Methodenartikel

Immunostaining von Biocytin gefüllte und verarbeitete Abschnitte für Marker Neurochemisches

DOI:

10.3791/54880

⸱

31. Dezember 2016

 ,  ,  , 
1Graduate School of Biomedical Sciences, Rutgers New Jersey Medical School, 2Department of Pharmacology, Physiology and Neuroscience, Rutgers New Jersey Medical School

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll stellt eine Methode für die morphologische Erholung von Neuronen während elektro Aufnahmen mit biocytin Füllung und anschließende immunhistochemischen Nachbearbeitung geflickt. Wir zeigen, dass dicke biocytin gefüllten Abschnitte, die später mit einem zweiten primären Antikörper Tage oder Monate erneut gefärbt können wurden gefärbt und Eindecken werden.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektrophysiologische Aufzeichnungen von Zellen, die die Patch-Clamp-Technik haben zur Identifizierung von verschiedenen neuronalen Typen auf Basis von Brennmustern erlaubt. Die Einbeziehung von biocytin / Neurobiotin in der Aufzeichnungselektrode ermöglicht Post-hoc-Rückgewinnung von morphologischen Details, die notwendig sind, um die dendritischen Verzweigungen und die Regionen durch die Axone der aufgezeichneten Neuronen gezielt zu bestimmen. Jedoch angesichts der Anwesenheit von morphologisch ähnlichen Neuronen mit unterschiedlichen neurochemical Identitäten und Funktionen, immunhistochemische Färbung für die zelltypspezifische Proteine ​​ist wesentlich, um endgültig Neuronen zu identifizieren. Um Netzwerk-Konnektivität, Gehirnschnitte für physiologische Aufnahmen sind bei einer Dicke von 300 & mgr; m oder mehr halten vorbereitet. Doch oft diese Dicke behindert immunhistologischer Nachbearbeitung aufgrund von Problemen mit dem Antikörper Penetration, erfordert die Resektion des Gewebes. Resektion von Scheiben ist eine anspruchsvolle Kunst, die oft Resulting in dem Verlust von Gewebe und die Morphologie der Zellen aus denen elektrophysiologische Daten erhalten, die Daten unbrauchbar macht. Seit Wiederherstellung der Morphologie würde Datenverlust und Führung bei der Auswahl der neuronalen Marker zu begrenzen, haben wir eine Strategie zur Gewinnung von Zellmorphologie angenommen zuerst durch sekundäre Immunfärbung gefolgt. Wir stellen einen praktischen Ansatz bei physiologischen Aufnahmen und anschließender Serienimmunfärbung für die Gewinnung von Morphologie biocytin Füllung, gefolgt von der restaining von Abschnitten der neurochemischen Identität zu bestimmen. Wir berichten, dass Abschnitte, die mit biocytin gefüllt waren, mit Paraformaldehyd fixiert (PFA), gebeizt und Eindecken kann später mit einem zweiten primären Antikörper Tage entfernt und erneut gefärbt. Diese restaining beinhaltet die Entfernung des Deckglases, das Waschen von Abschnitten in einer Pufferlösung und die Inkubation von primären und sekundären Antikörper der neurochemischen Identität zu offenbaren. Das Verfahren ist vorteilhaft zum Eliminieren datein Verlust aufgrund einer Unfähigkeit Morphologie und zur Eingrenzung der neurochemische Marker wiederherzustellen basierend auf Morphologie getestet werden.

Einleitung

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Das Gehirn ist in den strukturellen und funktionellen Eigenschaften der einzelnen neuronalen Elemente der Vielfalt bekannt. die Rollen von verschiedenen neuronalen Typen in der Gehirnfunktion und Pathologie zu verstehen, müssen die Charakterisierung und die eindeutige Identifizierung von Neuronen. Strukturell die morphologischen Merkmale von somatisch-dendritischen Standort definiert bestimmen die möglichen Eingaben, die ein bestimmtes Neuron erhält, während das Muster der axonalen arborization Potential postsynaptischen Ziele identifiziert. Die strukturelle Vielfalt von Neuronen hat seit den Tagen von Ramón y Cajal brech histologische Untersuchungen 1 geschätzt. Das Aufkommen von Einzelzellen-Aufnahmetechniken gezeigt, dass strukturell verschiedene Neuronen zeigen Unterschiede auch in Feuermuster und synaptische Eigenschaften. Die Vielfalt in der Struktur und Physiologie zeigt sich besonders deutlich in GABAergen inhibitorischen Neuronen 2,3. Darüber hinaus ist es zunehmend deutlich geworden, daß structurally ähnliche Neuronen können verschiedene neurochemische Marker und zeigen entsprechende funktionelle Unterschiede 4 auszudrücken. In ähnlicher Weise Neuronen mit den gleichen neurochemische Marker können 5-10 unterschiedliche Strukturen und Funktionen haben. So wird in der Praxis ergeben sich bei der Analyse der funktionellen Eigenschaften von Neuronen und ihre Rolle in dem Netzwerk definieren, sowohl die morphologischen und neurochemischen Identitäten. Sogar mit dem Aufkommen von Reportermauslinien spezifische neurochemische Marker Targeting, ist es oft notwendig , Morphologie und Subtyp Identität basierend auf Immunhistologie 11 zu bestimmen.

