Linear Agarose Kanäle zu studieren Drosophila Larval Krabbeln Verhalten

Zusammenfassung

Die Drosophila Larve ist ein leistungsfähiges Modellsystem neuronale Kontrolle des Verhaltens zu untersuchen. Diese Veröffentlichung beschreibt die Verwendung von linearen Agarose-Kanäle nachhaltig Anfälle von linearen Crawling und Methoden zu entlocken, die Dynamik der Larven Strukturen bei wiederholten kriechenden Verhalten zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Drosophila Larven Crawling zeichnet sich als ein leistungsfähiges Modell neuronalen Kontrolle von sensomotorischen Verhalten zu studieren. Allerdings Larven Crawling Verhalten auf flachen offenen Flächen ist komplex, einschließlich: Pausieren, Drehen und mäandernden. Diese Komplexität im Repertoire der Bewegung behindert detaillierte Analyse der Ereignisse während eines einzelnen Crawl Schrittzyklus auftreten. Um dieses Hindernis zu überwinden, lineare Agarose-Kanäle wurden gemacht, das Larven Verhalten gerade, nachhaltig, rhythmische Crawling beschränken. Grundsätzlich weil Agarose - Kanäle und die Drosophila Larvenkörper sind beide optisch klare, die Bewegung der Larven Strukturen durch genetisch kodierten fluoreszierenden Sonden markiert kann in intakten, sich frei bewegenden Larven beobachtet werden. In der Vergangenheit wurden Larven in linearen Kanälen und kriechenden auf der Ebene des gesamten Organismus, Segment- und Muskel wurden ¹ analysiert platziert. In Zukunft Larven in den Kanälen kriechen können für Kalzium-Imaging verwendet werden neuro zu überwachennal Aktivität. Darüber hinaus können diese Verfahren mit Larven von jedem Genotyp werden verwendet und mit jedem Forscher gestalteten Kanal. Damit das Protokoll unten dargestellt ist breit anwendbar für Studien , die die Drosophila Larve als Modell Motorsteuerung zu verstehen , verwenden.

Einleitung

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist , Drosophila Larve Crawling im Detail zu studieren. Versuche zur Fortbewegung haben eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Erprobung von Theorien über die Motorsteuerung ² gewonnen. Traditionell Fortbewegung wurde in Wassertiere (zB Blutegel, Neunauge, Kaulquappe) ³ untersucht. Die repetitive Charakter der Fortbewegung bei diesen Tieren wurde für die Analyse der biophysikalischen Ereignisse Lokomotion Fahren für die Untersuchung von Rhythmogenese, erlaubt, und für die neuronalen Feuerungsmuster Überwachung, die Fortbewegung begleiten.

Die Verwendung von Drosophila - Larven für Studien der Fortbewegung stellt eine einzigartige Kombination von Vorteilen gegenüber anderen Modellsystemen: facile Genetik, gut charakterisierte Entwicklung, einem Körper, der auf den ersten und zweiten instars optisch klar ist, und einer laufenden Übertragung elektronenmikroskopische Rekonstruktion des gesamten Nervensystem ^4-6. Allerdings Drosophila Larve LokBewegung auf flachen offenen Flächen ist etwas komplex einschließlich Pausen, dreht sich, und mäandernden kriecht ^7. Diese Veröffentlichung stellt eine Methode lineare Agarose - Kanäle zu verwenden Drosophila Larven Bewegungsverhalten , so dass Larven zu führen perform nachhaltig, gerade, rhythmische Crawling Verhalten.

Studium Drosophila Larven Verhalten in Agarose - Kanäle statt Verhalten auf flachen Oberflächen offen, hat mehrere Vorteile. Erstens ermöglicht es Forschern speziell auszuwählen Verhalten von den vielen Bewegungen kriechen, die Teil des Larven- Verhaltensrepertoire sind. Zweitens durch die Breite des Kanals gegenüber dem Larven- Körpergröße anpassen, können Kriechgang eingestellt werden. Drittens Kanäle ermöglichen die Larve aus dorsalen, ventralen oder lateralen Seite je nach betrachtet werden, wie die Larve geladen und innerhalb des Kanals ausgerichtet ist. Diese Vielseitigkeit in Larven Orientierung ermöglicht eine beliebige Struktur von Interesse während kriechen ständig sichtbar sein. Vierte,Kanäle sind für den Einsatz mit einer Vielzahl von Mikroskopen und Ziele zugänglich. Zum Beispiel können lineare Kanäle für niedrigaufgelöste Bildgebung auf Hellfeld Stereoskope und / oder für die hochauflösende Bildgebung auf Spinnscheiben - konfokale Mikroskope ¹ verwendet werden. Fünftens kann dieses Verfahren mit optogenetische / thermogene neuronal Manipulationen in jedem genetischen Hintergrund in Kombination verwendet werden. Schließlich, da sowohl der Larvenkörper (in erster und zweiter instars) und Agarose-Kanäle optisch klar sind, können Kanäle verwendet werden, wenn die dynamischen Bewegungen oder Veränderungen in der Fluoreszenzintensität von Larven Strukturen von genetisch kodierten fluoreszierenden Sonden markiert studieren.

