Design und Implementierung eines automatisierten Illuminating, Anzucht und Probenahmesystem für Mikrobielle optogenetische Anwendungen

Summary

Wir haben eine kontinuierliche Kultivierungsvorrichtung zur Verwendung mit optogenetische Systeme Kulturen von Mikroben zu beleuchten und regelmäßig Bildzellen in dem Abwasser mit einem umgekehrten Mikroskop. Die Kultivierung, Probenahme, Bildgebung und Bildanalyse sind voll automatisiert, so dass dynamische Reaktionen auf Beleuchtung kann über mehrere Tage gemessen werden.

Abstract

Optogenetische Systeme verwenden genetisch kodierten Proteine, die Konformation in Reaktion auf bestimmte Wellenlängen des Lichts verändern zellulärer Prozesse zu verändern. Es besteht ein Bedarf für die Kultivierung und Messsysteme, die Beleuchtung und die Stimulation von optogenetische Systeme programmiert einzuarbeiten. Wir stellen ein Protokoll für den Aufbau und die Verwendung eines kontinuierlichen Kultivierungsvorrichtung mikrobiellen Zellen mit programmierter Dosen von Licht zu beleuchten, und automatisch erfassen und die Bilder der Zellen in dem Ausfluß zu analysieren. Der Betrieb dieser Vorrichtung als Chemostat ermöglicht die Wachstumsrate und der Zellumgebung streng kontrolliert werden. Der Austrag der kontinuierlichen Zellkulturen werden regelmäßig Proben genommen und die Zellen werden durch Mehrkanal-Mikroskopie abgebildet. Die Kultivierung, Probenahme, Bildverarbeitung und Bildanalyse sind vollständig automatisiert, so dass dynamische Reaktionen in der Fluoreszenzintensität und zellulärer Morphologie von aus der Kultur Abstrom abgetastete Zellen über mehrere Tage gemessenohne Benutzereingabe. Wir zeigen die Nützlichkeit dieser Kultivierungsvorrichtung durch dynamisches Protein - Produktion in einem Stamm von Saccharomyces cerevisiae konstruiert mit einem optogenetische System induziert die Transkription aktiviert.

Introduction

Optogenetische Systeme verwenden Licht eine wachsende Liste von zellulären Prozessen , einschließlich Expression Gens zu kontrollieren, ^{1, 2, 3, 4, 5} Proteinlokalisierung, ⁶ - Protein - Aktivität, ^{6, 7, 8} Proteinbindungs, ^{8, 9, 10} und den Proteinabbau. ¹¹ Verfahren für Zellen in einer kontrollierten Umgebung mit programmierten optischen Stimulation und zum Messen von deren Reaktion über biologisch relevanten Zeitskalen Züchten ist notwendig , das Potential dieser Werkzeuge für die Forschung in der Zellbiologie und der Biotechnologie zu nutzen. Unsere Methode nutzt chemostasis eine konstante Zellwachstumsrate in einem gut gemischten aufrechtzuerhalten, aegelesen und temperaturgeregelten Glaskulturgefäß ^{12, 13,} die so programmiert Beleuchtung ausgesetzt ist. Wir Bild einzelnen Zellen in der Kultur Abstrom mit einem umgekehrten Mikroskop die Reaktion der Kultur zu programmierten Beleuchtungs zu messen. Die Kultivierung, Probenahme, Bildgebung und Bildanalyse sind vollständig automatisiert, so dass die Fluoreszenzintensität und Zellmorphologie des Abflusses Zellkultur kann über mehrere Tage ohne Benutzereingabe gemessen werden.

Dieses Protokoll kann in den meisten Labors vertraut mit wachsenden Zellkultur und Mikroskopie durchgeführt werden, und die verwendete Vorrichtung ist kostengünstig und aus leicht verfügbaren Komponenten. Ein transparentes Kulturgefäß über einer Matrix aus Leuchtdioden (LEDs) emittieren kann 1 & mgr; W / cm ² -10 mW / cm ² von Licht angeordnet. Mikroben werden in dem Kulturgefäß kontinuierlich gewachsen; eine peristaltische Pumpe verwendet Medien bei der hinzufügenVerdünnungsrate wird eine andere verwendet Kultur mit einer geringeren Rate an das Mikroskop zurückzuziehen, und die Differenz entweicht durch einen Überlaufauslaß. Ein Heizkissen hält die Temperatur. Die Luft wird kontinuierlich in das Kulturgefäß gepumpt, um einen positiven Druck als auch zu halten, wie zu mischen und die Kultur belüften. Mit Ausnahme der Luftpumpe, Leistung dieser Vorrichtungen wird durch einen Mikrocontroller geregelt, die auch eine Eingabe von einem Thermometer und einem angeschlossenen Desktop-Computer empfängt. Der Abstrom Zellkultur wird auf eine Mikrofluidik-Vorrichtung auf der Bühne eines umgekehrten Mikroskops gepumpt. Nicht fluoreszierende und Fluoreszenzbilder werden automatisch erfasst. Die Zellen in den Bildern durch einen Algorithmus gekennzeichnet, daß jede Zelle als eine Region von Interesse (ROI) lokalisiert und mißt die Eigenschaften der einzelnen ROI.

Um eine Anwendung dieses Protokolls zu demonstrieren, maßen wir die Antwort auf unterschiedlichen Lichtintensitäten von Saccharomyces cerevisiae - Zellen entwickelt , mit einem Blaulicht Verantve optogenetische System, das die Transkription von fluoreszierenden Proteins steuert. S. cerevisiae, wie Bäckerhefe allgemein bekannt ist , wurde ausgewählt , weil mehrere optogenetische Systeme für die bereits in diesem System Genexpression Steuerung ¹⁴ vorhanden ist ^{, 15, 16.} Darüber hinaus ist dieses Modellorganismus für Studien in der Systembiologie ¹⁷ und als Fahrgestell für biotechnologische Anwendungen ^{18, 19, 20} verwendet. Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, die Transkription einer Kultur über mehrere Tage zu steuern, indem Eingangslichtintensitäten variierende und die Herstellung eines fluoreszierenden Reporter messen.