Das Standardverfahren verwendet, um Zellen zu charakterisieren, in akuten Hirnschnitten aufgezeichnet ist, sie mit biocytin oder Neurobiotin während der Aufnahme zu füllen, fixieren Sie die Abschnitte in Paraformaldehyd (PFA) im Anschluss an den Aufnahmen und Immunhistochemie verwenden, um die Morphologie und Neurochemie zu offenbaren. Da die Dicke der Abschnitte für slice Physiologie sind typischerweise 300 umoder mehr, und weil die meisten Antikörper nicht den ganzen Weg durch diese Tiefe zu durchdringen, müssen die Scheiben 60 um oder weniger zu ermöglichen für die gleichzeitige Immunofärbung für Biocytin und neurochemischen Markern 12-14 erneut geschnitten werden. Leider Resektion ist mühsam; Risiken Verlust von Gewebe während des Schneidens; und kann dazu führen, Gewebe Schrumpfung auf Differential, morphologische Rekonstruktionen zu komplizieren. Darüber hinaus könnte vorherige Kenntnis der Morphologie helfen, die Kandidatenmarker verengen, die wahrscheinlich von den Zellen exprimiert werden. Wir haben den Standard biocytin Immunhistologie Protokolle modifizierte serielle Verarbeitung von Abschnitten für die Gewinnung von Morphologie zuerst zu ermöglichen, und dann zur Identifizierung potenzieller neurochemischen Marker.

Immunhistochemie ist die Untersuchung der Antigenverteilung in Geweben oder Zellen , und kann mit einem Enzym, Fluoreszenzmarkierungen, radioaktive Elemente sichtbar gemacht werden, oder Goldkolloidpartikel 15. Das Verfahren involves primären Antikörper unter Verwendung eines oder mehrerer spezifischer Antigene durch die Verwendung von fluoreszierenden Sekundärantikörper gefolgt spezifisch markieren und zu verstärken, den primären Antikörper für die Visualisierung Targeting. Aufgrund der Notwendigkeit, die Fluoreszenzspektren von jeder sekundären Antikörpers ohne Überlappung zu unterscheiden, nur eine begrenzte Anzahl von Antigenen können gleichzeitig geprüft werden. So könnte vorherige Kenntnis der Morphologie bei der Auswahl der Kandidaten neurochemischen Marker für die Zellklassifizierung nützlich sein. Konzeptionell ist das Grundprinzip hinter serielle Verarbeitung von bereits gefärbten Schnitten basiert auf der Prämisse , die für ein Protein oder Peptid - Immunmarkierung nicht mit Antigenität und anschließender Immunmarkierung für einen strukturell unabhängig Peptid 16 stören sollte. Dieses Fehlen von Störungen ist aufgrund der Bindung der Antikörper an ein bestimmtes Protein Epitop auf einem Antigen und daher ermöglicht die gleichzeitige Färbung von mehreren Antigenen im gleichen Gewebe. Die Anzahl von Antigenen revealed durch Immunfärbung wird durch die Notwendigkeit für die nicht überlappenden Spektren der fluoreszierenden Sekundärantikörper und durch die Notwendigkeit , zu zielen einzelnen Antigene mit Antikörpern , die in verschiedenen Spezies begrenzt , um Kreuzreaktivität zu eliminieren , 17,18. Zwar ist dies die Argumentation hinter seriell anstatt gleichzeitige Markierung mit zwei verschiedenen Antikörpern, die unseres Wissens in Wechselwirkung treten kann, wurde eine Immunfärbung für ein zweites Antigen nicht nach der Beendigung der Immunmarkierung für ein oder mehrere Antigene auf montierten Abschnitten berichtet. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur seriellen Immunfärbung von zuvor gefärbt und montiert Abschnitte. Während wir uns ausführlich diesen Prozess für eine serielle Immunmarkierung Verfahren zur Gewinnung von Morphologie gefolgt von Protein / Peptid-Markern in dicken Abschnitten Färbung können die gleichen Verfahren wie auch in Standard, dünne histologische Schnitte verwendet werden. Darüber hinaus beschreiben wir einen praktischen Ansatz für aufgezeichnet Neuronen mit biocytin und den Prozess füllen das zu verdrängenElektrode aus der Zelle nach Abschluß der Aufnahmen die Füllung der axonalen und dendritischen Dorne von Neuronen zu optimieren, wie in unserem jüngsten Arbeiten 6,8 dargestellt.

