Summary
Detta protokoll presenterar en metod för den morfologiska återvinning av nervceller lappade under elektrofysiologiska inspelningar med biocytin fyllning och efterföljande immunhistokemisk efterbearbetning. Vi visar att tjocka biocytin fyllda sektioner som färgats och täck kan restained med andra primära dagar eller månader antikropps senare.
Abstract
Elektrofysiologiska inspelningar av celler med patch clamp-tekniken har gjort det möjligt att identifiera olika neuronala typer som baseras på bränning mönster. Införandet av biocytin / neurobiotin i inspelningen elektroden tillåter post-hoc återhämtning av morfologiska detaljer som är nödvändiga för att bestämma den dendritiska arborization och regionerna som omfattas av axoner i de inspelade nervceller. Men med tanke på förekomsten av morfologiskt liknande nervceller med olika neurokemiska identiteter och funktioner, immunhistokemisk färgning för cell-typspecifika proteiner är viktigt att slutgiltigt identifiera neuroner. Att förbli ansluten till nätet, är hjärnsektioner för fysiologiska inspelningar beredd med en tjocklek av 300 pm eller större. Men hindrar denna tjocklek ofta immunhistologisk efterbearbetning på grund av problem med penetrations antikropp, vilket nödvändiggör resektion av vävnad. Resektion av skivor är en utmanande konst, ofta Resulting i förlust av vävnad och morfologi av celler från vilka elektro data erhölls, vilket gör data oanvändbara. Eftersom återvinning av morfologi skulle begränsa dataförlust och guide i valet av neuronala markörer, har vi antagit en strategi för att återhämta sig cellmorfologi först, följt av sekundär immunfärgning. Vi introducerar ett praktiskt förhållningssätt till biocytin fylla under fysiologiska inspelningar och efterföljande serienummer immunfärgning för återvinning av morfologi, följt av restaining sektioner för att bestämma neurokemiska identiteten. Vi rapporterar att sektioner som fylldes med biocytin, fixerade med paraformaldehyd (PFA), färgade, och täck kan tas bort och restained med andra primära dagar antikropps senare. Denna restaining innebär avlägsnande av täckglaset, tvättningen av sektionerna i en buffertlösning, och inkubationen av primära och sekundära antikroppar för att avslöja den neurokemiska identiteten. Metoden är fördelaktig för att eliminera daten förlust på grund av en oförmåga att återhämta sig morfologi och för att minska ner de neurokemiska markörer som skall testas baserat på morfologi.
Introduction
Hjärnan är känd för mångfalden i de strukturella och funktionella egenskaper hos de enskilda neuronala element. Förstå roller distinkta neuronala typer i hjärnans funktion och patologi kräver karakterisering och otvetydig identifiering av nervceller. Strukturellt morfologiska särdrag som definieras av somato-dendritiska plats bestämma de potentiella ingångar som en viss neuron tar emot, medan mönstret av axonal arborization identifierar potentiella postsynaptiska mål. Den strukturella mångfalden av nervceller har uppskattats ända sedan Ramón y Cajal s banbrytande histologiska studier 1. Tillkomsten av encelliga inspelningsteknik visade att strukturellt distinkta nervceller visar också skillnader i bränning mönster och synaptiska egenskaper. Mångfalden i struktur och fysiologi är särskilt tydligt i GABAergic hämmande nervceller 2,3. Dessutom har det blivit alltmer uppenbart att structurally liknande neuroner kan uttrycka olika neurokemiska markörer och visa motsvarande funktionella skillnader 4. På samma sätt kan nervceller med samma neurokemiska markörer har olika strukturer och funktioner 5-10. Således, i praktiken, analysen av de funktionella egenskaperna av nervceller och deras roll i nätverket innebär att definiera både morfologiska och neurokemiska identiteter. Även med tillkomsten av reporter mus linjer riktade mot särskilda neurokemiska markörer, är det ofta nödvändigt att bestämma morfologi och subtyp identitet baserad på immunhistologi 11.
Standardmetoden används för att karakterisera celler som spelats in akut hjärnan skivor är att fylla dem med biocytin eller neurobiotin under inspelningen, fixa avsnitten i paraformaldehyd (PFA) efter inspelningarna, och använda immunohistokemi att avslöja morfologi och neurokemi. Eftersom tjockleken av sektioner för skiva fysiologi är typiskt 300 umeller mer, och eftersom de flesta antikroppar misslyckas att penetrera hela vägen genom det djup, skivorna måste återsektioneras till 60 pm eller mindre för att möjliggöra samtidig immunfärgning för biocytin och neurokemiska markörer 12-14. Tyvärr är resektion mödosam; riskerar förlust av vävnad under snittning; och kan leda till differential vävnad krympning, vilket komplicerar morfologiska rekonstruktioner. Dessutom, tidigare kunskap om morfologi kunde hjälpa begränsa kandidatmarkörer som sannolikt kommer att uttryckas av cellerna. Vi har ändrat standard biocytin immunhistologi protokoll för att möjliggöra serie behandling av avsnitten först för återvinning av morfologi och sedan för identifiering av potentiella neurokemiska markörer.