Protocol

Abbildung 1: Die kontinuierliche Kultivierungsvorrichtung. Dieses vereinfachte Diagramm zeigt, wie soll die Vorrichtung zusammengebaut werden, wenn es um Kultur verwendet wird, beleuchten, und messen die optischen Eigenschaften der Mikroben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2: Übersicht des Protokolls. Die Schritte in der schattierten Region muss jedes Mal wiederholt werden, das verwendete Protokoll. Closed - Loop - Steuerung möglich ist ^34, wird aber in diesem Protokoll nicht implementiert.

1. Bauen Sie das Thermometer an die Leiterplatte

Abbildung 3: Anschlüsse Thermometer Werte zu lesen. Dieses Diagramm zeigt, wie das digitale Thermometer sollte der PCB verbunden werden, so dass der Mikrocontroller Rückkopplung erhalten, die Temperatur der Kultur zu steuern. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

1. Löten Sie den Boden, Daten und positive Spannungsleitungen des digitalen Thermometers in ihre jeweiligen Durchgangslöchern mit "GD + V."
2. Clip aus einem Stift von einem weiblichen 3-Pin-Header und schneiden Sie die restlichen 2 Pins mit Draht Clippers, so dass es passt in die beiden Durchgangslöchern mit "R2" und nicht den Mikrocontroller behindern. Löten Sie diese an Ort und Stelle. Verbinden Sie die beiden angelötet Stifte durch einen 4,7 kOhm Widerstand in dem Pin-Header eingefügt wird.

2. Verbinden Sie das Netz Control-Komponenten an die Leiterplatte

Abbildung 4: Verbindungen zu steuern , um Energie zu dem Heizkissen. Dieses Diagramm zeigt, wie die PCB und Zubehörteile sollten, um die Stromversorgung des Heizkissen zu steuern, zusammengebaut werden. Die Teile zur Steuerung der Schlauchpumpen in ähnlicher Weise verbunden sind. Man beachte, dass die Komponenten für das Thermometer zur Klarheit entfernt wurden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

1. Schneiden Sie 1 cm von den Stiften von fünf weiblichen 3-Pin-Header. Löten Sie diese an den Positionen auf der Leiterplatte (PCB), die als "# 1", "# 2", "# 3", "# 4" und "CB E."
2. Schneiden Sie 1 cm von den Stiften eines weiblichen 6-Pin und 8-Pin-Header. Löten diese nebeneinanderdie Säule der Durchgangslöcher K1 bis K14 bezeichnet.
3. Schließen Sie das Heizkissen auf der Leiterplatte.
   1. Die Enden eines 100-kOhm-Widerstand in den Durchgangslöchern markiertem K1 und K2 auf der Platine. Legen Sie eine Metall-Oxid-Halbleiter-Feldeffekttransistor (MOSFET) in die Position markiert # 1 auf der Platine, mit dem Etikett des MOSFET in Richtung K1 gegenüber durch K14 Durchgangslöchern, so dass der Source-Stift ist am nächsten an der "# "Etikett und der Drain-Pin ist am weitesten von der" # "label.
   2. Schneiden Sie die Masseleitung der 5-V-Gleichstrom (DC) Stromversorgungskabel und schließen Sie es an J2. Verbinden Sie die Masseleitung der Heizkissen J1. Verbinden K3 an Pin 3 mit einem 1 kOhm Widerstand. Aktuelle sollte jetzt nur noch von J1 bis J2 fließen, wenn Pin 3 + 5V.z gesetzt
      HINWEIS: Der Widerstand / MOSFET Satz fungiert als Schalter, der vom Stift J1 bis J2 Strom fließen kann, wenn der Pin 3 des Mikrocontrollers auf +5 V eingestellt wird
4. Verbindendie langsame peristaltische Pumpe.
   1. Die Enden eines 100-kOhm-Widerstand in den Durchgangslöchern markiertem K4 und K5 auf der Platine. Setzen Sie einen MOSFET in die Position markiert # 2 auf der Platine, mit dem Etikett des MOSFET in Richtung K1 bis K14 Durchgangslöchern zugewandt, so dass der Source-Stift ist am nächsten an der "#" Etikett und der Drain-Pin ist am weitesten von der "#" Etikette.
   2. Schneiden Sie die Masseleitung der 12-V-DC-Stromversorgungskabel von der langsamen peristaltische Pumpe. Schließen Sie die Schlauchpumpe zugewandten Ende an J3 und die Wand Warze gerichteten Ende zu J4. Schließen Sie K6 an Pin 4 mit einem 1 kOhm Widerstand. Aktuelle sollte jetzt nur noch von J3 J4 fließen, wenn Pin 4 mit +5 V eingestellt
5. Schließen Sie die schnelle peristaltische Pumpe
   1. Die Enden eines 100-kOhm-Widerstand in den Durchgangslöchern markiertem K7 und K9 auf der Platine. Setzen Sie einen MOSFET in die Position markiert # 3 auf der Platine, mit dem Etikett des MOSFET in Richtung K1 bis K14 Durchgangslöcher s zugewandt o dass die Quelle Stift ist mit dem "#" label am nächsten, und der Drain-Pin ist am weitesten von der "#" label.
   2. Schneiden Sie die Masseleitung der 12-V-DC-Stromversorgungskabel von der schnellen peristaltische Pumpe. Schließen Sie die Schlauchpumpe zugewandten Ende zu J5 und die Wand Warze gerichteten Ende zu J6. Schließen Sie K9 an Pin 5 mit einem 1 kOhm Widerstand. Aktuelle sollte jetzt nur noch von J5 J6 fließen, wenn Pin 5 mit +5 V eingestellt

3. Schließen Sie die LED-Matrix auf die Leiterplatte

Abbildung 5: Anschlüsse der LED - Matrix zu steuern. Dieses Diagramm zeigt, wie die LED-Matrix sollte mit der Leiterplatte verbunden werden. Es zeigt auch, dass die Leiterplatte kann auf dem Mikrocontroller gestapelt werden. Man beachte, dass die Komponenten für das Thermometer und zum Steuern der Gleichstromleistung an anderen Vorrichtungen zur Klarheit entfernt wurden.es / ftp_upload / 54894 / 54894fig5large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

