Methodenartikel

Studie des endoplasmatischen Reticulum und Mitochondria Wechselwirkungen durch In Situ Nähe Ligatur Assay in fixierten Zellen

DOI:

10.3791/54899

⸱

10. Dezember 2016

 , 
1Lund University Diabetes Centre, Lund University, 2INSERM UMR-1060, CarMeN Laboratory, Lyon 1 University, INRA U1235, INSA of Lyon, Rockefeller and Charles Merieux Lyon-Sud Medical Universities

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Visualisierung und mit hoher Empfindlichkeit die endogenen Wechselwirkungen zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und Mitochondrien in fixierten Zellen zu quantifizieren. Das Protokoll verfügt über eine optimierte In - situ - Proximity Ligation Assay Inositol - 1,4,5-triphosphat Rezeptor / Glucose-regulierte Protein 75 / spannungsabhängige Anionenkanals / Cyclophilin D - Komplex an der Mitochondrien-assoziierte Membran Schnittstelle Targeting.

Zusammenfassung

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Strukturelle Wechselwirkungen zwischen der endoplasmatischen retikulären Membran (ER) und den mitochondrialen Membranen, in Bereichen, die als Mitochondrien-assoziierte Membranen (MAM) bekannt sind, sind entscheidende Knotenpunkte für die zelluläre Signalübertragung und das Zellschicksal. Insbesondere ermöglichen diese Kontaktstellen zwischen den Organellen den Transfer von Calcium vom ER zu den Mitochondrien durch den spannungsabhängigen Anionenkanal (VDAC)/glukosereguliertes Protein 75 (GRP75)/Inositol-1,4,5-triphosphatrezeptor (IP3R) Calciumkanalisierungskomplex. Während dieses subzelluläre Kompartiment sowohl unter physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen intensiv untersucht wird, gibt es keine einfache und empfindliche Methode, um das endogene Ausmaß des ER-Mitochondrien-Kontakts in Zellen zu quantifizieren. In ähnlicher Weise sind MAMs hochdynamische Strukturen, und es gibt keinen geeigneten Ansatz, um Modifikationen von ER-Mitochondrien-Interaktionen ohne Proteinüberexpression zu verfolgen. In dieser Arbeit berichten wir über ein optimiertes Protokoll, das auf der Verwendung eines in situ Proximity-Ligationsassays basiert, um endogene ER-Mitochondrien-Interaktionen in fixierten Zellen zu visualisieren und zu quantifizieren, indem die enge Nähe zwischen Proteinen der äußeren mitochondrialen Membran (VDAC1) und der ER-Membran (IP3R1) an der MAM-Grenzfläche genutzt wird. Ähnliche in situ Proximity-Ligationsexperimente können auch mit den Antikörperpaaren GRP75/IP3R1 und Cyclophilin D/IP3R1 durchgeführt werden. Dieser Assay bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen bildgebenden Verfahren, da er hochspezifisch, sensitiv und für Tests unter mehreren Bedingungen geeignet ist. Daher sollte die Verwendung dieses in situ Proximity-Ligationsassays hilfreich sein, um die physiologischen Regulationsmechanismen von ER-Mitochondrien-Interaktionen sowie ihre Rolle in pathologischen Kontexten besser zu verstehen.

Einleitung

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Mitochondrien und endoplasmatisches Retikulum (ER) nicht unabhängig sind Organellen in der Zelle, aber sie interagieren strukturell und funktionell an Kontaktstellen definiert als Mitochondrien-assoziierte endoplasmatischen Retikulum Membranen (MAM). Tatsächlich entsprechen MAMs zu Regionen, in denen die Membranen des ER und Mitochondrien eng angelagert werden, so dass Wechselwirkungen zwischen Proteinen von beiden Seiten. Dennoch verschmelzen die Membranen dieser Organellen nicht innerhalb dieser Regionen, so behalten sie ihre separate Einheiten. Die MAMs spielen eine entscheidende Rolle bei der Calcium (Ca 2+) und Phospholipid Transfer von ER zu den Mitochondrien, den Energiestoffwechsel und das Überleben der Zellen 1-3 zu beeinträchtigen.