Immunohistokemi är studiet av antigendistributionen i vävnader eller celler och kan visualiseras med användning av ett enzym, fluorescerande markörer, radioaktiva element, eller guld kolloidpartiklarna 15. Förfarandet involves använder primära antikroppar för att specifikt märka och amplifiera en eller flera specifika antigener, följt av användning av fluorescerande sekundära antikroppar riktade mot den primära antikroppen för visualisering. På grund av behovet att skilja fluorescensspektra för varje sekundär antikropp utan överlappning, kan endast ett begränsat antal antigener undersökas samtidigt. Således kan förkunskaper i morfologi vara användbar vid val kandidatneurokemiska markörer för cellklassificering. Begreppsmässigt är logiken bakom serie bearbetning av redan färgade snitt baserat på antagandet att immunmärkningen för ett protein eller en peptid inte bör störa antigenicitet och efterföljande immunomärkning för en strukturellt oberoende peptid 16. Denna avsaknad av interferens beror på bindning av antikroppar till ett specifikt protein epitop på ett antigen och således medger samtidig färgning av multipla antigener i samma vävnad. Antalet antigener Revealed genom immunfärgning är begränsad av behovet av icke-överlappande spektra för de fluorescerande sekundära antikroppar och av behovet av att rikta individuella antigener med antikroppar framkallade i olika arter för att eliminera korsreaktivitet 17,18. Även om detta är resonemanget bakom serie snarare än samtidig märkning med två distinkta antikroppar som kan interagera, så vitt vi vet, immunfärgning för en andra antigen har inte rapporterats efter avslutad immunmärkningen för en eller flera antigener på monterade sektioner. Här beskriver vi en metod för seriell immunofärgning av tidigare färgats och monterade sektioner. Medan vi detalj denna process för en serie immunomärkning förfarande för indrivning av morfologi följt av färgning för protein / peptidmarkörer i tjocka sektioner, kan på samma sätt användas i standard, tunna histologiska sektioner också. Dessutom beskriver vi ett praktiskt tillvägagångssätt för att fylla inspelade nervceller med biocytin och processen för att lossaelektroden från cellen efter slutförandet av inspelningar för att optimera fyllningen av axonal och dendritiska hållare av nervceller, som presenteras i vår senaste arbete 6,8.
Den mest avgörande fördelen med det förfarande som beskrivs här är att morfologin av det inspelade cellen kan återhämtat sig helt och avbildas innan du resektion eller immunostain skivorna. Även problem med penetrationen av vissa antikroppar kan göra det nödvändigt att resektion skivor för sekundär immunfärgning, skulle de förfaranden som anges här eliminerar behovet av att rekonstruera komplexa neuroner från flera avsnitt och skulle undvika problem på grund av förlust vävnad och olika krympning, som kan äventyra rekonstruktion följande resektion. En extra fördel är att processen kommer att minska kostnader, tid, ansträngning, och dyra antikroppar genom att begränsa immunfärgning och återsnittning till segment i vilka biocytin fyllda neuroner återvinns. Det mest praktiska aspekten är annonsenditionella immunfärgning som kan utföras på sektioner färgade månader innan användning av ovannämnda teknik. Framför allt skulle återvinning av morfologin avsevärt minska risken att fysiologiska data från cellerna kasseras på grund av en oförmåga att få en grundläggande morfologisk karakterisering av celltypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. biocytin Fyllning under Elektrofysiologi
OBS: Läsarna kan hänvisa till alternativa källor för grundläggande patch-clamp inspelningstekniker och instrumentering 19-22, som inte utvecklats vidare här. Stegen som beskrivs här förutsätter att utrustning och förfaranden för patch-clamp inspelningar redan är etablerade, och beskrivningen kommer att begränsas till detaljerna i samband med biocytin-fyllning och post-hoc immunfärgning. Alla experiment som beskrivs i detta manuskript utfördes på råttor.
- Med användning av en vibratom, förbereda levande hjärnsektioner av den önskade regionen vid en tjocklek av 300 till 350 | im 23.
- Bered en intern lösning innehållande 0,2% biocytin genom att tillsätta 2 mg biocytin till 1 ml intern lösning 6. För bästa resultat, Sonikera intern lösning för 10-15 min tills biocytin upplöses helt. Därefter laddar intern lösning i en 1 ml spruta med en 0,2 &# 160; um porstorlek polypropen filter spets fäst vid en micro. Hålla denna matat sprut på en kall förpackning för att upprätthålla stabiliteten av Mg-ATP och Na-GTP i den inre lösningen.
OBS: En intern lösning innehållande kaliumglukonat (126 mM K-glukonat, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 4 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na-GTP, och 10 mM phosphocreatine) är optimal för återvinning av vissa neurokemiska markörer, inklusive parvalbumin under immunmärkningen. I vår erfarenhet, med hjälp av cesium och kloridbaserade intern lösningar minskar förmågan att återhämta sig immunfärgning för vissa neurokemiska markörer. Neurobiotin eller ett cell impermeant, fixerbara, polar tracer som kombinerar en Alexa fluoroforen med biocytin kan användas som ett alternativ till biocytin. - Under infrarött differentialinterferenskontrast, visualisera den lämpliga cellen för inspelning. För att minimera eventuella störningar i axonet närmar cellkroppen genom att sänka pipetten längs sin axel med hjälp av "metoden" fsmörjelse finns i de flesta micromanipulators. Upprätta helcells-inspelningar under infrarött differential interferens kontrast med patch-clamp fysiologi protokoll 19-22.
OBS: Undvik närmar cellen från riktningen för den förmodade axon, eftersom det kommer att skära av axon, visualiseras som en Bleb vid den avskurna änden (grön pil i figur 1). Undvik också att tillämpa högt övertryck till inspelnings pipetten samtidigt närmar sig cellen för att minimera spill av biocytin, vilket resulterar i hög bakgrundsfärgning.
Figur 1. Förslag till Plan för Närmar celler för biocytin fyllningar. Bilden visar en Granule Cell (GC) fyllas med biocytin under inspelning som har behandlats för att avslöja biocytin (i rött med hjälp av 594-konjugerad streptavidin). GC har sina dendriter orienterade i XY-planet. Lägg märke till den avskilda granulat cellaxon (grön pil) på grund av pipett rörelse längs XY-planet. Observera att det är idealiskt för att närma sig denna neuron längs XZ-planet. Skala bar: 50 pm.