1. Löten Sie die 6-polig, 10-polig, und die zwei 8-polige Buchse Stiftleisten in die Durchgangslöcher an den Seiten der Leiterplatte, so dass sie auf der Oberseite des Mikrocontrollers gestapelt werden können.
2. Löten Sie die 100 nF und die 10 uF Kondensatoren, um ihre markierten Stellen auf der Leiterplatte und stellt fest, dass der Minuspol des 10 uF-Kondensator (kürzere Vorlauf) sollten mit einem negativen Vorzeichen markiert das Durchgangsloch verbunden werden.
3. Verlöten der LED-Treiber zum 2 von 12 Satz von Durchgangslöchern, wobei die Einbuchtung auf der Fahrer weit von den Durchgangslöchern für die LED-Matrix reserved.
4. Löten 2 Spalten der männlichen Stiftleisten zu den Durchgangslöchern für die LED-Matrix markiert, und schneiden die Enden dieser unter dem Steckbrett, so dass sie nicht den Mikrocontroller behindern. Verbinden Sie diese mit zwei 8-Draht Streifen Buchse / Buchse Prüfkabeln. Schließen Sie einen zweiten Satz von männlichenStiftleisten an das andere Ende der Schaltdrähte.
5. Legen Sie die LED-Matrix über dem Median der Steckbrett, und fügen Sie dann den zweiten Satz von Stiftleisten an den Säulen zu beiden Seiten der Matrix. Stellen Sie sicher, dass die elektrischen Anschlüsse die gleichen sind, als ob die LED-Matrix direkt auf die Leiterplatte mit der markierten Seite der Matrix entsprechend der markierten Spalte von Durchgangslöchern verbunden worden waren.
6. Clip aus einem Stift von einem weiblichen 3-Pin-Header und schneiden Sie die restlichen 2 Pins mit Draht Clippers, so dass es passt in die beiden Durchgangslöchern mit "R1" und nicht den Mikrocontroller behindern. Löten Sie diese. Verbinden Sie die beiden angelötet Stifte durch einen 1 kOhm Widerstand in dem Pin-Header eingefügt wird.
   Hinweis: Das Gefäß Kultivierungs gestapelt werden über die LED-Matrix. Wenn die Drahtbänder des Behälters behindern, versetzt sie von der Matrix. Dann verwenden feste Kerndraht die Lücke zwischen den Matrix-Pins zu überbrücken und den Draht Ribbon Pins, so dass die elektrischen Anschlüsse ch nichtange.

4. Software installieren und eine Verbindung mit Hardware

1. Stapeln Sie die Platine auf dem Mikrocontroller.
2. Folgen Sie den Links in der Liste Materialien der integrierten Entwicklungsumgebung (IDE) und benutzerdefinierte Code für den Mikrocontroller zum Download bereit.
3. Schließen Sie den Mikrocontroller mit dem Mikroskop Computer über eine AB Universal Serial Bus (USB) Kabel. Kompilieren und laden den benutzerdefinierten Code an den Mikrocontroller.
4. Download von Micro-Manager ^{21, 22} und ²³ FIJI. Konfigurieren Micro-Manager als FIJI Plugin durch eine Kopie der "DLL" Dateien, die "mmplugins" Verzeichnis und die "mmautofocus" Verzeichnis aus dem Verzeichnis, in dem Micro-Manager wurde in die "Fiji.app" Verzeichnis heruntergeladen. Kopieren Sie außerdem die "plugins / Micro-Manager" Verzeichnis in das "Fiji.app/plugins" Verzeichnis.
5. Laden Sie die "BioreactorController.jar" Datei into das "Fiji.app/mmplugins" Verzeichnis.
6. Offene Micro-Manager von FIJI> Plugins> Micro-Manager> Micro-Manager Studio. Verwenden Sie die Hardware-Konfigurations-Assistent zum Konfigurieren der Software zur Steuerung des Mikroskops. Fügen Sie die "FreeSerialPort" Gerät im Assistenten mit der Bezeichnung des Ports, an dem der AB-USB-Kabel angeschlossen ist.

5. Stellen und Charakterisieren lichtundurchlässigen Gehäuse für die Anzucht Vessel

1. Stapeln drei 8-Pin-IC-Sockel als Bausteine ​​auf dem Steckbrett an jeder Ecke der LED-Matrix, so dass das Kulturgefäß auf sie über der Matrix ruhen kann.
2. Befestigen eines Teils des Diffusionspapier unter der oberen Schicht der Buchsen, so daß das Licht die Kultivierungsbehälter von der LED-Matrix auffällig ist diffus.
3. Schneiden Sie drei 8 "durch 6" Teile aus schwarzem Schaumstoff. Schneiden Sie einen Teil aus, das die gleiche Größe wie die elektronische Steckbrett ist (2,3 "x 3,5") von der Innenseite des ersten two und ein Abschnitt, der die Größe des Rechtecks, das durch den IC-Buchsen (0,9 "x 1,8") von der Innenseite des dritten gemacht ist. Stapeln dieser Schichten über der LED-Matrix, so dass die letzte Schicht, die 0,9 "x 1,8" Öffnung liegt auch bei der Oberseite der IC-Sockel, und umgibt die LED-Matrix enthält.
4. Schneiden Sie ein weiteres Blatt aus schwarzem Schaumstoff in einem halben 6 "durch 24" Rechteck zu machen. Diese rollen in eine hohle Säule von schwarzen Schaum, der das Kulturgefäß in mit Raum für Rohre und Leitungen passen, so daß es thermisch und optisch das Kulturgefäß zu isolieren.
5. Zentrieren Sie die hohle Säule aus schwarzem Schaumstoff über die LED-Matrix, und die Grenze der Spalte auf der Schicht aus schwarzem Schaumstoff darunter markieren. Diese Grenze wird markiert, wo es in der Zukunft zentriert werden sollte.
6. Schneiden Sie ein 3 "x 3" Portion schwarzen Schaum. Verwenden Sie diese als Deckel später, die an der Spitze der Säule geklebt werden kann externes Licht zu blockieren.
7. Bringen Sie die Photodiode Leistungssensor zu th e Kultivierung Schiffskappe mit Klebeband befestigen Sie die Kappe und stecken im Gehäuse das Kulturgefäß.
8. Im Micro-Manager, gehen Sie zu Plugins> Bioreactor-Controller. Stellen Sie die Matrix mit einer Teilmenge des Bereichs von möglichen Intensitäten bei 30 s Intervallen zu beleuchten.
9. Notieren Sie sich die Lichtintensitäten als auf dem Stromzähler Konsole verbunden mit dem Stromsensor angezeigt. Diese Messungen wird die tatsächliche Intensität von Licht ermöglichen, bekannt sein, wenn die Anzahl von LEDs, die aufleuchten, und die pulsbreitenmodulierten (PWM) Strom zu diesen LEDs eingestellt wird.

