gemäß jüngsten nationalen Statistiken, die vom Center for Disease Control und der Society for Assisted Reproductive Technologies veröffentlicht wurden (Tabellen 1 und 2). Bei der Bewertung einer guten Prognose der Patientenpopulation (unter 35 Jahren) allein für kryokonservierte Zyklen (Tabelle 1) übertraf unser Labor den nationalen Durchschnitt sowohl bei den Einnistungsraten (d. h. der Effizienz eines Embryos zur Herbeiführung einer Schwangerschaft) als auch letztendlich bei den Lebendgeburtenraten um über 30 %. Darüber hinaus führte die erste Validierung/Verifizierung unserer modifizierten Lagerhalme Mitte 2014 mit 70 in der Forschung zugelassenen, revitrifizierten aneuploiden Blastozysten zu einer 100%igen Genesung und einem 100%igen Überleben.

Abbildung 1. MicroSecure VTF-Einrichtung. Die VTF-Schale (A) besteht aus 3 verschiedenen Reihen von Vitrifikationslösungen, die 3 Waschtröpfchen verwenden, bevor sie in verschiedene, nummerierte Haltetropfen gelegt werden. Zusätzlich sind einzelne Pipetten mit verkürzten VTF-Spitzen (d. h. Flexipetten mit 300 μm ID) gesichert und in einem Styroporröhrchengestell (B) angeordnet, das für einen geordneten Gebrauch gedreht werden kann. Beachten Sie, dass eine repräsentative Einweg-Mikropipetten-Pipettiereinheit auf dem Styroporgestell ruht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2. Modifiziertes Blastozysten-Einstufungssystem. Unser modifiziertes Gardner-Blastozysten-Einstufungssystem berücksichtigt die induzierte Herniation von TE-Zellen, um die Blastozystenbiopsie zu erleichtern. Die Modifikation berücksichtigt das vorzeitige Schlüpfen von vollen Blastozysten (A: Grad 3 = weniger als 10% Herniation) und expandierten Blastozysten (B: Grad 4 = bis zu 50% Herniation), während eine schlüpfende Blastozyste (C) einen Herniat von mehr als 50% aufweist¹⁶. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3. Vergleichende Schwangerschaftsergebnisse. Über einen kumulativen Zeitraum von 1,5 Jahren wurden Schwangerschaftsdaten verglichen, um die Auswirkungen des Transfers von vitrifiziert erwärmten euploiden Blastozysten (n = 172 Zyklen/144 Transfers) im Vergleich zu Nicht-PGS-Zyklen (n = 160 Zyklen/153 Transfers) mit überwiegend frischen Transfers zu bewerten¹⁸. Für unsere experimentellen Zwecke zeigen diese Daten deutlich, dass biopsierte Blastozysten, die mit dem μS-VTF-Verfahren vitrifiziert wurden, ihre Lebensfähigkeit behalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

kg

Datenquelle	# Zyklen	Mittelwert # der übertragenen Embryonen	Implantationsraten (%)	Lebendgeburtenraten (%)
NB Labor *	Nr. 144	1.2	74,00 %	74,50 %
Landesdurchschnitt	20.423	1,7	39,60 %	44,10 %
* Die Daten wurden auf der Grundlage der Leistung von Orange County Fertility, dem Southern California Fertility Center und dem Southern California Center for Reproductive Medicine im Jahr 2014 unter Verwendung des aktuellen Ovation Fertility Laboratory (NB Lab) gemittelt, das das microSecure-Vitrifikationsverfahren im Jahr 2008 gegründet hat.

Tabelle 1. 2014 CDC Statistik der assistierten Reproduktion. Gefrorene Embryotransfer-Schwangerschaftsdaten von Frauen unter 35 Jahren aus drei berichtenden Arztpraxen, die unser NB-Labor nutzen, verglichen mit dem nationalen Durchschnitt der USA von über 450 berichtenden Kliniken im Jahr 2013.

SART Nationale Durchschnitte
Klinik - Bundesland	Frauen	Frauen	Frauen	Frauen
	< 35 Jahre	35-37 Jahre	38-40 Jahre	41-42 Jahre
SCCRM-CA *	63,1 %	58,3 %	40,6 %	32,3 %
CCRM-CO *	64,7 %	61,5 %	40,4 %	32,2 %
RMA-NJ *	63,2 %	59,7 %	34,6 %	18,7 %
Landesdurchschnitt	48,6 %	38,3 %	24,3 %	12,3 %
SCCRM – Südkalifornisches Zentrum für Reproduktionsmedizin; CCRM – Colorado Zentrum für Reproduktionsmedizin; und RMA – Reproductive Medicine Associates
* Diese führenden Kliniken haben alle überwiegend vitrifizierte Embryotransferzyklen in Verbindung mit genetischen Präimplantationstests in ihre Standardpraxis der Patientenversorgung integriert, um den Erfolg der Lebendgeburt pro transplantiertem Embryo zu optimieren.