- I klämkonfiguration spänning, fastställa helcells-kapacitans och seriemotstånd som svar på små (5 mV), korta (30 ms) spänningssteg med hjälp av användning av membrantestfunktionen i badet läge i en elektro datainsamling och analys. Detta kommer att säkerställa att det inrättas helcells-inspelningsförhållanden för att möjliggöra biocytin fyllning.
- Genomför fysiologiska inspelningar i antingen ström- eller spänningsklämläge vid behov. En minsta inspelningstid på> 10 min vid 34 ° C är idealiskt.
OBS: Längre inspelningstider kan behövas för studier utförda vid rumstemperatur. - Vid fullbordande av de fysiologiska inspelningar, återupprätta patch-clamp konfigurationen genom att långsamt förflytta inspelnings pipetten i små steg, omväxlande uppåt (längs Z-axeln) ochutåt (längs X-axeln) i spänning-clamp-läge.
- Samtidigt övervaka kapacitans och input motstånd med hjälp av "membrantest" funktion för att visualisera förlust av kapacitiva transienter och kollapsen av de nuvarande svar på en rak linje, vilket indikerar åter tätning av cellen och inrättandet av en utanför-utanför patch på pipettspetsen. Håller cellen vid en depolariserade potential (-40 mV) kommer att underlätta återförseglingsprocessen.
OBS: Detta förfarande för avlägsnande av en cell säkerställer typiskt fullständig återhämtning av soma och dendriter. Applicera inte positivt tryck till inspelnings pipetten under detta förfarande eller samtidigt lösgöra cellen från pipetten. Visualisering av soma av det inspelade cellen i segmentet indikerar framgångsrik tillbakadragande. Förekomsten av cellrester eller ett membran patch i slutet av den fristående spetsen indikerar typiskt förskjutning av soma och kommer inte att ge fullständig cellulär morfologi. - Akterer loss pipetten från cellen, behålla skiva i inspelningen kammaren för 3-5 minuter för att säkerställa transport av färgämnet till distala dendritiska och axonal processer.
- Överföra skivorna till en 24-brunnsplatta innehållande 4% PFA för fixering.
VARNING: PFA är cancerframkallande, och lämplig personlig skyddsutrustning, inklusive handskar och en ansiktsmask, måste användas för att undvika hudirritation och inandning. PFA är brandfarligt och måste hållas utom räckhåll för brand. PFA är aldrig kastas i avloppet och måste samlas in som kemiskt avfall. PFA fixering måste isoleras från områden som används för levande skiva beredning för att undvika förorening av fysiologi installationen, inklusive överföringspipetter. - 24 - 48 h efter PFA fixering, överföra skivorna till 0,1 M fosfatbuffrad saltlösning (PBS) under lagring före immunfärgning.
OBS: Helst biocytin återhämtning och immunfärgning är bäst när de utförs strax efter fixering, även om färgnings per bildas inom 7 d från fixerings ger goda resultat. Skivor kan upprätthållas i PBS med 0,02 till 0,05% natriumazid för färgning utföras upp till och över 90 dagar efter fixering. Även natten fixering i PFA fungerar bra för de flesta antikroppar, är det möjligt att vissa antikroppar fungerar bäst när varaktigheten av inkubation i fixativ minskar. Fixering i PFA för över 48 timmar minskar tillgången på antigen och minskar chanserna för framgångsrik sekundär immunfärgning för neurokemiska markörer.
VARNING: Natriumazid är extremt farlig och irriterande vid kontakt med huden eller ögonen eller efter intag eller inandning. Svår överexponering kan leda till döden. Den cancerframkallande och mutagena av föreningen är inte kända. Använd lämplig personlig skyddsutrustning inklusive handskar, skyddsglasögon, skyddsrock, och damm respirator. Natriumazid är aldrig kastas i avloppet och måste samlas in som kemiskt avfall.
(Dag 1)
OBSERVERA: Följande immunfärgning procedur gäller för fritt flytande sektioner och kräver kontinuerlig skakning vid en låg hastighet (2 varv / min, rpm) på en skakanordning för alla inkubationssteg.
- Tvätta vävnads 3x under 10 minuter vardera i 0,1 M PBS (pH = 7,4).
OBS: 0,1 M PBS kan kommersiellt skaffa eller framställa i laboratoriet enligt följande (gör ett L): 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4, och 0,24 g av KH 2 PO 4 i en L dH 2 0.
OBS: Om den önskade neurokemiska markör är känd, färgning för ett protein / peptid kan utföras samtidigt med biocytin färgning (steg från 2,2 till 2,4). Om färgning endast biocytin, gå vidare till steg 2,5. - EXTRA: Block med 10% blockeringsserum (BS; normalt getserum (NGS) utspätt i 0,3% Triton X-100 i PBS under 1 h vid RT).
OBS: Varje brunn börmottar samma volym av lösningen; den rekommenderade volymen är mellan 250-500 mikroliter / brunn. Valet av den blockerande serum är baserad på de arter i vilka de sekundära antikropparna är upphöjda (t.ex., är NGS används för färgämne-konjugerad get-anti- (motsvarande arter primär antikropp)). Om behov uppstår att använda sekundära antikroppar alstrade i olika arter för att immunostain sektioner, innefattar 10% av varje normalt serum i blockerande steg (2) och 3% av varje normalt serum för de primära och sekundära antikropp inkubationssteg. - (Tillval) Inkubera avsnitt i primär antikropp, CB 1 R (polyklonal, marsvin) med 0,3% Triton X-100, och 3% BS i 0,1 M PBS vid RT O / N. CB 1 R används för att identifiera CB1-receptor-expression.