Das beschriebene Verfahren eignet sich für detaillierte kinematische Studien der ersten und zweiten Instar Drosophila Larven Verhalten. Diese Veröffentlichung analysiert die dynamischen Veränderungen in der Fluoreszenzintensität des ZNS bei Vorwärtslarven Crawling die Verwendung von Kanälen zu veranschaulichen und als Vorläufer neuronal Kalzium-Imaging.

Protokoll

1. Herstellung von Larvae

1. Eine Woche vor Verhalten aufnehmen, setzen Sie ein Kreuz (Minimum von 25 Jungfrauen und fünf Männer) auf. Pflegen Sie alle Kreuze und Nachkommen bei 25 ° C.
   HINWEIS: Die Temperatur der Kulturbedingungen verändert werden können, aber die unten beschriebenen Zeitlinie müssten für Änderungen in der Entwicklungsgeschwindigkeit Rechnung angepasst werden.
2. 5 Tage vor der Aufnahme, als erstes am Morgen, legen Sie das Kreuz in einen Sammelkorb mit einem Agar / Saft Kappe und einem Klecks (0,5-1 ml) von Hefe-Paste in der Mitte des Agar / Saft Kappe.
   1. Um eine Sammlung Käfig machen, stoßen Löcher in eine 6 Unzen Platz Polyethylen Drosophila Flasche.
   2. Agar / Saft Kappen, mischen 18 g Agar mit 600 ml Wasser in einem Erlenmeyerkolben zu machen. In einem separaten Kolben Mischung 20 g Saccharose mit 200 ml Apfelsaft. Mikrowellen bis die Feststoffe gelöst sind. Kombinieren und rühren, wodurch Mischung auf 60 ° C abkühlen. 20 ml 10% Methyl-p-hydroxybenzoat in 95% Ethanol, und rühren. In ~ 7ml auf die untere Hälfte eines 35 x 10 mm Runde Petrischale. Erlauben Agar / Saft für 1 h bei RT zu verfestigen. Lagerung bei 4 ° C.
   3. Um Hefe-Paste, fügen gleichen Volumenteilen Trockenhefe und Wasser. Lagerung bei 4 ° C.
3. Überprüfen Sie die Gesundheit der Larven Sammlungen.
   1. Am Morgen, 4 und 3 Tage vor der Aufnahme entfernen Sie die Kappe und legen Sie eine neue Kappe auf den Käfig. Ändern Sie die Kappen zur gleichen Zeit jeden Tag eine 24-Stunden-Sammlung von Eiern zu bekommen und frisch geschlüpfte Larve.
   2. Nach jeder Kappe entfernt wird, untersuchen, um zu sehen, wie viele Eier das Kreuz zu legen. Erwarten Sie, zwischen 500-2000 Eier. Stellen Sie die Anzahl der Erwachsenen, wenn nötig.
      HINWEIS: Einige Eier in die Larven geschlüpft sollten, und die frisch geschlüpften Larven von der Hefe-Paste zu finden.
   3. Alter jeder Kappe für 24 Stunden. Erneut zu prüfen, um die Kappe zu bestimmen, ob Larven gesund sind.
      HINWEIS: Die meisten Eier sollten in Larven geschlüpft sind, und die Larven sollten in die ihr gekrochenast Paste. Anzeichen für eine schlechte Gesundheit umfassen eine große Anzahl von nicht geschlüpften Eier, tote Larven Körper weg von der Hefe-Paste, und Larven mit signifikanten dunklen Flecken im Bauch, eine Immunreaktion anzeigt. Wenn Larven ungesund sind, um den Käfig zu ändern, machen frische Kappen / Hefe-Paste, und den Genotyp überprüfen.
   4. Entsorgen Sie die alten Kappen.
4. Sammeln Larven für Verhaltensaufnahmen.
   1. An beiden 2 und 1 Tag vor der Aufnahme, entfernen Sie die Kappe und ersetzen mit einem frischen Kappe.
   2. Beschriften Sie jede entfernt Kappe und halten bei 25 ° C. Dies wird eine gestaffelte Reihe von Larven für Verhaltens Aufnahmen produzieren. Die Larven von neu geschlüpften (0-4 hr posthatch) durch die zweite instar (24-48 h posthatch) können in den Kanälen verwendet werden. Speichern Kappen für Aufnahmen an aufeinanderfolgenden Tagen.
   3. Entsorgen Sie alle Kappen nach 48 Stunden.
   4. Falls erforderlich, wiederholen Sie die Schritte 1.4.1-1.4.3 für bis zu 5 weitere d. Nach dieser weniger werden befruchtete Eier produziert.