Die Assoziation zwischen dem ER und Mitochondrien wurde zuerst in den 1970er Jahren mit der Elektronenmikroskopie sichtbar gemacht. Seitdem Transmissionselektronenmikroskopie 4,5, Elektronentomographie 6,7 oder Immuno-Lokalisierung von ER und Mitochondrien-spezifischen Fluorophores / fluoreszierende Proteine 8 wurden klassisch zu studieren ER-Mitochondrien - Wechselwirkungen. Ein weiteres nützliches Werkzeug für die Analyse von MAM auf der Verwendung von subzellulären Fraktionierung basiert. Es erlaubt die Isolierung von MAM Fraktionen durch Differential Ultrazentrifugation gekoppelt mit einem Percollgradienten 9. Allerdings enthält das Endprodukt angereichert MAM Fraktionen, anstatt reinen Fraktionen. Insgesamt sind diese Strategien nicht besonders empfindlich und / oder quantitative, und sie sind nicht leicht zugänglich für große Screening. Alternativ haben genetische Ansätze unter Verwendung von arzneimittel induzierbaren fluoreszierendes inter-Organell Linkern entstanden, aber sie haben nicht die Analyse von Organell Wechselwirkungen an den endogenen Expressionsniveaus von 10 Proteinen ermöglichen.

Basierend auf Szabadkai Entdeckung des IP3R / Grp75 / VDAC Komplex im MAM 11 entwickelten wir eine quantitative Methode ER-Mitochondrien - Interaktionen zu analysieren. Wir haben die in situ Nähe ligatiauf Assay Wechselwirkungen zwischen VDAC1 und IP3R1 zwei Organell-Oberflächenproteine im Ca 2+ -channeling Komplex an der Grenzfläche MAM in fixierten Zellen 12 beteiligt zu detektieren und zu quantifizieren. Kurz gesagt, sondiert wir VDAC1 an der äußeren mitochondrialen Membran (Maus - anti-VDAC1 primärer Antikörper) und IP3R1 an der ER - Membran (Kaninchen - anti-IP3R1 primärer Antikörper) (Abbildung 1, Tafel A). Dann wird gemäß dem Test haben wir sowohl anti-Maus- und anti-Kaninchen-IgG (Maus und Kaninchen Proximity Ligation Assay-Sonden), die an komplementäre Oligonukleotid Erweiterungen konjugiert sind. Wenn die beiden Proteine gezielt in einem Abstand von weniger als 40 nm sind, können die Oligonukleotide mit den anschließend zugegeben Verbinder Oligos hybridisieren die Bildung einer kreisförmigen DNA - Templat (1, Feld B) zu ermöglichen. Diese kreisförmige DNA - Molekül ligiert und amplifiziert, eine einzelsträngige DNA - Produkt kovalent an einer der Näherungssensoren zu schaffen (Abbildung 1, Tafel c) 6, Proximity Ligation und Amplifikation kann durchgeführt werden, aufgrund der Hybridisierung von Texasrot-markierten Oligonukleotidsonden zum anschließenden Nachweis führen (Abbildung 1, Tafel d ). Jeder fluoreszierenden Punkt repräsentiert Wechselwirkungen zwischen VDAC1 / IP3R1, so dass die Quantifizierung der in - situ - ER-Mitochondrien - Wechselwirkungen in einzelnen Zellen.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung der Detektion von endoplasmatischen Retikulum-Mitochondrien Wechselwirkungen von In Situ Proximity Ligation Assay. a) Antikörpers Eine Maus primären gegen VDAC1 und ein Kaninchen primären Antikörper gerichtet gegen IP3R1 an ihre Epitope in der Nähe an der Schnittstelle MAM binden kann, b) die Zugabe eines Paares von Annäherungs Ligierung Sondengegen Maus und Kaninchen-IgG. Diese Sonden wurden DNA-Stränge befestigt, die Vorlagen für die Unterbindung des Steckers Oligos bilden können. c) Die kreisförmige DNA - Strang nach Ligatur gebildet wird, kann verstärkt und d) durch Mikroskopie als fluoreszierender Punkt unter Verwendung Texas rot-markierten Oligonukleotiden sichtbar gemacht werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Ähnliche in situ Proximity Ligation Assay Experimente können mit dem Grp75 / IP3R1 Paar von Antikörpern sowie Cyclophilin D (CypD) / IP3R1 Antikörper durchgeführt werden, wenn man bedenkt , dass CypD wurde an der MAM Schnittstelle mit dem IP3R / Grp75 / VDAC - Komplex interagieren gezeigt 14.12.