Tabelle 2. 2014 Die kumulativen Lebendgeburtenraten, wie sie von der Society for Assisted Reproductive Technologies (SART) für die SCCRM Clinic unter Verwendung unseres Ovation Fertility Lab in Newport Beach, Kalifornien, gemeldet wurden, verglichen mit mehreren anderen angesehenen Programmen sowie mit den nationalen SART-Durchschnittswerten.

Discussion

Heute besteht eine hohe Erwartung an ein vollständiges Überleben der Blastozysten (> 95%) und einen ähnlichen Einnistungserfolg wie bei frischen Embryonen. Einige Gruppen haben vorgeschlagen, dass die Lebendgeburtenraten von vitrifizierten Embryotransferzyklen vielleicht sogar höher sind als bei frischen Blastozysten, wenn der intakte kryokonservierte Embryo in eine gesunde, nicht hormonell stimulierte Gebärmutter transplantiert wird. Unsere Daten zeigen deutlich, dass die Vitrifikation die Lebensfähigkeit des frischen Embryos effektiv und zuverlässig erhält. Darüber hinaus haben wir bewiesen, dass unsere aseptische, geschlossene Methode, die sogenannte MicroSecure Vitrification (μS-VTF), ein optimales Ergebnis erzielen kann, das mit den in der IVF-Industrie verwendeten kommerziellen Standards (d.h. offenen Gerätesystemen) vergleichbar oder darüber hinausgeht.

Variation ist mit der technischen Wiederholbarkeit und Zuverlässigkeit zwischen Personen verbunden, die eine Vielzahl von Vitrifikationsgeräten/-methoden verwenden. Dies wiederum hat zu Inkonsistenzen zwischen den Programmen geführt, die die Vitrifikation anwenden. Daher ist es nicht verwunderlich, dass die Vertrautheit mit dem Gerät ein wichtiger Faktor für die Laborkompetenz und die erfolgreichen Ergebnisse ist. Es ist dieses Konzept der "technischen Signatur^"11, das erklärt, warum die Wiederholbarkeit zwischen Programmen problematisch sein kann. Die Entwicklung von mehr als einem Dutzend kommerzieller Geräte hat dieses Phänomen nicht nur verkompliziert, sondern auch Bedenken hinsichtlich der Qualitätskontrolle aufgeworfen. Glücklicherweise erweisen sich geschlossene Vitrifikationssysteme wie μS-VTF, Rapid-I und VitriSafe inzwischen als ebenso wirksam wie Systeme mit offenen Geräten 12,13,14.

MicroSecure VTF ist eine neuartige, aseptische Vitrifikationstechnik, die mit Blick auf technische Leichtigkeit, Zuverlässigkeit und Kryosicherheit entwickelt wurde. Durch die Kombination der Verwendung von zwei zuvor zugelassenen, FDA-konformen Geräten handelt es sich um ein nicht-kommerzielles Vitrifikationssystem mit dem entscheidenden Vorteil, dass es im Gegensatz zu spezialisierten Geräten nachweislich niedrige Kosten aufweist. Darüber hinaus haben das einzigartige manipulationssichere und verinnerlichte zweifarbige Etikettiersystem sowie zahlreiche andere Vorteile bei der Qualitätskontrolle den μS-VTF zu einer attraktiven globalen Option gemacht¹¹. Als nicht-kommerzielles VTF-Gerät entwickelt sich seine weit verbreitete Anwendung in der Industrie jedoch nur langsam weiter. Nur durch die kontinuierliche Veröffentlichung seiner Sicherheit und klinischen Wirksamkeit wird μS-VTF eine wachsende Nutzung finden.

Als wir im August 2014 nicht in der Lage waren, den ursprünglichen 0,3-ml-Embryo-Strohhalm zu erhalten, der mit einem inneren, nicht feuchtigkeitsableitenden hydrophoben Stopfen hergestellt wurde, konnten wir die μS-VTF-Methode zuverlässig modifizieren. Kurz gesagt, die neuen 0,3-ml-Samen-/Embryo-Halme mit ihren Baumwoll-PVP-Stopfen wurden effektiv angepasst. Dies wurde einfach dadurch erreicht, dass eine innere Dichtung vor dem Wattestopfen geschaffen wurde, um den Kontakt und den Flüssigkeitstransport mit der offenen VTF-Spitze (d. h. der Flexipette, die den Embryo oder die Eizellen enthält) zu verhindern. Wenn 40-mm-ID-Stangen nicht zugänglich sind, kann das Auftriebsproblem, das mit den leichteren 30-mm-Stangen verbunden ist, mit zwei Kugellagern gegengewichtet werden.