6. Bereiten Sie die Anzucht Vessel

Abbildung 6: Behälter - Verbindungen. Dieses Diagramm zeigt, wie das Schiff und die Schläuche der Vorrichtung sollte werden autoklaviert vor angeschlossen werden.blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

1. Mark die Höhe auf jede 2 mL Inkrement der Flüssigkeit im Bereich von 10 ml bis 30 ml in dem Kulturgefäß entspricht. Der Einsatz 10 ml sterilem VE-Wasser, um den Wasserstand zu markieren, fügen Sie 2 ml, um den Wasserstand zu markieren, und wiederholen, bis die 30 ml Ebene gekennzeichnet ist. Decken Sie die Markierungen mit durchsichtigem Klebeband, so dass sie nicht ohne weiteres entfernt werden, und entsorgen Sie die Flüssigkeit.
2. Legen Sie das lange Ende des Aluminium-Port durch die Silikondichtung, in das Kulturgefäß. Schrauben Sie die Kappe.
3. Decken Sie eine kurze Aluminium Durchgangsöffnungsauslass mit 1/16 "ID Silikonschlauch. Stecken Sie das distale Ende durch einen weiblichen Luer - Lock - Einfügen und dann einen männlichen Luer - Lock - Stecker. Dieser Ausgang ist eine Ergänzung und wird nicht verwendet werden (Rohr 6 in 6 ).
4. Schließen Sie zwei kurze Segmente von 1/16 "ID-Silikonschlauch mit männlichen und weiblichen Luer-Schleusen. Schließen Sie das eine Ende mit einem kurzen Aluminium Durchgangsöffnungsauslass und stecken Sie das distal Ende mit einem männlichen Luer und weiblichen Luer-Lock-Stecker. Das Schiff wird durch dieses Rohr (Rohr 7 / 7.1 in Figur 6) beimpft werden.
5. Verbindung von zwei 1/16 "ID Rohre an den Enden des 1/16" ID peristaltischen Schlauch und Anschlüsse. Schließen Sie das eine Ende mit einem kurzen Aluminium - Port und das andere (Rohr 4 in Abbildung 6). Später wird dies dem Medienkolben verbunden sein.

7. Bereiten Sie die Medien Flask

1. Verbinden eines 1/16 "Innendurchmesser (ID) Silikonschlauch zur längsten Aluminium-Port. Das Rohr sollte lang genug sein, die Medienflasche zu erreichen. Verbinden eines 1/8" ID männlichen Luer-Lock mit einem kurzen Segment von 1/16 " ID Schlauch zum Anschluss an das vorhergehende Rohr ,, und dann fügen Sie diesen kurzen Abschnitt in den Gummistopfen auf dem Medienkolben (Rohr 3 in Abbildung 6).
2. Klemmen Sie den Schlauch. Diese Verbindung ermöglicht, dass Luft aus dem Medienkolben zu dem Kulturgefäß zu fließen. Wenn die Medien Kolben später mit Luft ein gepumptd dieses Rohr nicht geklemmten ist, wird die Kultur gemischt, belüftet und gehalten bei einem positiven Druck durch die ankommenden Blasen.
3. Legen Sie eine 1/16 "ID Schlauch lang genug, um den Boden des Kolbens in den Stopfen zu erreichen, durch die Medien übertragen werden. Schließen Sie ein weiteres 1/16" ID Schlauch zu dieser, und dann wird ein 3/16 "ID Schlauch das. Schließen dieses mit einem 3/16 "ID weiblichen Luer - Lock und einem männlichen Luer - Lock - Stecker (Rohr 1 / 1.1 in Figur 6).
4. Das dritte Loch in dem Stopfen ist mit einem kurzen Segment von 1/16 "ID Schlauch, mit zwei anderen Segmenten mittlerer Durchmesser Schlauch- und steckbar am distalen Ende (Rohr 2 / 2.1 in Figur 6) gefüllt werden. Dies wird verbunden werden mit einer Vakuumpumpe und später an einer Aquariumpumpe.
   HINWEIS: Wenn der Schlauch nicht leicht durch die Löcher in den Gummistopfen passen können, mit einer Neigung, die Enden des Schlauchs geschnitten. Dann wird das abgeschrägte Ende, das durch das Loch gedrückt wird, kann verwendet werden, um den Rest bis zu ziehen.

1. Legen Sie einen männlichen Luer-Lock-in ein Segment von 1/16 "ID Silikonschlauch und dann fest 0,022 insert" ID Polytetrafluorethylen (PTFE) Schläuche. Getrennt davon befestigen einen weiblichen Luer - Lock mit einem 1/16 "ID Schlauch. Dann Faden ein Ende entlang der PTFE - Röhre , die Schlösser und die andere auf einen kurzen Aluminium - Port (Rohr 5 in Abbildung 6) zu verbinden.
2. Schließen Sie den freiliegenden 1/50 "ID Silikonschlauch auf die 1/50" ID Peristaltikschlauch und Anschlüsse. Um dies zu verbinden drei Segmente von 1/50 "ID Schläuche und zwei Segmente von 0,022" ID PTFE-Schlauch, abwechselnd ihnen. Zum Anschluss an das Abwasserkolben über 1/16 "ID Schlauch (Rohr 5 in Figur 6).
3. Verbinden eines Endes einer 1/16 "ID Silikonschlauch mit dem zweiten längsten Rohr des Aluminium-Anschluss und das andere Ende mit dem Abstrom Kolben. Dieses Aluminiumrohr setzt das Kulturvolumen und überschüssige Kulturüberlauf in den Abwasserbehälter (Rohr 8 in
4. Autoclave die Kultivierung Montage bei 121 ° C und 15 psi (allgemeine Sterilisation) für 30 min.
   Anmerkung: Die Rohre, durch die die Medien-Kolben gefüllt ist, durch die das Medium Kolben gesaugt wird, und durch die das Kultivierungsgefäß haben inokuliert mehrere Segmente Rohr so ​​dass, wenn das distale Segment kontaminiert ist, kann es eine sterile offenbaren entfernt werden Segment.