OBS: Detta steg är valfritt och behöver inte avslöja biocytin fyllning. Figur 2 illustrerar en sektion märkt biocytin och CB 1 R under den första färgningsprocessen. O / N incubation vid RT är tillräcklig för de flesta av de primära antikropparna; emellertid vissa primära antikroppar, inklusive CB 1 R, kräver 3-5 d av inkubation. Om inkubationen behöver vara längre än 1 d, är det rekommenderat att inkubera vid 4 ° C, eftersom Triton X-100 kan permeabilisera skivor och kan leda till en upplösning av vävnaden under förlängd inkubering vid rumstemperatur. Innefattar en negativ kontroll som saknar primär antikropp i åtminstone ett avsnitt för varje serie av experiment som en kontroll för specificiteten hos den sekundära antikroppen. För negativa kontroller, är den primära antikroppen utelämnats, men 0,3% Triton X-100 i 0,1 M PBS och BS tillsättes.
Figur 2. Framgångsrik CCK färgning en vecka efter indrivning av biocytin Färgning och C annabinoid receptor typ 1 (CB 1 R) - <strong> märkning. (A - C) Confocal bilder på 60X visar biocytin fyllda neuron (A) och CB 1 R immunreaktivitet (B), som indikeras av pilen. Samma avsnitt bearbetades för CCK immunfärgning efter en vecka (C). Överlagring av bilderna visas i D. CCK immunoreaktivitet avslöjades med hjälp av långt rött och pseudo-färgade i cyan. (E) Morfologisk rekonstruktion av biocytin fyllda cellen i A. Observera att biocytin och CB 1 R färgning är uppenbara även efter den andra CCK immunfärgning. Noterar också den förväntade fördelningen av CB 1 R och CCK immunfärgning mönster. (F - H) förstorad bild av axonet från cellen, som i A, visar nära samlokalisering av biocytin och CB en R i axoner (pilhuvuden). Skalstreck: 50 ^ m (A - D), 100 pm (E), och 10 | j, m (
(Dag 2)
- Tvätta hjärnan sektioner 3x under 10 minuter vardera i 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- Inkubera avsnitt i streptavidin rött färgämne konjugat (koncentration: 1: 1000; excitation: 594 nm med emission i det synliga röda spektrum) med 0,3% Triton X-100 och 3% BS i 0,1 M PBS vid 4 ° CO / N mörk (inslagna i aluminiumfolie) för att avslöja biocytin. EXTRA: Ta med en sekundär antikropp, get-anti-marsvin (koncentration: 1: 500; excitation: 488 nm och emission i grönt), med ovanstående inkubation om följande tillval primära inkubation i steg 2,3.
OBS: Sekundär antikropp kommer att behövas endast om tillvals färgning primär antikropp (steg 2,3) utförs. Att visualisera biocytin, en streptavidin-fluoroforen konjugat med ett emissionsspektrum i rött rekommenderas, eftersom det hjälper att visualisera finare axoner i detalj och med bättre kontrast (figur 1 - 3). Under dubbel eller trippel immunfärgning, för att undvika korsreaktivitet av sekundära antikroppar med varandra, lägga sekundära antikroppar en efter den andra på ett seriellt sätt (2 h intervall mellan seriella tillsatser av antikropparna är tillräcklig). Figur 3A visar en biocytin fylld cell behandlas utan tillval färgning primära antikroppen och avbildas före resektion.
Figur 3. Framgångsrika andra immunfärgning efter indrivning av biocytin morfologi och resektion. (A1) Confocal bilden av en 300 pm skiva som visar återhämtning av den dendritiska morfologi av en biocytin fylld cell. (<strong> A2) Membranspännings spår av neuron som svar på +500 och -100 pA aktuella injektioner. (B) Utvinning av biocytin fyllda soma i en sektion 50 um erhålls efter resektion sektionen (A1) 300 pm efter montering och bildbehandling. (B2) Efter immunfärgning av den tunna delen avslöjade colocalization av biocytin fyllda soma (högra panelen) med CCK (mitten panel). Den sammanslagna bilden illustreras i den högra panelen. Skala bar: 50 pm. Panel A2 återges med tillstånd från Yu et al. , In press 25. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
(Dag 3)
- Tvätta hjärnsektioner 3x under 10 minuter vardera i 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- För att skydda fluorescens och underlätta åter färgning i framtiden, montera sektioner i ett vattenbaserat monteringsmedium och försegla kanterna på täckglas med klart nagellack.
OBS: Det är bäst att restain sektioner så tidigt som möjligt för att undvika svårigheter i att ta bort nagellack från bilden, mögel angrepp och uttorkning av vävnad på grund av läckage av monteringsmedium från objektglaset. Mikrobiell kontamination kan förhindras genom användning av 0,02% natriumazid i PBS.
VARNING: Natriumazid är mycket giftigt och brandfarligt när det är i kontakt med vatten. Se standardrutiner för hantering och förvaring av farliga kemikalier.
(Dag 4 - 7) - Utför konfokal avbildning med excitation vid 594 och 488 nm och vid en förstoring av 20X eller 40X att avslöja biocytin fyllda neuroner i rött och neurokemiska markörer (CB 1 R) i grönt. Bedöma colabeling (Figur 2).
- Ställ in kamerans exponering mot mindre än 100 ms för att undvika fotoblekning och obtai konfokala bildstaplar av axonala och dendritiska hållare för hela neuron. Använd konfokala bildstaplar och neuron spåra programvarupaket för att rekonstruera neuronala morfologi.