Der wichtigste Vorteil der hier beschriebenen Vorgehensweise besteht darin, daß die Morphologie der aufgezeichneten Zelle kann vollständig vor der Resektion oder immunostain den Scheiben Versuch gewonnen und abgebildet werden. Obwohl Probleme mit dem Eindringen bestimmter Antikörper machen kann es für die sekundäre Immunfärbung der Resektion Scheiben notwendig, die hier ausgeführten Verfahren würde die Notwendigkeit beseitigen, um komplexe Neuronen aus mehreren Abschnitten rekonstruieren und Probleme aufgrund von Gewebeverlust und unterschiedliche Schrumpfung vermeiden würde, die den Wiederaufbau gefährden können folgende Resektion. Ein zusätzlicher Vorteil ist, dass die Verfahrenskosten zu reduzieren, Zeit, Mühe und teure Antikörper durch Immunfärbung begrenzen und Wieder sectioning zu Scheiben in denen Biocytin gefüllten Neuronen gewonnen werden. Die praktischste Aspekt ist die Anzeigesätzliche Immunfärbung, die die oben genannten Technik vor der Verwendung auf gefärbten Schnitten Monate durchgeführt werden kann. Insbesondere würde die Rückgewinnung von Morphologie erheblich reduzieren das Potential, daß die physiologischen Daten von den Zellen aufgrund einer Unfähigkeit verworfen ist eine grundlegende morphologische Charakterisierung des Zelltyps zu erhalten.

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Protokoll

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1. Biocytin Füllung während Electrophysiology

HINWEIS: Die Leser auf alternative Quellen für grundlegende Patch-Clamp - Aufnahme - Techniken und Instrumente 19-22 beziehen können, die auf hier nicht weiter ausgeführt. Die hier angegebenen Schritte gehen davon aus, dass die Ausrüstung und Verfahren für die Patch-Clamp-Aufnahmen sind bereits etabliert, und die Beschreibung wird auf Einzelheiten beschränkt werden, in Bezug auf biocytin füllend und Post-hoc-Immunfärbung. Alle Versuche in diesem Manuskript skizziert wurden an Ratten durchgeführt.