9. Bereiten Sie den mikrofluidischen Kanal

1. Mischungs Polydimethylsiloxan (PDMS) und Härter in einem 9: 1-Verhältnis. Degas und gieße auf dem Silizium-Master-Form.
2. Heilen die PDMS für 2 h bei 65 ° C und dann geschnitten von der Maske mit einer Rasierklinge. Cut um den PDMS, bis er aus der Form löst. Vermeiden Sie nach unten drücken und den zerbrechlichen Wafer zu brechen.
3. Verwenden Sie ein 1,2 mm ID Biopsie Lochers Löcher des Kanals an beiden Enden zu stanzen.
4. Plasma - Bindung das PDMS auf dem Deckglas ^24.
5. Kleben Sie die lange Enden des Deckglases mit dem Trag Alurahmen so dass der PDMS-Kanal auf dem Aluminiumrahmen zentriert ist, und dann die PDMS nochmals 2 h bei 65 ° C backen.

10. Füllen Medien Flask

Abbildung 7: Hinzufügen von Medien. Dieses Diagramm zeigt, wie Medien Vakuum in den Medien Kolben gefiltert werden sollen. Es stellt sicher, dass die Medien steril bleibt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

1. Ändern Sie die entsprechenden Medien. Wenn das kontinuierliche Kultivierungssystem als Chemostat betrieben wird, verwenden Sie Medien für einen bestimmten Nährstoff begrenzt.
   Hinweis: Beispiele für Standardmedien Zusammensetzung für Studien mit S. cerevisiae bisher ²⁵ veröffentlicht worden ^sind,= "Xref"> ^{26, 27, 28, 29.}
2. Bringen Sie den Vakuumfilter in einen 100-ml-Flasche, entfernen Sie die Nippelabdeckung, entfernen Sie dann den weißen Stecker aus dem Nippel des Vakuumfilter mit einer sterilen Pinzette.
3. Schließen Sie den 3/16 "ID Silikonschlauch mit dem Nippel, das andere freie Röhre Medienkolben mit einer Vakuumpumpe (Rohre 1 und 2 in 7 bezeichnet), und stellen Sie sicher , dass das Rohr die Medien Kolben an die Kulturgefäß verbinden geklemmt wird geschlossen (Rohr 3 in Figur 7).
4. Füllen Sie den Filter mit Medien, schalten Sie die Vakuumpumpe und dann filtern Sie den Rest der Medien. Klemmen Sie die 1/16 "ID-Silikonschlauch mit dem Vakuum (Rohr 2 in 7) und schalten Sie die Vakuumpumpe ab.
5. Entfernen Sie die leurs aus dem Zwischensegment von 1/16 "ID Schlauch mit der Vakuumpumpe verbunden, so daß ein unbelasteten Ende des Rohrs zugänglich ist. Legen the blauen Ende eines Sterilfilter Luftspritze in dieser Röhre.
6. Klemmen Sie die 3/16 "ID Silikonschlauch (Rohr 1 in Abbildung 7) und ziehen Sie den männlichen Luer von ihm. Ziehen Sie den Stecker aus dem weiblichen Luer der Medieneinlassrohr des Kulturgefäß. Verbinden Sie diese männlichen und weiblichen Luers Medien zu ermöglichen, sein in das Kulturgefäß gepumpt.
7. Entfernen Sie den Vakuumfilter und die Kappe der 100-ml-Flasche von Medien, die mit dem Vakuumfilter angebracht wurde.
8. Ein Tag vor dem Kulturgefäß geimpft werden, eine einzige Kolonie der optogenetische Mikrobe in einem Reagenzglas mit 4 ml der im vorherigen Schritt gesammelten Medien impfen, und lassen Sie es bei 30 ° C über Nacht wachsen oder die optimale Temperatur Wachstumstemperatur Kultur unter Rühren.

11. Montieren Sie das Gerät um die Mikroskop

1. Stellen Sie die kontinuierliche Kultivierung Montage in der Nähe von dem Mikroskop mit den Medien Flasche höher ist als die Kulturgefäß und dem effluent Kolben niedriger als das Kultivierungsgefäß, so dass das Rohr aus Segmenten von 0,022 "ID PTFE - Schlauch besteht (Rohr 5 in Figur 6) können die Mikroskoptisch erreichen. Klebeband sicher die Gummistopfen auf dem Medium Kolben nach unten und Abwasserbehälter.
2. Ziehen der Enden des 0,022 "ID PTFE Schlauch von der 1/50" ID Silikonschlauch ihnen (Rohr 5 in 6), und schließen diese Enden in den Einlass und Auslass der mikrofluidischen Vorrichtung zu verbinden.
3. Schließen Sie das weiße Ende des Spritzenluftfilter zum Aquariumpumpe. Der Luftdruck wird Medium in das Kulturgefäß schieben.
4. Wenn die Medien die Höhe des Abflusses Port erreicht, wickeln Sie die 1/16 "ID Medien Zulaufschlauch und Anschlüsse um die langsame peristaltische Pumpe (Rohr 4 in 6) und die 1/50" ID Probeauslaß Schläuche und Anschlüsse um die schnelle peristaltische Pumpe (Schlauch 5 in Figur 6).
5. Belüften der Medien durch Lösen des Luft tuwerden zwischen dem Medienflasche und Kulturgefäß.
6. Band das Heizkissen und Thermometer zu dem Kultivierungsgefäß so daß seine Temperatur gesteuert werden kann. Wickeln Sie den Medienschlauch um das Kulturgefäß, so dass die Eingabe von Medien bei der gleichen Temperatur wie das Gefäß sein wird.
   HINWEIS: Der PWM Strom zu dem Heizkissen wird durch den Mikrocontroller geregelt, die Eingaben von dem Thermometer verwendet das Kultivierungsgefäß bei seiner Solltemperatur zu halten.
7. Legen Sie das Kulturgefäß in den schwarzen Schaum Gehäuse über die LED-Matrix, und stellen Sie sicher, dass die Rohre nicht eingeklemmt werden.
8. Im Micro-Manager, gehen Sie zu Plugins> Bioreactor-Controller. Stellen Sie die "Medienpumpe Verhältnis auf" Feld bis 0,1 und die "Probenpumpe Verhältnis auf" Feld auf 0. Die Flussrate sehr niedrig sein wird, aber größer als die Verdampfungsrate.
9. Klemmen Sie die ankommende Luftschlauch zwischen dem Medienkolben und Kulturgefäß. Ziehen Sie den Stecker aus der Inokulation Rohr (Rohr 7 in
10. Decken Sie das Gehäuse, so dass kein Licht eintritt, und lassen Sie die Kultur über Nacht wachsen.