3. Färgning av andra primär antikropp
OBS: Även om andra immunfärgning steget kan utföras 90 d efter den första färgning, är optimal färgning uppnås om den andra primära antikroppen färgning utförs inom 7-10 d.
(Efter 7-90 d)
- Applicera aceton till en bomullstuss och band nagellack bort av objektglas.
- Ta bort täck försiktigt med fin spets pincett och lägga några droppar av 0,1 M PBS på sektionerna.
- Försiktigt bort avsnitten från bilden med hjälp av en fin pensel och tvätta dem i 0,1 M PBS under 24 - 48 timmar på en skak täckt av aluminiumfolie i svagt ljus vid 4 ° C
OBS: Det är viktigt att täcka sektioner med enLuminum folie för att undvika fotoblekning. - För att säkerställa fullständigt avlägsnande av monteringsmedium, tvätta sektionerna 1 - 2x följande dag i 0,1 M PBS under 10 min vardera.
- Fortsätt med inkubering i den andra primära antikroppen (t.ex., kolecystokinin, en neuropeptid som finns i vissa GABAerga intemeuroner (CCK; koncentration: 1: 1000; mus monoklonal antikropp)) för en d (Figur 2).
OBS: Detta förfarande liknar steg 2,3 men använder en annan antikropp. Dessutom är blockeringssteget utelämnas under återfärgning. - Tvätta hjärnan sektioner tre gånger under 10 minuter vardera i 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- Fläcken med fluoroforen-konjugerad sekundär antikropp av get-anti-mus (koncentration: 1: 500; excitationsvåglängd: 647 nm), och se till att excitation-emissionsspektra för den sekundära antikroppen inte överlappar med streptavidin (koncentration: 1: 1000; excitationsvåglängd: 594 nm) och före immunofluorescensfläckar.
- Montera sektionerna i vattenhaltigt monteringsmedium och försegla kanterna på täckglas med klart nagellack.
OBS: Förvara sektionerna vid 4 ° C i en ogenomskinlig förvaringsbox för att skydda fluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter ett framgångsrikt slutförande, sektionerna behåller biocytin fyllning och immunmärkning i steg 2 och kan avbildas med konfokal eller epifluorescensmikroskopi. Dessutom kommer de bearbetade sektioner också visa immunfärgning för antigenet märkts under den efterföljande bearbetningen i steg 3. I sektionen som illustreras i figur 2, var morfologin hos en biocytin fyllda neuron i en tjock sektion (300 | im) avslöjade användning av streptavidin visualiseras i rött och den första primära (CB 1 R) visualiseras i grönt. Den första immunfärgning utfördes inom 7 d PFA fixering. Segmentet monterades i ett vattenhaltigt monteringsmedium, avbildas med ett konfokalmikroskop, och lagrades under en period av två månader innan de åter färgning för CCK-antikropp. Notera morfologi inspelade neuron, inklusive axonal Arbors (Figur 2E), rekonstruerades från konfokala bilder obtained efter den första färgningsproceduren. Colocalization av axonet med CB 1 R immunreaktivitet (Figur 2 F - H) förväntades baserat på fysiologiska studier. Den andra färgning för CCK utfördes på sektioner två månader efter den första färgningsproceduren. CCK avbildades i långt rött och pseudo-färgad i cyan för visualisering. På liknande sätt, Figur 3 illustrerar ett exempel på en cell i vilken biocytin-märkning avslöjades och avbildas i en tjock sektion (figur 3A1). Den inneboende fysiologin av neuron illustreras i figur 3A2. Segmentet återsektioneras vid 50 pm, och även om vissa delar innehållande dendritiska processer försvann, det avsnitt som innehåller soma återvinnas (figur 3B1). Efterföljande CCK immunfärgning av den tunna delen visade CCK uttryck i grönt i biocytin märkta soma. Montering av tjock skiva i ett vattenbaserat medium förhindrar excessive vävnad krympning. I genomsnitt, 300-im sektioner monteras med hjälp av vattenmediet krymper med ca 25,67 ± 3,14% (n = 5 skivor) mätt en vecka efter montering. Således, de tjocka sektionerna monteras med hjälp av vattenmediet är ~ 225 um, vilket möjliggör resektion. I flera kontrollstudier, bekräftades det att processen med immunmärkningen för andra gången inte leda till icke-specifik märkning av antikroppen. Till exempel, är det känt att parvalbumin (PV) och CCK immunoreaktivitet är ömsesidigt uteslutande i hippocampusneuroner. Kontroller där första immunomärkning steg (2) för biocytin (röd) och CCK (grön) följdes av den andra märkningen för parvalbumin (med excitation vid 405 nm och emission i blått) visade icke-överlappande uttrycksmönster (Figur 4). Dessutom, de utmärkande laminära axonal färgningsmönster av nervceller som uttrycker specifika neurokemiska markörer (PV, CCK, CB 1 R) ändrades inte av serial re-färgningsförfaranden (Figurerna 2 - 4). Dessutom sekundär färgning konsekvent avslöjade co-märkning av biocytin fyllda neuron med neurokemiska markörer som förväntas på grundval av de fysiologiska inspelningar. Därför är vi övertygade om att restaining förfarandet inte leder till förlust av specificitet vid märkning.