2. Vorbereitung der Kanäle

1. Bereiten Sie die linearen Kanal PDMS (Polydimethylsiloxan, ein Siliconelastomer) Gießform (1A). PDMS Gussformen sind aus dem Heckscher-Labor auf Anfrage erhältlich.
   1. Reinigen Sie die Gießform mit Isopropylalkohol. Luft trocknen, trocken tupfen mit Labortücher, oder mit Druckluft verwenden.
   2. Legen Sie die Gießform in eine 10 cm Petrischale Deckel oder einem anderen Behälter.
2. Vorbereiten und Agarose - Lösung gießen.
   1. Machen Sie eine 3% igen Lösung in Wasser (3 g in 100 ml) durch Erhitzen in der Mikrowelle bis zur vollständigen Auflösung.
   2. Man kühlt auf 55 ° C, so dass Blasen Oberfläche steigen.
   3. Gießen der Agarose-Gemisch in die Petrischale, die Gießform enthält, so daß die Form gerade bedeckt. Lassen Sie Agarose-Set bis verfestigt.
3. Entfernen Sie die Agarose-Kanäle aus der Gießform. Trimmen der Ränder der Agarose-Platte mit einer Rasierklinge.
   1. Setzen Sie den Kanals in einer 10 cm Petrischale in Wasser eingetaucht. Sie können bei 4 ° C für 7 Tage aufbewahrt.

3. eine Larve in einen Kanal aufzuzeichnen Verhalten Laden

HINWEIS: Wenn Kanäle bei 4 ° C lagern lassen Kanäle auf RT kommen, bevor sie für Verhaltensaufzeichnung verwenden.

1. Verwenden Sie einen sauberen Rasierklinge einen einzigen Kanal von den in Schritt 2 (2A) bereit zu schneiden.
2. Verwenden Sie eine Zange um den Kanal gerillten Seite nach oben auf einem Deckglas (2B) zu platzieren. Die Größe und die Dicke des Deckglases hängt von dem spezifischen Anwendungsbereich für die Bildgebung verwendet.
3. Verwenden feinen Pinzette eine Larve aus dem Agar / Saft Kappe in Schritt vorbereitet , um 1 ziehen und in den Schnittkanal (2C).
   1. Sie nicht die Larve quetschen. Wählen Sie ihn sanft mit der Spitze der Zange Zinke nach oben. Es ist auch möglich, Larve mit einem Pinsel mit einer feinen Spitze zu manipulieren.
      Hinweis: Dies ist wichtig, da Larven sind sehr sensitive zu berühren. Wenn sie nicht mit Sorgfalt behandelt werden, kann nozizeptiven Reaktionen ihr Verhalten während der ersten paar Sekunden des Versuchs dominieren.
   2. Waschen Sie die Larven durch kurzes sie in Wasser eingetaucht.
   3. Nach der Platzierung der Larve auf Schnittkanal mit der Spitze der Zange Zinke vorsichtig auf die Larve in den Kanal Hain necken.
      HINWEIS: Für die meisten Anwendungen ist die Breite der Larve und die Breite des Kanals entsprechen sollte. Die durchschnittliche Breite der Larven in verschiedenen Stadien der Entwicklung folgt: 0 hr posthatch - 140 um, 24 hr posthatch - 180 um, 48 hr posthatch - 320 um, 72 hr posthatch - 500 um 96 Stunden posthatch - 750 um ^8. Kanäle kommen in den folgenden Breiten: 100, 150, 200, 250, und 300 & mgr; m, und alle Kanäle sind 150 & mgr; m tief.
   4. Verwenden Sie die Spitze einer Pinzette Zinke oder Pinsel die Position der Larve innerhalb des Kanals einzustellen. Es kann in jeder Richtung orientiert sein: ventralup, ventralen nach unten, ventralen auf der einen Seite, auf welche Struktur in Abhängigkeit abgebildet werden soll.
4. Mit einer Pinzette, drehen sanft den Kanal über, so dass die Larve nun auf dem Deckglas ist. Ein oder zwei Tropfen Wasser an den Enden des Kanals , so dass es mit Wasser (2D) füllt.
   1. Heben Sie vorsichtig die Seiten des Kanals alle Luftblasen zu entfernen.
   2. Passen Sie die Ausrichtung der Larve. Dazu vorsichtig den Kanal schubsen, aber nicht das Deckglas die Larve zu rollen. Wenn dies nicht die Ausrichtung zu ändern, entfernen Sie das Deckglas und Larven Position einstellen. Die Larve ist bereit, das abgebildet werden soll.
   3. Bild der Kanal / Deckglas auf einem inversen Mikroskop. Wenn Bildgebung auf einem aufrechten Mikroskop, kehren Sie einfach den Kanal / Deckglas.