12. Kalibrieren Sie die Fördermengen

1. Im Micro-Manager, gehen Sie zu Plugins> Bioreactor-Controller. Stellen Sie die "Medienpumpe Verhältnis auf" Feld bis 0,5 und die "Probenpumpe Verhältnis auf" Feld auf 0.
2. Trennen der Überlaufrohr aus dem Abstrom Kolben (Rohr 8 in Figur 6) und das Entnahmerohr aus dem Abstrom Kolben (Rohr 8 in Figur 6) und sammeln Abwasser in getrennten Gefäßen. Sammeln Sie Abwasser für 1 Stunde, beginnend nach dem die Pumpen für 15 min auf gewesen sein.
3. Berechnen der Strömungsgeschwindigkeit des Mediums in das Kulturgefäß aus dem Volumen in dem Behälter gesammelt, wie:
   
4. Passen Sie den Wert des "Medienpumpe Verhältnis auf" Feld, das durch diese lineare Schätzung:
   
   woher
   
5. Iterieren durch diesen Kalibrierungsvorgang, bis die Differenz zwischen der Soll-Strömungsrate und der gemessenen Strömungsrate <0,2 ml / h, wobei die Fließgeschwindigkeit über einen Zeitraum von 1 Stunde gemittelt wird.
6. Erhöhen Sie den Wert des "Probe - Verhältnis auf" Feld und kalibrieren es in ähnlicher Weise bis etwa 4/5 ^th des Volumens der Kulturgefäß verläßt , wird durch die Probenpumpe abgepumpt und in etwa ^1/5 des Volumens verlässt durch die Überlauföffnung.
7. Lassen Sie die Kulturdichte bei der kontinuierlichen Kultivierungsvorrichtung über Nacht unter diesen Bedingungen äquilibrieren.
   HINWEIS: Wenn die Zieldurchflussraten nicht erreicht werden kann, änderndie Schlauchpumpen. Flüssigkeit wird mit einer höheren Rate gepumpt, wenn größere Rohrdurchmesser verwendet wird. Folgen Sie Schritt 14 und dann zurück 8.4 zu treten.

13. Collect Mikroskop Bilder von Cultured Microbes

1. Füllen Sie die Bühnenpositionsliste in Micro-Manager mit einer Reihe von nicht überlappenden Positionen, an denen Bilder in den mikrofluidischen Kanal gepumpt Zellen werden in der Brennebene sein.
2. Öffnen Sie die "Bioreactor Controller" Plugin. Wählen Sie die gewünschte LED-Matrix Zeitverlauf, Imaging-Kanäle und andere experimentelle Einstellungen aus den Anweisungen. Erfassung und Analyse von Bildern.
3. Während das Experiment läuft, stellen Sie sicher, dass die Medien in den Medien Kolben klar bleibt. Wenn es bewölkt ist, dann ist es kontaminiert worden.

14. Post-Experiment

1. Entsorgen Medien, überschüssige Zellkultur und Abwasser.
2. Füllen Sie den Medien-Kolben mit 200 ml 20% EtOH mit VE-Wasser gemischt. Führen Sie den Chemostat, wie es zuvor hattewurde während des Experiments zu waschen Zelltrümmer und Medien laufen.
3. Wenn der Alkohollösung aus den Medien Kolben abgelassen hat, zerlegen vollständig die chemostat.
4. Waschen Sie Gläser und Rohre mit warmem Wasser und einem milden Reinigungsmittel und gründlich mit entsalztem Wasser. Trocknen lassen.
5. Öffnen Sie die "microcontrollerRecords.csv" Datei, um die Temperatur und LED-Matrix-Status über den Verlauf des Experiments, der "Summary.csv" Datei zu überprüfen Sie die Zusammenfassung von Daten aus jedem Satz von Bildern und die "Ergebnisse .csv" bewertet Dateien Daten zu überprüfen jeden ROI von jeder Zeitperiode zusammenfasst, wobei n die n - ^te Datensatz ist.

Results

Diese Vorrichtung wurde verwendet , um eine Kultur von S. cerevisiae exprimieren , gelb fluoreszierendes Protein (YFP) in Reaktion auf blaues Licht durch einen induzierbaren optogenetische Transkriptionssystem auf dem CRY2 / CIB1 Proteinpaar ³⁰ basierend zu stimulieren. Die Zellen wurden chemostatically in Phosphat begrenzte Medien mit einer durchschnittlichen Verdünnungsrate von 0,2 ± 0,008 gewachsen. Phosphat Begrenzung wird in S. cerevisiae Ch...