Figur 4. Avsaknad av överlappning mellan ömsesidigt exklusiva markörer på andra immunfärgning efter föregående Immunofärgning och montering av avsnitten. (A - C) Confocal bilder på 10X visar en biocytin fylld neuron (A) i rött, vilket indikeras av en pilspets, och CCK immunoreaktivitet i grönt (B), som anges av pilen. Notera avsaknaden av överlappning. Samma avsnitt bearbetades för parvalbumin (PV) immunfärgning i blått efter mer än 2 månader (C). OVerlay av bilder visas i D. Notera att de PV axoner är fördelade i granulatcellskiktet, med CCK i den molekylära skiktet i den förväntade icke överlappande mönster. noterar också bristen på colocalization av de två markörerna i neuronal somata. Den zoomade bilderna till höger visar att biocytin-märkta neuron uttrycker PV (pilspets) och inte CCK (pil). Skalstreck: 100 ^ m (A - D), 20 | j, m (paneler till höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
En vanlig orsak till suboptimal biocytin fyller är oavsiktlig avskiljning av de neuronala processerna med inspelnings pipetten samtidigt närmar sig cellen. En förlorad bihang av cellen visas som en Bleb av biocytin vid slutet av ett axon, såsom visas i fig 1 (grön pil). Axonal blebs enre ofta visualiseras när lapp ytliga celler, vars axoner kan avskiljas under skivning procedurer. Emellertid kan optimering av planet för skivning och kunskap om axonal fördelningsmönstret av den målsökta cellklass lätta undvikande närmar soma från riktningen för den förmodade axon, som också kan bryta axonet, vilket resulterar i uppkomsten av en axonal Bleb . I de flesta celltyper, är det att föredra att närma sig cellkroppen längs Z-axeln (vit pil med markering). En andra fråga gäller tillämpningen av överdriven positivt tryck till pipetten samtidigt närmar sig cellen. Detta kan inte bara skada cellen och dess anslutningar, men orsakar också den inre lösning innehållande biocytin att spilla runt cellen, vilket leder till hög bakgrundsfluorescens. Bakgrundsfärgning ökar också när den tid det tar att närma cellen är förlängd eller när slice kvaliteten inte är optimal, vilket kan äventyra möjligheten att definiera cellulär morfologi (figur 5A). Det är möjligt att dra ut soma ut medan dislodging pipetten. Detta kommer att resultera i en brist på somatisk morfologi (Figur 5B). För att undvika att dra ut cellen, flytta pipetten upp och ut i små steg med hjälp av "fina" rörelse inställningar hos manipulatorn. Om cellen verkar vara ansluten till pipetten genom en lång membran förlängning knackar / flick roboten försiktigt för att lossa pipetten från cellen. Undvik att använda de grova roboten inställningarna tills cellen helt har lossnat.
Figur 5. Bilder Illustrera Misslyckade biocytin fyllningar. (A) Bilden visar hög bakgrundsfluorescens på grund av alltför positivt tryck i inspelningen pipetten, vilket resulterar i dålig cell synlighet. Finare strukturer av neuronala processer, inklusive axoner, visualiseras utanför regionen the spill. Dessutom märker att soma har dragits ut. (B) En neuron med soma drog under pipett lossnar. Pilar visar framgångsrika fyllningar av axon och dendriter, medan soma och bihang proximala pilarna har inte återfunnits. (C) En cell lappad i ett ytskikt av den del (<50 ^ m från ytan) resulterar i fyllda celler som uppvisar skurna axon och dendriter (pilspetsar). Lägg märke till beading (pilar) av granulat cell dendriter, vilket tyder på dålig cell hälsa (C). Skala bar: 50 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Slutligen, för att återhämta sig fullständigt cellulär morfologi utan avhuggna axoner eller dendriter, är det bäst att rikta cell> 50 pm djup på skiva ytan. Ytliga celler kan ha processer som harskurits och kan sakna det normala komplementet av synaptiska ingångar.
De vanligaste fallgroparna i de restaining förfaranden är förknippade med avlägsnandet av täckglas och återhämtningen av sektionen utan att skada vävnaden. En andra fråga gäller penetration antikropp i tjock vävnad, i synnerhet när de inkuberas över natten. I flera fall har bättre penetration uppnåtts genom inkubering i den primära antikroppen i upp till 72 h vid 4 ° C på en orbital skakanordning placerad i ett kallt rum. Även om re-sektione vävnaden är det mest effektiva förfarandet för att säkerställa penetrering antikropp, förlänga varaktigheten av inkubation i primär antikropp eller öka detergentkoncentrationen till 0,5 - 1% Triton-X100 kan också underlätta antikropp penetration 24. Eftersom de flesta inspelade nervceller ligger inom 50-100 um från ytan av sektionen, finner vi att färgningen av tjocka sektioner är tillräcklig för att märka biocytin-filled somata eller processer på den här nivån. Det är dock rekommenderas att graden av antikroppsmärkning kontrolleras på varje avsnitt innan tolka negativa samlokalisering resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg i protokollet
Påfyllning av lappat cellen med biocytin är det mest avgörande steget för att säkerställa full återhämtning av morfologin. För fullständig återhämtning av cellen, är det viktigt att välja en optimal skiva orientering för att minimera avskiljning av processer under skivning. Denna orientering kan variera beroende på kretsen och celltypen som undersöks. Därefter är det nödvändigt att ge tillräcklig tid för biocytin att diffundera till dendriter och axoner. Vissa färgämnen, såsom neurobiotin, kan också tränga neuroner kopplade till den inspelade cellen genom kanalförbindelser. Storleken av pipettspetsen måste också optimeras, eftersom den soma tenderar att dras ut vid öppningen är stort och biocytin lastning äventyras när pipettspetsen är för liten. Dessutom, lämpliga förfaranden när urkoppling från helcells-läge är viktigt att återvinna soma. Efter inspelning under 24 h, den efterföljande inkubationenav skivorna i 4% PFA följt av PBS säkerställer att tvärbindningen av vävnaderna minskas, vilket är kritiskt för immunohistokemi. Lagring av skivorna vid 4 ° C är också viktigt för att upprätthålla skiva integritet. Men långvarig lagring i PFA minskar eventuell framgång förfaranden antikroppsmärknings. Optimera koncentrationen och varaktigheten för den primära antikroppen inkubationen är viktigt, eftersom dessa kommer att variera för individuella antikroppar, och vissa antikroppar kan kräva 3-5 d av inkubation för optimal inträngning i tjock vävnad. För att säkerställa att skivorna är oskadade, innan den sekundära primära antikroppsfärgning, krävs adekvat vård under avlägsnandet av täckglaset.