4. Messen Merkmal von Interesse in Behavioral Recording

1. Für eine Struktur von Interesse (zB Schwanz, ZNS), messen ein Merkmal von Interesse (zB, Fluoreszenzintensität, Ort) über die Zeit.
   HINWEIS: Strukturen wie der Kopf und Schwanz kann manuell mit Anmerkungen versehen werden. Zum Beispiel kann der Kopf als enthält dunkle H-förmigen Mundhaken identifiziert werden, und der Schwanz kann als enthaltenden hinteren Tracheal spiricles identifiziert werden. Dieser Beitrag konzentriert sich auf den Nervenstrang. Verwenden Sie die neuronale GAL4 Linie elav-GAL4 ein UAS-myr-GFP - Transgen zu fahren (elav> GFP) ^9,10 bis fluoreszenz das zentrale Nervensystem (ZNS) beschriften. Das CNS enthält zwei vorderen Gehirnlappen an den Nervenstrang befestigt, der an der hinteren erstreckt (Figur 3).
2. Messen der Pixelintensität des Nervenstrang (f _(NC)) zu jedem Zeitpunkt (t). Im Folgenden beschreibt eine manuelle Annotation Ansatz, aber dieser Schritt automatisiert werden konnten.
   1. In Fidschi (oder eine ähnliche Software) im Menü "Analysieren", die "Set Messungen ..." verwenden Dialogfeld den mittleren Grauwert und slic berichtene Position.
   2. Ziehen Sie manuell eine Box in der Mitte des Nervenstrang im ersten Frame des Films (Abbildung 3). Dieser Schritt könnte auch mit Bildsegmentierung und Registrierungsalgorithmen automatisiert werden.
   3. Verwenden Sie das "Measure" -Befehl im "Analysieren" Menü, um die durchschnittliche Pixelintensität in der boxed Region von Interesse zu melden. Dies erzeugt ein Fenster "Ergebnisse".
   4. Im nächsten Bild neu zu positionieren manuell die Box ohne Ändern der Größe, indem Sie die Pfeiltasten. Verwenden Sie das "Measure" Befehl erneut aus. Die aktualisierten Ergebnisse werden im Fenster "Ergebnisse" angezeigt. Wiederholen Sie diesen Schritt für jeden Frame von Interesse.
   5. Speichern Sie die "Ergebnisse" mit dem "Speichern unter ..." Befehl aus dem Menü Datei. Die Ergebnisse werden als .xls-Datei exportiert werden.