Discussion

Wir haben dieses Gerät mit Flexibilität im Auge behalten. Der gesamte Code verwendet wird, ist kostenlos und Open-Source. Die Standard-Bildanalyseprozess Segment Zellen ist einfach und schnell läuft. Benutzerdefinierte Analyse könnte durch die Aufzeichnung von Benutzereingaben durchgeführt werden, während ein repräsentatives Bild mit der FIJI grafischen Benutzeroberfläche Analyse, Umwandlung der Eingabe in ein Skript Beanshell und dann Setzen des Plugin, das Skript zu nennen. Wenn es aufgerufen wird, wird das Skript ein...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Umfangreiches Laborhandbuch	GitHub	NA	Ein umfangreiches, regelmäßig aktualisiertes Laborhandbuch finden Sie in der " Optogenetische Chemostat-Dateien" GitHub-Repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). Dazu gehört auch eine Beschreibung des mikrofluidischen Werkzeugs, mit dem die repräsentativen Ergebnisse generiert wurden.
Fritzing Design Viewer	Fritzing	NA	Die kostenlose, quelloffene Software zum Betrachten und Bearbeiten von Leiterplattendesigns vom Typ .fzz ist unter "http://fritzing.org/download/"
Arduino Uno R3 (Atmega328 - montiert)	Adafruit		50 Mikrocontroller verfügbar. 1 erforderlich.
Arduino Stackable Header Kit	SparkFun Electronics	10007	Stiftleisten für den Anschluss der Leiterplatte an den Mikrocontroller. 1 erforderlich.
Einstellbarer 30W 110V Lötkolben - XY-258 110V	Adafruit	180	Zum Herstellen von elektrischen Verbindungen zur Leiterplatte. 1 erforderlich.
Lötkolbenständer	Adafruit	150	Zum Herstellen von elektrischen Verbindungen zur Leiterplatte. 1 erforderlich.
Mini-Lötspule - 60/40 Blei Kolophonium-Kern Lot 0,031" Durchmesser - 100g	Adafruit	145	Zum Herstellen von elektrischen Verbindungen zur Leiterplatte. 1 erforderlich.
0,1 μ F Kondensator	SparkFun Electronics	COM-08375	Stabilisiert die Spannung in der Leiterplatte. 1 erforderlich.
10 μ F-Kondensator	SparkFun Electronics	COM-00523	Stabilisiert die Spannung in der Leiterplatte. 1 erforderlich.
MAX7219CNG LED-Matrix-/Ziffernanzeigetreiber - MAX7219	Maxim	MAX7219CNG	LED-Treiber. 1 erforderlich.
8 Pin IC Sockel	Mouser Electronics	575-144308	16 erforderlich. Diese werden übereinander gestapelt, um das Kulturgefäß über der LED-Matrix zu stützen.
24 Pin IC-Sockel	Mouser Electronics	535-24-3518-10	Optional. Verwenden Sie diese Option, um den MAXIM 7219CNG-Treiber reversibel an die Leiterplatte anzuschließen.
Digitalmultimeter	Adafruit	2034	Zur Fehlersuche in der Elektronik. 1 erforderlich.
Break-Away-Stiftleisten - 40-poliger Stecker (lang zentriert, PTH, 0,1")	SparkFun Electronics	PRT-12693	Stiftleisten für den Anschluss von LED-Matrix an die Leiterplatte. Die Enden können mit einem Drahtschneider abgeschnitten werden. 1 Satz erforderlich.
Bündiger Seitenschneider	Adafruit	152	Zum Trimmen langer Stiftleisten und Schneiden von Stromkabeln. 1 erforderlich.
Premium-Buchse/Buchse Überbrückungsdrähte - 40 x 12" (300 mm)	Adafruit	793	Drahtband zum Anschluss des Steckbretts an die LED-Matrix. Kann Ende-zu-Ende mit Stiftleisten verbunden werden, um länger zu sein. 1 erforderlich.
Half-Size Breadboard	Adafruit	64	Die LED-Matrix wird mit diesem verbunden und das Kultivierungsgefäß ruht darüber.
Miniatur 8x8 Blue LED Matrix	Adafruit	956	Lichtquelle. Die dominierende Wellenlänge beträgt 470 nm (blau). 1 erforderlich. Alternative Miniatur-LED-Matrizen desselben Herstellers sind mit dominanten Wellenlängen erhältlich: 624 nm (rot), 588 nm (gelb), 525 nm (grün), 572 nm (gelb-grün) und weiß.
Stapelbarer Header-3-polig	SparkFun Electronics	13875	8 erforderlich.
Widerstandssatz - 1/4W (500 insgesamt)	SparkFun Electronics	10969	Für Elektronik. 1 erforderlich.
IRL520N MOSFET	International Rectifier	IRL520N	Spannungsregelschalter zur Steuerung des Gleichstroms. 4 erforderlich.
Hook-Up Wire - Sortiment (Solid Core, 22 AWG)	SparkFun Electronics	PRT 11367	Draht für Elektronik. 1 benötigt.
5V 2A (2000mA) Schaltnetzteil - UL Listed	Adafruit	276	Netzteil für das Heizkissen und Arduino. 2 erforderlich.
12 VDC 1000mA geregeltes Schaltnetzteil - UL-gelistetes	Adafruit	798	Für Schlauchpumpen. 2 erforderlich.
Elektrisches Heizkissen - 10cm x 5cm	Adafruit	1481	Zum Heizen des Bioreaktors. 1 erforderlich.
Schlauchpumpe mit variablem Durchfluss mit niedrigem Durchfluss	Fisher Scientific	13-876-1	Zum Pumpen von Medien. 1 erforderlich
Schlauchpumpe mit mittlerem Durchfluss mit variablem Durchfluss	Fisher Scientific	13-876-2	Zum Pumpen von Kulturen. 1 erforderlich.
9 VDC 1000mA geregeltes Schaltnetzteil - UL-gelistetes	Adafruit	63	Für die Stromversorgung von Mikrocontrollern. Anordnung 1.
Wasserdichter Hochtemperatur-DS18B20 Digitaler Temperatursensor + Extras	Adafruit	642	Thermometer für den Bioreaktor. 1 erforderlich.
Micromanager	Micromanager	NA	Die kostenlose, quelloffene Software zur Steuerung von Mikroskopen ist unter "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release" erhältlich
.	FIJI ImageJ	NA	Die kostenlose, quelloffene Bildanalysesoftware ist unter "http://fiji.sc/"
erhältlichArduino Integrated Development Environment	Arduino	NA	Die kostenlose, quelloffene IDE ist unter "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"
Custom Code	GitHub	NA	verfügbar. Der benutzerdefinierte Mikrocontroller-Code und das "Bioreactor Controller"-Plugin sind in der " Optogenetische Chemostat-Dateien" GitHub-Repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