  1. Verwendung eines Vibratom bereiten Live Gehirnschnitte des gewünschten Bereichs in einer Dicke von 300-350 & mgr; m 23.
  2. Bereiten Sie eine interne Lösung , die 0,2% biocytin enthält , durch Zugabe von 2 mg biocytin zu 1 ml der internen Standardlösung 6. Für die besten Ergebnisse, beschallen die interne Lösung 10 - 15 min, bis die biocytin vollständig auflöst. Als nächstes laden Sie die interne Lösung in einer Spritze 1 ml mit einer 0,2 ausgestattet &# 160; & mgr; m Porengröße Polypropylen Filterspitze an einen Micro befestigt. Bewahren Sie diese ladende Spritze an einem kalten Packung die Stabilität des Mg-ATP und Na-GTP in der internen Lösung zu halten.
    HINWEIS: Eine interne Lösung, enthaltend Kaliumgluconat (126 mM K-Gluconat, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 4 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na-GTP und 10 mM Phosphokreatin) optimal für die Rückgewinnung bestimmter neurochemischen Markern, einschließlich parvalbumin, während Immunmarkierung. Nach unserer Erfahrung mit Cäsium und Chloridbasis interne Lösungen reduziert die Fähigkeit eine Immunfärbung für bestimmte neurochemische Marker zu erholen. Neurobiotin oder ein Zell-impermeante, fixierbaren, polar Tracers ein Fluorophor Alexa mit Biocytin Kombination kann als Alternative verwendet werden, um Biocytin.
  3. Unter Infrarot-Differentialinterferenzkontrast, die entsprechende Zelle für die Aufzeichnung zu visualisieren. Um eine Unterbrechung des Axons zu minimieren, nähern sich dem Zellkörper durch die Pipette entlang ihrer Achse eine Senkung der "Ansatz" f mitSalbung in den meisten Mikromanipulatoren. Stellen Ganzzellableitungen unter Infrarot - Differential - Interferenz - Kontrast mit Patch-Clamp - Physiologie Protokolle 19-22.
    HINWEIS: Vermeiden Sie die Zelle aus der Richtung des vermeintlichen Axon nähern, da sie die Axon trennen wird, visualisiert als Bleb am Schnittende (grüner Pfeil in Abbildung 1). Vermeiden Sie auch hohe positive Druck auf die Aufzeichnungs Pipette anwenden, während die Zelle nähern uns dem Auslaufen von biocytin zu minimieren, was zu hohen Hintergrundfärbung führen.

figure-protocol-1
Abbildung 1. Vorgeschlagene Ebene für Zellen für Biocytin Fills Annäherung. Das Bild zeigt eine Körnerzellen (GC) füllen mit biocytin während der Aufnahme, die (in rot mit 594-konjugierten Streptavidin) offenbaren biocytin verarbeitet wurde. Die GC hat seine Dendriten in der XY-Ebene ausgerichtet. Beachten Sie die abgetrennten KörnerzellAxon (grüner Pfeil) aufgrund Pipette Bewegung entlang der XY-Ebene. Beachten Sie, dass es dieses Neuron zu nähern entlang der XZ-Ebene ideal ist. Maßstabsbalken: 50 & mgr; m.