Ändringar och felsökning
Vi har observerat att det inte finns någon bestämd löptid mellan den första och andra fläcken. Sektioner har fått en ny färgade månader senare på samma vävnad och med mer än en fläck. Ivåra nya produktioner, jämförde vi delar behandlas med hjälp av återfärgningsmetoden med dem som använder standardimmunfärgning protokoll och finner ingen uppenbar skillnad i färgningsmönster eller robustheten biocytin fyller 6,9,25,26.
Även om det återstår att testas, är det möjligt att på nytt färgning kan utföras mer än en gång, med vävnadsintegritet är en begränsande faktor för upprepad hantering. Tillgängligheten av diskreta fluoroforer medför också en gräns för det antal antigener som kan visualiseras. Därför är noggrann hantering av vävnaden rekommenderas. En ytterligare process som återstår att testas restaining använder antigenåtervinningsprotokoll (för ytreceptorer). Eftersom integriteten av vävnaden bibehålls efter avlägsnande från täckglas, förväntar vi oss att förfarandet också skulle fungera i färgningsprotokoll som rekommenderar antigen återhämtning. I detta avseende, fysiologiska inspelningar ger ofta celler med några kända neurokemiska markörer
Begränsningar av tekniken
En begränsning i samband med att utföra immunohistokemisk färgning på tjocka sektioner är den otillräcklig penetration av antikroppen genom hela tjockleken av sektionen, särskilt med standard över natt inkubering i den primära antikroppen. Dessutom olika antikroppar och streptavidin, som används för att avslöja biocytin kan ha differentialvävnadspenetration. Således är det rekommenderas att provkörningar utförs för att bedöma inträngningsdjupet antikropp och att ändra inkubationstider, temperaturer och antikropp och Triton & #160; X-100 koncentrationer i syfte att uppnå optimal skiva penetration och färgning för varje antikropp. Det bör också noteras att framgångsrik märkning med en antikropp eller med streptavidin-biocytin innebär inte att en andra antikropp kommer att tränga in till samma djup av sektionen. Därför måste man vara försiktig för att kontrollera penetrationen av varje antikropp till den nivå som granskat biocytin-märkta cellprocesser för samlokalisering med neurokemiska markör. Om penetrationen är otillräcklig, segmentet kan återsektioneras vid <60 ^ m för immunfärgning. Observera dock att eftersom skivorna redan bearbetades för biocytin kan morfologin av cellen fångas upp av konfokal avbildning att eliminera eventuell förlust av anatomiska data under återsektionering och underlätta neuronal rekonstruktion. Även om det är möjligt att ålders och djurarter kan förändra penetrationsgraden antikropp, har vi med framgång använt dessa förfaranden i råttvävnad från 30-dag- och över 60 dagar gamla råttor och möss.
En andra begränsning är att biocytin är inte i sig fluorescerande och kan inte användas för live-avbildning och realtid morfologiska karaktärisering under inspelning. Alternativa okonjugerade fluoroforer och Lucifer gul har använts för levande avbildning av cellerna 27. De är inte permanent och förlorar fluorescens vid fixering, vilket gör det opraktiskt för post-hoc neurokemiska identifiering av den inspelade neuron. På senare tid har fluoroforer med biocytin införts för att övervinna denna begränsning och kan användas för live-avbildning samt för post-hoc-bearbetning i dubbel- eller trippelmärkning, som beskrivs här. Intressant, hittills har biocytin fyllningar lett till bättre elektriska och färgnings egenskaper för kombinerade elektrofysiologiska och anatomiska studier jämfört med Lucifer gul 28.
Betydelsen av teknik avseende befintliga /alternativa metoder
De stora fördelarna med att använda protokollet beskrivs här är att, till skillnad från resektion, den biocytin fyllda cellstruktur och processer förbli intakt och inte leda till permanent förlust av vävnad, eller till ett behov av mödosamma rekonstruktioner från flera sektioner. Sålunda kan en enda cell fyllning följt av immunocytokemi bidra till den morfologiska återuppbyggnad och identifiering av specifika neurokemiska markörer.