Diese zusätzlichen Schritte haben die Technik etwas weniger einfach, aber immer noch sehr effektiv gemacht. Heutzutage werden Wirtschaftlichkeit und Wirksamkeit immer wichtiger, da biopsierte Blastozysten in der Regel einzeln vitrifiziert werden, bis ihr Euploidie-Status in einem genetischen Bericht bestätigt wird. Blastozysten mit einem bestätigten Status als nicht lebensfähige Aneuploidie werden in der Regel mit Zustimmung des Patienten innerhalb weniger Wochen verworfen. So wird ein Großteil (> 50%) der VTF-Geräte nach kurzfristiger Lagerung entsorgt, was bei der Nutzung kommerzieller Geräte zu eskalierenden jährlichen Kosten führt. Insgesamt handelt es sich bei μS-VTF um ein hochwirksames, zuverlässiges und wiederholbares Verfahren zur Kryokonservierung von humanen Blastozysten. Das überlegene Qualitätskontrolldesign etikettiert und lagert Embryonen/Eizellen sicher, während es gleichzeitig ein Versagen der Genesung verhindert und das Überleben und die Lebensfähigkeit nach der Erwärmung optimiert, was die Verwendung des Systems als universellen Ansatz für die Vitrifizierung von Embryonen rechtfertigt.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminium Cane	IVM	XC055
Kugellager, 3/32"	VXB.com	KIT15977	Edelstahl
CBS Samen-/Embryo-Strohhalm, 0,3 mL	CryoBioSystems	25292	einzelne sterile
Farbe, ID Stäbe, 30 mm	CryoBioSystems	019021-26	gewichtete
Kulturröhrchen, 15 mL	Falcon	352099	konisch
Kulturröhrchen, 10 mL	Falcon	352057	Schnappverschluss
Kryosleeves	Nalgene	5016-001
Filter, 250 mL	Fisher Sci.	09-740-2A	0,22 μm m
Kolben, Gewebekultur 50 mL	Falcon	353014
Flexipettes, 300 μ m ID	Koch Med.	K-FPIP-1300-10BS-5	Sterile, 20/Pack
Pinzette, groß	Miltex	6-30TC
Pinzette, Splitter - fein	Miltex	17-305
Becher	IVM	PA003
Heißsiegel, SYMS 1	CryoBioSystems	16399	110 V oder 220 V mit Adapter
Hepes-gepufferte Medien	Life Global oder	LGGH-100; 100  ml, oder	gelagert bei 2 - 8 º C
	Irvine Scientific	H-HTF; 90126; 100 mL	mit nicht essentiellen AA-Etiketten
, Cryo	GA International	CL-23T1	Verschiedene Farben
Flüssigstickstofftank, 40  L	MVE oder Taylor Warton	verschiedene	Flüssigkeitsspeicher
LN2; Dewargefäß, 0,5 Μd; L	Hampton Research	HR4-695	Edelstahl
6-Well-Custerschalen	Biogenics	015/020	Kunststoffwaren im Karton
Pipettenbirne, Micro Cap	Drummond	Fisher#13681451	Loch an der Kolbenspitze
Petrischale, 35 mm	Falcon	351006
Petrischale, 58 mm	Nunc	150288
Petrischale, 100 mm	Falcon	351029
Pipettenspitzen, ART lang	Fisher Sci.	02-707-80	10 - 100 μ L
Pipettenhilfe	Drummond oder Falcon	diverse	wiederaufladbare
Pipettiergeräte,	Cooper Surgical	MXL3-STR
Pipetten, serologisch 1  mL	Falcon	357521
Pipetten, serologisch 2  mL	Falcon	357507
Pipetten, serologisch 5  mL	Falcon	357543
Pipetten, serologisch 10  mL	Falcon	357551
Schere, Chirurgische Mayo	Miltex	5-SC-16
Stereomikroskop	Nikon, Olympus, Leica	verschiedene
sterile Gaze Pads, 4" x 4"	Kendall Healthcare	6939
Synthetisches Serum	Life Global, oder	LGPS-20; 20 mL, oder	gelagert bei 2 - 8 º C
	Irvine Scientific	SS-99193; 12 x 10 mL	Kauf einer Charge mit niedrigem Endotoxingehalt
Sucrose	Sigma Chemical Co.	#S9378	Aliquot in 50  ml-Kolben, 1 Jahr; 17,1 g/Flasche + Medium bis 50 mL; ergibt eine 1 M Lösung; Filter mit 0,22 &Mikro; m unit
Timer	Nalgene	5016-001
Auftaulösung	Innovative Cryo Enterprises	BL-TS (≤ 1,0 M Saccharose)	T1, T2, T3, T4; geschliffen bei 2 - 8 º C für ≤ 1 Monat nach der Eröffnung von
Vitrification Solution*,**	Innovative Cryo Enterprises	BL-VS (≥ 7,9 M [Glycerin/EG])	V1, V2, V3; gelagert bei 2 - 8 º C für ≤ 1 Monat nach dem Öffnen
* Nicht durchdringende kryoprotektive Additive können sein: Saccharose, Ficoll und Natriumhyaluronat
** Andere kommerzielle Zubereitungen sind typischerweise Ethylenglykol (EG)/Dimethylsulfoxid (DMSO; 30 % v/v; 4,8 M), können aber auch EG/Propylenglykol (32 % v/v; 5,2 M) sein. Gemischte Lösungen werden in der Regel verwendet, um die Bedenken hinsichtlich der Kryotoxizität einer hochmolaren Lösung zu verringern. Kommerzielle Lösungen umfassen in der Regel eine ES- und eine VS-Lösung. Die Formulierung kommerzieller Präparate ist in der Regel urheberrechtlich geschütztes Eigentum.