  1. In voltage clamp Konfiguration, bestimmen die gesamte Zellenkapazität und Serienwiderstand in Reaktion auf kleine (5 mV), kurz (30 ms) Spannungsschritte unter Verwendung der die Membran Testfunktion in Badebetrieb in einem Elektrodatenerfassung und -analyse-Software. Dadurch wird die Einrichtung von Ganzzellaufnahmebedingungen sorgen für biocytin-Füllung zu ermöglichen.
  2. Führen physiologische Aufnahmen in entweder Strom- oder Spannungs-Clamp-Modus nach Bedarf. Eine minimale Aufzeichnungszeit von> 10 min bei 34 ° C ist ideal.
    HINWEIS: Längere Aufnahmezeiten können für Studien bei Raumtemperatur durchgeführt werden musste.
  3. Nach Abschluss der physiologischen Aufnahmen Wiederherstellung der Patch-Clamp-Konfiguration, indem langsam die Aufzeichnungs Pipette in kleinen Schritten bewegt, nach oben alternierende (entlang der Z-Achse) undnach außen (entlang der X-Achse) in der Spannung-Clamp-Modus.
  4. Gleichzeitig überwachen die Kapazität und den Eingangswiderstand "membrane Test" -Funktion mit dem Verlust von kapazitiven Transienten und den Zusammenbruch der Stromantworten auf eine gerade Linie sichtbar zu machen, was auf die Wieder Abdichtung der Zelle und die Einrichtung einer Außen außerhalb an der Pipettenspitze Patch. bei einer depolarisierten Potential der Zelle Holding (-40 mV) wird die Wiederversiegelungsverfahren erleichtern.
    Hinweis: Dieses Verfahren zur Entfernung einer Zelle gewährleistet üblicherweise die vollständige Wiederherstellung der Soma und Dendriten. Gelten nicht positiven Druck auf die Aufzeichnungspipette während dieses Vorgangs oder während die Zelle aus der Pipette löst. Visualisierung des Somas der aufgenommenen Zelle in der Scheibe zeigt die erfolgreiche Trennung. Das Vorhandensein von Zelltrümmern oder ein Membranfleck am Ende der abgelösten Spitze weist in der Regel eine Dislokation des soma und wird nicht vollständig Zellmorphologie ergeben.
  5. Achterner die Pipette aus der Zelle Lösen 3 die Scheibe in der Aufnahmekammer behalten - 5 min den Transport des Farbstoffes zu dem distalen dendritischen und axonalen Prozesse zu gewährleisten.
  6. Übertragen Sie die Scheiben auf eine 24-Well-Platte mit 4% PFA für die Fixierung.
    ACHTUNG: PFA ist krebserregend, und geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich der Handschuhe und Gesichtsmaske, verwendet werden muss , Hautreizungen und Einatmen zu vermeiden. PFA ist brennbar und muss außerhalb der Reichweite von Feuer gehalten werden. PFA ist nie in den Abfluss entsorgt und müssen als chemischer Abfall gesammelt werden. PFA Fixierung müssen von den Bereichen isoliert werden für die Live-Scheibe Zubereitung verwendet Kontamination der Physiologie-Setup zu vermeiden, einschließlich Transferpipetten.
  7. 24 bis 48 h nach PFA Fixation, übertragen die Scheiben auf 0,1 M Phosphat-gepufferter Saline (PBS) für die Lagerung vor der Immunfärbung.
    HINWEIS: Im Idealfall biocytin Erholung und Immunfärbung sind am besten, wenn durchgeführt, bald nach der Fixierung, obwohl Färbung pro innerhalb von 7 d der Fixierung Ausbeuten gute Ergebnisse gebildet. für die Färbung durchgeführt bis zu und über 90 Tage nach der Fixierung 0,05% Natriumazid - Scheiben mit 0,02 in PBS gehalten werden. Obwohl über Nacht Fixierung in PFA gut für die meisten Antikörper arbeitet, ist es möglich, dass einige Antikörper am besten arbeiten, wenn die Dauer der Inkubation in Fixiermittel verringert wird. Die Fixierung in PFA für über 48 h reduziert die Verfügbarkeit von Antigenen und verringert die Chancen für eine erfolgreiche sekundäre Immunfärbung für neurochemische Marker.
    ACHTUNG: Natriumazid ist extrem gefährlich und kann reizend bei Kontakt mit der Haut oder den Augen oder bei der Einnahme oder Einatmen. Schwere Überbelichtung kann zum Tod führen. Die Kanzerogenität und Mutagenität der Verbindung sind nicht bekannt. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung einschließlich Handschuhe, Schutzbrille, einen Laborkittel und eine Staubmaske. Natriumazid wird niemals in den Abfluss entsorgt und müssen als chemischer Abfall gesammelt werden.
e_title "> 2. Die Färbung des ersten primären Antikörper und Biocytin

(Tag 1)
HINWEIS: Die nach dem Immunostaining Verfahren ist für frei schwebenden Abschnitte und kontinuierliche erfordert bei einer niedrigen Geschwindigkeit (2 Umdrehungen / min, rpm) auf einem Schüttler für alle Inkubationsschritte schütteln.

  1. Waschen Sie das Gewebe 3x für jeweils 10 Minuten in 0,1 M PBS (pH = 7,4).
    HINWEIS: 0,1 M PBS kann im Labor im Handel erworben oder hergestellt werden , wie folgt (macht 1 L): 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 und 0,24 g KH 2 PO 4 in 1 l dH 2 0.
    HINWEIS: Wenn die gewünschte neurochemische Marker bekannt ist, das für ein Protein / Peptid-Anfärbung kann gleichzeitig mit Biocytin Färbung durchgeführt werden (Schritte 2,2-2,4). Wenn Färbung nur für biocytin, gehen 2,5 Schritt.
  2. OPTIONAL: Block mit 10% Blocking Serum (BS; normales Ziegenserum (NGS), verdünnt in 0,3% Triton X-100 in PBS für 1 h bei RT).
    HINWEIS: Jede Vertiefung solltedas gleiche Volumen der Lösung erhalten; das empfohlene Volumen zwischen 250 bis 500 & mgr; l / Vertiefung. Die Auswahl des Blockierungsserum wird von der Spezies basieren , in der die Sekundärantikörper angehoben werden (beispielsweise wird NGS verwendet für Farbstoff-konjugiertem Ziege anti- (jeweiligen primären Antikörperspezies)). Wenn der Bedarf an verschiedenen Arten angehoben Sekundärantikörper zu verwenden, entsteht Abschnitte Immunfärbung, umfassen 10% jeder Normalserum in Blockierungsschritt (2) und 3% jeder Normalserum für die primären und sekundären Schritte Antikörper-Inkubation.
  3. (OPTION) Inkubieren Sie die Abschnitte in primärer Antikörper, CB 1 R (polyklonalen, Meerschweinchen) mit 0,3% Triton X-100 und 3% BS in 0,1 M PBS bei RT O / N. CB 1 R wird verwendet , Cannabinoid - Rezeptor Typ 1 - Expression zu identifizieren.
    Hinweis: Dieser Schritt ist optional und nicht die biocytin Füllung zu offenbaren erforderlich. 2 veranschaulicht einen Abschnitt für Biocytin und CB 1 R während des ersten Färbeverfahren bezeichnet. O / N incuBation bei RT ist ausreichend für die meisten der primären Antikörper; jedoch bestimmte primäre Antikörper, einschließlich CB 1 R erfolgt , benötigen 3-5 d Inkubation. Wenn die Inkubation länger als 1 d werden muss, wird empfohlen, bei 4 ° C inkubieren, da Triton X-100 permeabilisiert Scheiben und zum Zerfall des Gewebes bei längerer Inkubation bei Raumtemperatur führen kann. Umfassen eine negative Kontrolle primärem Antikörper in mindestens einem Abschnitt für jede Serie von Experimenten als Kontrolle für die Spezifität des sekundären Antikörpers fehlt. Für Negativkontrollen wird der primäre Antikörper weggelassen, aber die 0,3% Triton X-100 in 0,1 M PBS und BS zugegeben.