USB-Kabel A auf B - 6 Fuß	SparkFun Electronics	CAB-00512	Wird zum Herunterladen von Daten auf den Mikrocontroller verwendet. 1 erforderlich.
bioreactorTimecourse_example.csv	GitHub	NA	Der Vorteil des Ladens von LED-Matrixwerten aus einer CSV-Datei besteht darin, dass ein Programm vom Plugin aufgerufen werden kann, um diese Werte basierend auf den Bildanalyseergebnissen zu aktualisieren, und diese Werte können wieder auf den Mikrocontroller geladen werden, was eine Rückkopplungssteuerung ermöglicht. Es ist verfügbar über die " Optogenetische Chemostat-Dateien" GitHub-Repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
Tota-Frost-Gele (Diffusionspapier)	B& H	B& F H # LOFSFTL MFR # T1-72	Für LED-Matrix. 1 erforderlich.
Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in	Grainger, inc	20JL37	Schwarzer Schaumstoff für die Einhausung von Zuchtgefäßen. 4 erforderlich.
Standard-Fotodioden-Leistungssensor, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW	Thorlabs	S120VC	Zur Messung der Lichtintensität. 1 erforderlich.
Beschriftungsband	Fisher Scientific	159015N	Zum Etikettieren und Sichern von losen Bauteilen. 1 erforderlich.
Kompaktes Leistungs- und Energiemesspult, Digital 4" LCD	Thorlabs	PM100D	Zur Messung der Lichtintensität. 1 erforderlich.
100 mL GL45 Hybridisierungs-Glasflasche	Bellco Glass, Inc.	(7910-40150)	Bioreaktorbehälter. 1 erforderlich.
Montage mit sechs Anschlüssen	Bellco Glass, Inc.	Benutzerdefiniert	Für das Bioreaktorgefäß. Schlauchspezifikationen: .125" OD x .055" ID. Anschluss A: 1,0" lang über dem Kappen-Slug und bis zum Boden des Rohrs. Anschlüsse B,C,E,F: 1,0" lang über dem Kappenslug, 33 mm lang unten. Anschluss D: 1,0" lang über dem Kappen-Butzen, 65 mm  Lange unten. 1 erforderlich. Enthält einen offenen Schraubverschluss aus Polypropylen mit einem Durchmesser von 45 mm und eine weiße Silikondichtung, um eine dichte Abdichtung zwischen der Kappe und dem Gefäß zu gewährleisten.
Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 Zoll, 3er-Pack	Amazon	B0009F3P3U	Clear Scotch Tape. Dies ist bei vielen anderen Anbietern erhältlich. Es wird verwendet, um Markierungen auf dem Kulturgefäß abzudecken und das Deckglas mit der PDMS-Schiene am Aluminium-Stützrahmen zu befestigen.
1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" Wand Tygon Sanitär Silikonschlauch	Vereinigte Staaten Plastic Corp.	57288	Schlauch. ~25' erforderlich.
Cole-Parmer Twistit weißer Gummistopfen, Größe 10	Cole-Parmer	EW-62992-32	Medienkolbenstopfen und Abwasserkolbenstopfen. 2 erforderlich.
2L Laborkolben	Pyrex	4980	Medienkolben und Abwasserkolben. 2 erforderlich.
Tag-Pinchhahn	Fisher Scientific	5867	Zum Klemmen von Schläuchen. 3 erforderlich.
Ersatzschlauch 1/16" ID	Rückverfolgbare Produkte	3372	Die Schlauchpumpen werden mit einem Satz Schläuche geliefert, die jedoch nach wochenlangem Gebrauch verschleißen.
Ersatzschlauch 1/50" ID	Rückverfolgbare Produkte	3371	Die Schlauchpumpen werden mit einem Satz Schläuche geliefert, die jedoch nach wochenlangem Gebrauch verschleißen.
Luer-Stecker mit Sicherungsring x 1/16" Schlauchtülle, Nylon, 25/pk	Cole-Parmer	EW-45505-00	Anschlüsse. ~10 Luer sind erforderlich.
Luer-Stecker mit Sicherungsring x 1/8" Schlauchtülle, Nylon, 25/pk	Cole-Parmer	EW-45505-04	Anschlüsse. 5 erforderlich, eines für jedes Gummistopfenloch zum Befüllen mit Schlauch.
Luer-Buchse x 1/16" Schlauchtülle, Nylon, 25/pk	Cole-Parmer	EW-45502-00	Anschlüsse. ~10 Luer erforderlich.
Luer-Buchse x 3/16" Schlauchtülle Adapter	Cole-Parmer	EW-45502-08	Anschlüsse. ~10 Luer erforderlich.
Cole-Parmer Luer-Zubehör, weibliche Luer-Kappe, Nylon, 25/pk	Cole-Parmer	SC-45502-28
Cole-Parmer Luer-Zubehör, männlicher Luer-Lock-Stecker, Nylon, 25/pk	Cole-Parmer	EW-45505-56
PTFE-Schlauch mit Mikrobohrung, 0,022" ID x 0,042" AD, 100 ft/Rolle	Cole-Parmer	EW-06417-21	Schlauch. 1 Rolle erforderlich.
Masterflex platingehärteter Silikonschlauch, L/S 13, 25 ft	Cole-Parmer	EW-96410-13	Schlauch. ~25' erforderlich.
3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" Wand Tygon Sanitär Silikonschlauch	Vereinigte Staaten Plastic Corp.	57293	Schlauch. ~1' erforderlich.
Vakuumfilter	Fisher Scientific	974107	Nalgene Vakuumfilter für sterile Filtermedien.
Aquel Oxy-Boost 200	Rena Aquatic Supply	AP200	Doppelmembran-Luftpumpe mit einstellbarem Durchfluss zum Belüften und Mischen von Medien. 1 erforderlich.
0,2 μ m Poren-Spritzenvorsatzfilter	Corning International	431229	Dadurch wird sichergestellt, dass die Luft aus der Aquarienpumpe das Gerät nicht verunreinigt. 1 erforderlich.
Slygard 184 Silikon-Elastomer-Kit	Dow Corning	Slygard 184	Für mikrofluidische Geräte. 1 erforderlich.
Amerikanischer Rasierhobel GEM Scientific Einschneidige Rasierklingen	Fisher Scientific	17989000	Zum Schneiden von Rohren und PDMS. 1 Klinge erforderlich.
Harris Uni-Core Locher 1,2 mm ID	Sigma-Aldrich	WHAWB100028 ALDRICH	Zum Stanzen von Ein-/Auslass in mikrofluidischen Geräten. 1 erforderlich.
Mikroskop-Deckglas 22x60-1.5	Fisher Scientific	12-544-G	Für mikrofluidische Geräte. 1 erforderlich.
Rechteckiger Aluminiumrahmen mit quadratischem Fenster	Custom	Custom	Zur Unterstützung des mikrofluidischen Kanals. Außenmaße: 3 Zoll x 1,25 Zoll. Innenmaße (ausgeschnittener Teil): 7/8 Zoll x 7/8 Zoll Dicke: ~1/32 Zoll