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Protokoll

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1. Herstellung der Lösungen

  1. Herstellung von 10% Formaldehyd in PBS (low-Salz) von 5,5 ml 37% Formaldehyd in 14,5 ml PBS verdünnt. Vorbereitung 1 M Glycin, pH 8,0, die durch Auflösen von 3,8 g Glycin in 50 ml PBS; verdünnt diese Lösung 100 mM Glycin in 1x PBS zu erhalten.
  2. Bereiten 0,1% Triton-X100 in 1x PBS. Bereiten Sie 20x Saline Sodium Citrate (SSC) unter Verwendung von 3,0 M Natriumchlorid und 0,30 M Trinatriumcitrat in einem VE-Wasser-Puffer mit pH 7,0 bei 25 ° C. Verdünnen Sie diesen Puffer auf 1x und 0,01x entsalztes Wasser.

2. Fixierung von Zellen

HINWEIS: Es wird verwendet , um die HuH7 hepatocarcinoma Zelllinie in dieser Studie, aber dieses Verfahren ist anwendbar auf andere adhärente Zellkulturen.

  1. Platte HuH7 Zellen (kultiviert in DMEM 1 g / l Glucose, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum und 0,01% Penicillin-Streptomycin Lager) bei 150000 Zellen pro unbeschichteten 35-mm Glasbodenschale. Bei Arbeiten an PrimärzelleKulturen, verwenden Kollagen-beschichteten Schalen.
  2. Am nächsten Tag, entfernen Sie das Kulturmedium. Waschen Sie die Zellen mit 1 ml PBS und absaugen. Befestigen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml Formaldehyd 10% und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur (RT) unter Rühren.
  3. Stoppen Sie die Reaktion mit 1 ml 1 M Glycin und mischen durch Rotation. Entfernen Sie die Stopp-Reaktionslösung und die Zellen werden durch Zugabe von 1 ml 1x PBS; durch Rotation und absaugen agitieren. 1 ml 100 mM Glycin zu den Zellen und inkubiere sie für 15 min bei RT unter Rühren und dann absaugen.
    HINWEIS: Das Protokoll hier angehalten werden kann und die folgenden Schritte können auf einen anderen Tag verschoben werden. In diesem Fall 1 ml 100 mM Glycin und halten bei 4 ° C, falls erforderlich.

3. Die Permeabilisierung der Zellen

  1. 1 ml 0,1% Triton-X100 in 1x PBS, Inkubation für 15 min bei RT unter Rühren, und dann gründlich absaugen. Diese Inkubationszeit erhöht 15 werden konnte - 20 min, wenn sie auf Primärzelle cultur Arbeitses (zB primäre Mäuse Hepatozyten). Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml 1x PBS; aspirieren.

4. Sperren

  1. Werden 40 & mgr; l Blockierungslösung zu jeder Probe (vom kit); Dieses Volumen kann erhöht werden, um die Probe zu bedecken. Inkubiere das Geschirr für 30 min bei 37 ° C in einer Feuchtigkeitskammer.
  2. Tippen Sie auf die Blockierungslösung aus der Gerichte. Versuchen Sie, gleich Restvolumina für jede Folie zu erhalten, da diese Reproduzierbarkeit beeinflussen. Lassen Sie sich nicht die Proben trocknen!

5. Primary Antibodies

  1. Verdünnen Sie die primären Antikörper in 1x PBS und fügen Sie die Lösung für die Gerichte (VDAC1 Maus-Antikörper: 1/100, IP3R1 Kaninchen-Antikörper: 1/500). Alternativ Grp75 oder CypD Antikörper (beide Maus-Antikörper bei 1/500 verwendet wird) kann anstelle von VDAC1 verwendet werden.
  2. Inkubieren über Nacht in einer feuchten Kammer bei 4 ° C. Waschen Sie die Objektträger zweimal mit Tris-gepufferte Salzlösung mit 0,01% Tween (TBS-T).
6. Proximity Ligatur Assay Probes

  1. Proximity-Ligation-Assay-Sonden werden von dem Kit zur Verfügung gestellt. Wählen Sonden entsprechend den Arten von primären Antikörpern.
  2. Bereiten Sie die beiden Proximity Ligation Assay-Sonden 1: 5 in Antikörperverdünnung. Lassen Sie die Mischung 20 min bei RT zu sitzen. Fügen Sie die verdünnte Nähe Ligatur Assaysonde Lösung. Inkubieren des Geschirrs in einem vorgewärmten Feuchtigkeitskammer für 1 h bei 37 ° C. Waschen Sie die Gerichte zweimal mit TBS-T.