figure-protocol-2
Abbildung 2. Erfolgreiche CCK Anfärbung 1 Woche der Erholung von Biocytin Färbung und C Nach annabinoid Rezeptor Typ 1 (CB 1 R) - Kennzeichnung. (A - C) Konfokale Bilder bei 60X zeigt das Biocytin gefüllten Neuron (A) und CB 1 R Immunreaktivität (B), durch den Pfeil angedeutet ist . Der gleiche Abschnitt wurde nach 1 Woche (C) für die CCK - Immunfärbung verarbeitet. Die Überlagerung von Bildern wird in D gezeigt. CCK Immunreaktivität wurde mit weit rot zeigte, und wurde Pseudo-farbig in Cyan. (E) Morphologische Rekonstruktion der biocytin gefüllten Zelle in A. Beachten Sie, dass die biocytin und CB 1 R - Färbung zeigen sich auch nach dem zweiten CCK - Immunfärbung. Beachten Sie auch die erwartete Verteilung von CB 1 R und CCK - Immunfärbung Muster. (F - H) vergrößertes Bild der Axon aus der Zelle, wie in A, zeigen eine enge Zusammenarbeit Lokalisierung von biocytin und CB 1 R in Axonen (Pfeilspitzen). Maßstabsbalken: 50 & mgr; m (A - D), 100 & mgr; m (E) und 10 & mgr; m ( et al wiedergegeben. 2015 9. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

(Tag 2)

  1. Waschen Sie die Gehirnschnitte für 10 min 3 x jeweils in 0,1 M PBS (pH = 7,4).
  2. Inkubieren der Abschnitte in Streptavidin roten Farbstoff-Konjugat (Konzentration: 1: 1,000; Anregung: 594 nm mit Emission im sichtbaren roten Spektrum) mit 0,3% Triton X-100 und 3% BS in 0,1 M PBS bei 4 ° CO / N in der dunkel (in Aluminiumfolie eingewickelt), um die biocytin zu offenbaren. Optional: Fügen Sie einen sekundären Antikörper, Ziege-Anti-Meerschweinchen (Konzentration: 1: 500; Anregung: 488 nm und Emission in grün), mit der obigen Inkubation, wenn die optionale primäre Inkubation folgende in Schritt 2.3.
    HINWEIS: Sekundäre Antikörper wird nur, wenn die optionale primäre Antikörper-Färbung (Schritt 2.3) durchgeführt wird, benötigt werden. Zur Visualisierung biocytin, eine streptavidin-Fluorophor - Konjugat mit einem Emissionsspektrum in rot wird empfohlen, da es eine feinere Axone im Detail zu visualisieren hilft und mit besseren Kontrast (Abbildungen 1 - 3). Während Doppel- oder Dreifachimmunfärbung, um miteinander Kreuzreaktivität von sekundären Antikörpern zu vermeiden, fügen sekundäre Antikörper nach dem anderen in einer seriellen Art und Weise (2 h Intervall zwischen seriellen Ergänzungen der Antikörper ist ausreichend). 3A stellt eine biocytin gefüllte Zelle ohne den optionalen primären Antikörperfärbung verarbeitet und vor der Resektion abgebildet.