Framtida tillämpningar eller riktningar efter behärska denna teknik
I allt, presenterar vi en ny praktisk metod för återvinning av morfologi och post-hoc dubbel- och trippelimmunmärkningen av neuroner efter elektrofysiologiska inspelningar. Förfarandet är särskilt fördelaktigt för att hitta nya markörer som kunskap utvecklas, omvärdera neuroner som tidigare fylldes, visualiseras och avbildas. Det är därför t särskilt fördelaktighan immunohistokemi kan utföras veckor eller till och med månader senare, vilket sparar vävnad och antikroppar. Metoden kräver inte några speciella kemikalier och kan säkert utföras i alla laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för stödet från NIH / NINDS R01 NS069861 och NJCBIR CBIR14IRG024 till VS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S7653 | Immunostaining |
| KCl | Fluka | 60129 | Immunostaining |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Immunostaining |
| KH2PO4 | Sigma | 229806 | Immunostaining |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Immunostaining |
| Guinea pig anti CB1 | Sigma | Af530-1 | Immunostaining |
| Mouse anti CCK | CURE, UCLA | courtesy of G. Ohning | Immunostaining |
| Rabbit anti Parvalbumin | Swant | PV27 | Immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor conjugate | Molecular Probes | S11227 | Immunostaining |
| Normal goat serum (NGS) | Sigma | G9023 | Immunostaining |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Immunostaining |
| Secondary Antibodies | Invitogen Molecular probes | Alexa Fluor conjugated dyes | Immunostaining |
| Labnet orbit low speed shaker | Bioexpress | S-2030-LS | Immunostaining |
| Forceps | Dumont | 11231-30 | Immunostaining |
| Slide folders | EMS | 71520 | Immunostaining |
| Vibratome VT 1200 S | Leica | 14048142066 | Electrophysiology |
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular devices | Multiclamp 700B | Electrophysiology |
| pCLAMP 10 Software | Molecular devices | pCLAMP 10 | Electrophysiology |
| Digitizer | Molecular Devices | Digidata 1440 digitizer | Electrophysiology |
| Filter tips | Nalgene | 171-0020 | Electrophysiology |
| Sonicator | Fisher Scientific | 15-335-100 | Electrophysiology |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 | Electrophysiology |
| Biocytin | Sigma | B4261 | Electrophysiology |
References
- Garcia-Lopez, P., Garcia-Marin, V., Freire, M. The histological slides and drawings of cajal. Front Neuroanat. 4, 9 (2010).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Petilla Interneuron Nomenclature, G., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
- Armstrong, C., Soltesz, I. Basket cell dichotomy in microcircuit function. J Physiol. 590 (4), 683-694 (2012).
- Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8 (8), e70553 (2013).
- Gupta, A., Elgammal, F. S., Proddutur, A., Shah, S., Santhakumar, V. Decrease in tonic inhibition contributes to increase in dentate semilunar granule cell excitability after brain injury. J Neurosci. 32 (7), 2523-2537 (2012).
- Fish, K. N., Hoftman, G. D., Sheikh, W., Kitchens, M., Lewis, D. A. Parvalbumin-containing chandelier and basket cell boutons have distinctive modes of maturation in monkey prefrontal cortex. J Neurosci. 33 (19), 8352-8358 (2013).
- Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate cannabinoid-sensitive interneurons undergo unique and selective strengthening of mutual synaptic inhibition in experimental epilepsy. Neurobiol Dis. 89, 23-35 (2016).
- Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate total molecular layer interneurons mediate cannabinoid-sensitive inhibition. Hippocampus. 25 (8), 884-889 (2015).
- Varga, C., et al. Functional fission of parvalbumin interneuron classes during fast network events. Elife. 3, (2014).
- Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Neural Circuits Revealed. , 109 (2015).
- Krook-Magnuson, E., Luu, L., Lee, S. H., Varga, C., Soltesz, I. Ivy and neurogliaform interneurons are a major target of mu-opioid receptor modulation. J Neurosci. 31 (42), 14861-14870 (2011).
- Szabadics, J., Soltesz, I. Functional specificity of mossy fiber innervation of GABAergic cells in the hippocampus. J Neurosci. 29 (13), 4239-4251 (2009).
- Iball, J., Ali, A. B. Endocannabinoid Release Modulates Electrical Coupling between CCK Cells Connected via Chemical and Electrical Synapses in CA1. Front Neural Circuits. 5, 17 (2011).
- Chen, X., Cho, D. -B., Yang, P. -C.
- Ranjan, A. K., et al. Cellular detection of multiple antigens at single cell resolution using antibodies generated from the same species. Journal of immunological. 379 (1), 42-47 (2012).
- Fuccillo, D. A., Sever, J. L. Concepts in Viral Pathogenesis II. , Springer. 324-330 (1986).
- Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochem. 107 (2), 143-148 (2005).
- Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (95), e52358 (2015).
- Walz, W. Patch-clamp analysis : advanced techniques. 2nd edn. , Humana Press. (2007).
- Molnar, P. Patch-clamp methods and protocols. 403, Springer Science & Business Media. (2007).
- Martina, M., Taverna, S. Patch-clamp methods and protocols. , Humana Press. (2014).
- Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons). J Vis Exp. (91), e51706 (2014).
- Jinno, S., Kosaka, T. Immunocytochemical characterization of hippocamposeptal projecting GABAergic nonprincipal neurons in the mouse brain: a retrograde labeling study. Brain research. 945 (2), 219-231 (2002).
- Yu, J., Proddutur, A., Swietek, B., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Functional Reduction in Cannabinoid-Sensitive Heterotypic Inhibition of Dentate Basket Cells in Epilepsy: Impact on Network Rhythms. Cereb Cortex. , (2015).
- Proddutur, A., Yu, J., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Seizure-induced alterations in fast-spiking basket cell GABA currents modulate frequency and coherence of gamma oscillation in network simulations. Chaos. 23 (4), 046109 (2013).
- Scharfman, H. E. Differentiation of rat dentate neurons by morphology and electrophysiology in hippocampal slices: granule cells, spiny hilar cells and aspiny 'fast-spiking' cells. Epilepsy Res Suppl. 7, 93-109 (1992).
- Tasker, J. G., Hoffman, N. W., Dudek, F. E. Comparison of three intracellular markers for combined electrophysiological, morphological and immunohistochemical analyses. J Neurosci Methods. 38 (2-3), 129-143 (1991).