5. Analysieren Sie die Messungen

1. Normalisieren jedes f _(NC) Wert auf einen Wert zwischen 0 und 1 (z _(t) </ Em>).
   1. In Tabelle (oder ein anderes Programm), öffnen Sie die Datei Results.xls. Diese Datei wird über zwei Spalten repräsentieren Rahmennummer und die mittlere Fluoreszenzintensität.
   2. Machen Sie eine neue Spalte und verwenden Sie die Formel z _(t) = f _{(NC [t])} -min _{(f [NC])} / max _{(f [NC])} -min _{(f [NC])} eine normalisierte Fluoreszenzwert zu erzeugen , entsprechend jedem Zeitpunkt.
2. Bestimmen Sie die Schrittperiode für jeden Schritt in der Aufnahme.
   HINWEIS: Ein Schrittzyklus ist die Einheit der sich wiederholenden Ganzkörperbewegung für vorwärts (und umgekehrt) kriecht. Vereinbarungs ein Vortritt beginnt (und endet) mit der Vorwärtsbewegung des Schwanzes, den Kopf und andere innere Organe wie Darm oder CNS ^1.
   1. Die Verhaltens Aufzeichnung manuell zu prüfen und die Initiationszeiten (i) von jedem Schritt (i _{(Stride Zyklus [n]))} aufzeichnen.
      HINWEIS: Im Beispiel unten, Vorwärtsbewegungdes ZNS wie die Einleitung eines Schrittzyklus verwendet (Abbildung 3).
   2. Für jeden Schritt berechnen die Zeit: Δ t _(Stride - _{Zyklus) =} i _{(Stride Zyklus [n + 1])} -I _{(Stride Zyklus [n]).}
3. Berechnen Prozentsatz der Schrittzyklus für jeden Zeitpunkt der Aufzeichnung verstrichen ist .
   1. Machen Sie eine zusätzliche Spalte in der Tabellendatei Zeit seit dem Start eines Schrittzyklus abgelaufen darstellt (c). Stellen Sie die Zeit seit Schritt Initiation auf Null zu Beginn eines jeden Schritt (c _{(Stride Zyklus [n])} = 0). Passen Sie mal nach Beginn entsprechend.
   2. Machen Sie eine zusätzliche Spalte in der Tabellendatei darstellt Prozent Schrittzyklus (% Schrittzyklus) vergangen eingestellten Zeiten Teilen durch Schrittperiode und mit 100 multipliziert , um Prozentsatz der Schrittzyklus zu konvertieren abgelaufene.% Schrittzyklus = (c _{(Stride Zyklus [n] ))} / (Δ t ₍Stride - Zyklus) * 100).

6. Generieren Polardiagramme Koordinaten Dynamik der Tragstrukturen von Interesse über die Crawl-Zyklus darstellen

1. In MATLAB, verwenden Sie den Dialog "Importieren von Daten" in der Registerkarte Start der aktualisierten Results.xls zu importieren.
2. Machen Sie ein neues Array "Theta" enthält Prozent Schrittzyklus Werte (% Schrittzyklus). ( "Theta = Var1" , wo Var1% Schrittzyklus darstellt).
3. Machen Sie ein neues Array "Rho" enthalten normalisierte Fluoreszenzwerte (z _(t)). ( "Rho = Var2" , wo Var2 z _{(t darstellt)).}
4. Verwenden Sie die 'PolarPlot' Befehl Polarkoordinaten Plots mit dem Prozentschrittzyklus als der Winkel zu machen, und die Fluoreszenz als der Radius ( "PolarPlot (Theta, Rho)").

Ergebnisse

Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zum Führen von Drosophila Larve Verhalten mit Agarose - Kanäle und für die Dynamik der Larven Strukturen über einen Crawl - Zyklus zu messen. Larvae in linearen Kanälen führen nachhaltige Anfälle von rhythmischen Crawling (Abbildung 3). Da sowohl Larven und Kanäle optisch klar sind, können Kanäle verwendet werden, mit Larven exprimieren Fluoreszenzsonden in jeder Struktur von Interesse bekundet. Wir nahmen Larven GFP - exp...

Diskussion

Es wurde eine Mikrofluidik - Vorrichtung , um lineare Agarose Kanäle gebaut , die Drosophila - Larven (Abbildung 1) aufnehmen kann. Bei Drosophila - Larven in dieser linearen Agarose - Kanäle , um ihre Verhaltensrepertoire platziert wird kriechen begrenzt, die für eine detaillierte Beobachtung der Dynamik der Larven Strukturen über den Crawl - Zyklus erlaubt.

Eine erfolgreiche Aufnahme tritt auf, wenn eine Larve eine Reihe von rhythmischen Schritten

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
6 oz quadratische Drosophila-Flasche	Scimart	DR-103
Agar	Sigma	A1296
Saccharose	Sigma	S9378
Apfelsaft			nicht aus Konzentrat
Tegosept	Fisher	T2300	Methyl-p-hydroxybenzoat
35 x 10 mm runde Petrischale	Fisher	351008
Backhefe
PDMS Gießform	FlowJem		kann bei Autoren angefordert werden
Isopropylalkohol	Fisher	A417-1
Labortücher	Fisher	06-666-11
Druckluft aus der Dose	Fisher	18-431
10 cm Petrischale	BioPioneer	GS82-1473-001
agarose	Fisher	50-444-176
Rasierklinge	Fisher	12-640
Pinzette	FST	11241-40
22 x 40 Deckglas, #1.5	Fisher	50-365-605
Fiji (Version 1.51d)	NIH		fiji.sc
Excel 2016	Microsoft		www.microsoftstore.com
MATLAB R2016	Mathworks		www.mathworks.com