figure-protocol-3
Abbildung 3. Erfolgreiche Zweite Immunostaining nach der Wiederherstellung von Biocytin Morphologie und Resektion. (A1) konfokale Bild eines 300 & mgr; m in Scheiben schneiden die Erholung der dendritischen Morphologie eines biocytin gefüllten Zelle zeigt. ( A2) Membranspannung Spuren des Neurons in Reaktion auf +500 und -100 pA Strominjektionen. (B) Die Gewinnung des biocytin gefüllten soma in einem 50 & mgr; m Abschnitt erhalten , nachdem die 300 & mgr; m Abschnitt Resektion (in A1) nach der Montage und Bildgebung. (B2) Nachfolgende Immunfärbung des dünnen Abschnitts ergab Kolokalisation des biocytin gefüllten soma (rechtes Bild) mit CCK (Mitte). Das fusionierte Bild wird auf der rechten Seite dargestellt. Maßstabsbalken: 50 & mgr; m. Panel - A2 wird mit Genehmigung von Yu et al wiedergegeben. In der Presse, 25. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

(Tag 3)

  1. Waschgehirnschnitte 3x für jeweils 10 Minuten in 0,1 M PBS (pH = 7,4).
  2. Um die Fluoreszenz zu schützen und Wiederfärbung in der Zukunft zu erleichtern, montieren Sie die Sektionen in einer auf Wasser basierenden Montagemedium und die Kanten des Deckglases mit klarem Nagellack versiegeln.
    HINWEIS: Es ist am besten Abschnitte Restain so früh wie möglich Schwierigkeiten zu vermeiden, bei der Entfernung der Nagellack von der Rutsche, Schimmelpilzbefall und Austrocknung des Gewebes aufgrund einer Leckage des Befestigungsmediums aus dem Glasträger. Mikrobielle Kontamination kann durch Verwendung von 0,02% Natriumazid in PBS verhindert werden.
    ACHTUNG: Natriumazid ist sehr giftig und entzündlich , wenn es mit Wasser in Kontakt ist. Bitte beziehen Sie sich auf die Standardbetriebsverfahren für die Handhabung und Entsorgung von gefährlichen Chemikalien.
    (Tage 4 - 7)
  3. Führen konfokale Bildgebung mit einer Anregung bei 594 und 488 nm und bei einer Vergrößerung von 20X oder 40X zu Biocytin gefüllten Neuronen in roten und neurochemischen Markern (CB 1 R) in grün offenbaren. Beurteilen colabeling (Abbildung 2).
  4. Stellen Sie die Kamera Belichtung auf weniger als 100 ms Photobleaching und OBTA zu vermeidenin der konfokalen Bildstapeln der axonalen und dendritischen Dorne des gesamten Neurons. Verwenden konfokale Bildstapel und Neuron Tracing-Software-Pakete, die neuronale Morphologie zu rekonstruieren.

3. Die Färbung des zweiten primären Antikörpers:

HINWEIS: Während der zweite kann Immunofärbung Schritt 90 d nach der ersten Färbung durchgeführt werden, eine optimale Färbung erreicht, wenn der zweite primäre Antikörper-Färbung innerhalb von 7 durchgeführt wird - d 10.

(Nach 7-90 d)

  1. Tragen Sie Aceton auf einem Wattestäbchen und der Streifen den Nagellack aus der Glasträger.
  2. Entfernen Sie das Deckglas sorgfältig fein Spitze einer Pinzette und legte ein paar Tropfen von 0,1 M PBS auf den Abschnitten.
  3. Entfernen Sie vorsichtig die Abschnitte von der Folie einen feinen Pinsel verwenden und waschen Sie sie in 0,1 M PBS für 24 bis 48 h auf einem Schüttler in Aluminiumfolie bei schwachem Licht bedeckt bei 4 o C
    HINWEIS: Es ist wichtig, mit einem zu decken Abschnitteluminum Folie gegen Ausbleichung vermeiden.
  4. Um eine vollständige Entfernung des Eindeckmediums gewährleisten, waschen Sie die Abschnitte 1 - 2x am folgenden Tag in 0,1 M PBS für jeweils 10 min.
  5. Weiter mit der Inkubation in der zweiten primären Antikörper ( zum Beispiel Cholecystokinin, ein Neuropeptid gefunden in bestimmten GABAergen Inter (CCK; Konzentration: 1: 1,000; monoklonaler Maus - Antikörper)) für 1 d (Figur 2).
    Hinweis: Dieses Verfahren ist ähnlich wie 2.3 zu Schritt aber verwendet einen anderen Antikörper. Zusätzlich wird der Blockierungsschritt während des Wiederfärbungs weggelassen.
  6. Waschen Sie die Gehirnschnitte dreimal für jeweils 10 Minuten in 0,1 M PBS (pH = 7,4).
  7. Fleck mit dem Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörpers Ziege-Anti-Maus (Konzentration: 1: 500; Anregungswellenlänge: 647 nm), um sicherzustellen, dass die Anregungs-Emissionsspektren des sekundären Antikörpers nicht überlappen mit Streptavidin (Konzentration: 1: 1,000; Anregungswellenlänge: 594 nm) und vor ImmunofluoreszenzFlecken.
  8. Montieren Sie die Abschnitte in wässrigen Eindeckmittel und die Ränder des Deckglases mit klarem Nagellack.
    HINWEIS: Speichern der Abschnitte bei 4 ° C in einer lichtundurchlässigen Speicherfeld, um die Fluoreszenz zu schützen.

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Ergebnisse

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Nach dem erfolgreichen Abschluss behalten die Abschnitte der biocytin Füllung und die Immunmarkierung in Schritt 2 durchgeführt und kann mit Hilfe einer konfokalen oder Epifluoreszenzmikroskopie abgebildet werden. Zusätzlich wurde die bearbeiteten Abschnitte auch Immunofärbung für das markierte Antigen während der nachfolgenden Verarbeitung in Schritt 3 in dem Abschnitt in 2 dargestellt, die Morphologie einer Biocytin gefüllten Neuron in einem dicken Abschnitt (300 &...

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Diskussion

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Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls

die gepatchte Zelle mit biocytin Füllung ist der wichtigste Schritt, um die vollständige Wiederherstellung der Morphologie zu gewährleisten. Für vollständige Erholung der Zelle, ist es wichtig, eine optimale Schichtorientierung zu wählen Sie das Durchtrennen von Prozessen während des Schneidens zu minimieren. Diese Orientierung kann auf der Schaltung und Zelltyp unter Prüfung auf Basis unterscheiden. Als nächstes ist es notwendig, ...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren möchten die Unterstützung von NIH / NINDS R01 NS069861 und NJCBIR CBIR14IRG024 zu VS. anzuerkennen

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
NaClSigmaS7653Immunfärbung
KClFluka60129Immunfärbung
Na2HPO4 SigmaS7907Immunfärbung
KH2PO4 Sigma229806Immunfärbung
Triton X-100SigmaT8787Immunfärbung
Meerschweinchen Anti CB1 SigmaAf530-1Immunfärbende
Maus anti CCKCURE,UCLA mit freundlicher Genehmigung von G. OhningImmunfärbung
Kaninchen anti ParvalbuminSwantPV27Immunfärbung
Streptavidin, Alexa Fluor KonjugatMolekulare SondenS11227Immunfärbung
Normales Ziegenserum (NGS)SigmaG9023Immunfärbung
Vectashield Vector LabsH-1000Immunfärbung
Sekundäre AntikörperInvitogen Molekulare SondenAlexa Fluor konjugierte FarbstoffeImmunfärbung
Labnet Orbit Low Speed ShakerBioexpressS-2030-LSImmunfärbezange
Dumont11231-30Immunfärbung
ObjektträgerOrdner EMS71520Immunfärbung
Vibratome VT 1200 SLeica14048142066Elektrophysiologie
Multiclamp 700B VerstärkerMolekulare BauelementeMulticlamp 700BElektrophysiologie
pCLAMP 10 SoftwareMolekulare BauelementepCLAMP 10 Elektrophysiologie
DigitizerMolecular DevicesDigidata 1440 DigitizerElektrophysiologie
FilterspitzenNalgene171-0020Elektrophysiologie
UltraschallgerätFisher Scientific15-335-100Elektrophysiologie
MicroloaderEppendorf930001007Elektrophysiologie
BiocytinSigmaB4261Elektrophysiologie

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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