7. Ligatur

  1. Verwenden Sie die in - situ - Nachweisreagenz Texas rot - Kit.
  2. Verdünnen Sie die 5-fach Ligatur Lager (zur Verfügung gestellt von dem Kit) 1: 5 in hochreinem Wasser und gut mischen. Verdünnen Sie die Ligase in 1x Ligierungslösung (von dem Kit zur Verfügung gestellt) 01.40 und Wirbel. Warten, um die Ligase hinzuzufügen, bis unmittelbar vor der Zugabe zu den Proben.
  3. Diese Lösung wird zu jeder Probe (40 ul für 35-mm-Glasbodenschalen) und Inkubation der Objektträger in einem vorgewärmten Feuchtigkeit chamber für 30 min bei 37 ° C. Waschen Sie die Objektträger zweimal mit TBS-T.

8. Amplification

HINWEIS: Achten Sie darauf, lichtempfindliche Reagenzien.

  1. Verdünnen Sie die 5-fach Verstärkung Lager (von dem Kit zur Verfügung gestellt) 1: 5 in hochreinem Wasser. Entfernen Sie die Polymerase aus der Tiefkühltruhe mit dem Gefrierblock (-20 ° C). Verdünnen Sie die Polymerase (von dem Kit zur Verfügung gestellt) 1:80 in der 1x Verstärkerlösung und Wirbel. Fügen Sie die Polymerase unmittelbar vor der Mischung verwendet wird.
  2. Diese Lösung wird zu jeder Probe (40 ul für 35-mm-Glasbodenschalen). Inkubieren der Objektträger in einem vorgewärmten feuchten Kammer für 100 min bei 37 ° C. Tippen Sie auf die Amplification-Polymerase-Lösung aus der Folien.

9. Schluss Waschen

  1. Waschen Sie die Folien in 1x SSC Waschpuffer für 2 min. Waschen Sie die Folien in 0,01x SSC Waschpuffer für 2 min. Lassen Sie die Gerichte im Dunkeln bei RT trocknen.

10. Vorbereitung für Imaging

  1. Montieren Sie die Folien ein minimales Volumen von Montagemedium enthält DAPI (wässrige und nicht erstarrt), um sicherzustellen, dass keine Luftblasen unter dem Deckglas verfangen. Nagellack kann verwendet werden, um die Kanten zu versiegeln. Warten Sie ca. 15 Minuten vor der Verwendung eines Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskop zu analysieren (Anregung: 594 nm, Emission: 624 nm, Vergrößerung: 63X).
  2. Nach der Bebilderung, speichern Sie die Objektträger bei -20 ° C im Dunkeln.

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Ergebnisse

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Basierend auf unserer Erfahrung dieses Protokoll verwenden, können wir diese Methode zur Visualisierung und Quantifizierung von ER-Mitochondrien-Wechselwirkungen in fixierten Zellen sicher zu empfehlen. Repräsentative Bilder von in situ Proximity Ligation Assay-visualisierten ER-Mitochondrien - Wechselwirkungen in der HuH7 hepatocarcinoma Zelllinie unter Verwendung von mehreren Paaren von Antikörpern, gezeigt. Wie in Figur 2 durch Fluoreszenzmikroskopie gezeigt,...

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Diskussion

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Zusammenfassend deuten unsere Studien darauf hin, dass der in situ Proximity-Ligationsassay wirklich eine relevante Strategie ist, um endogene ER-Mitochondrien-Interaktionen in fixierten Zellen zu verfolgen und zu quantifizieren, ohne dass organellenspezifische Fluorophore oder fluoreszierende Proteine verwendet werden müssen. Die spezifische Verwendung von VDAC1/IP3R1-Antikörpern wurde angepasst, um ER-Mitochondrien-Wechselwirkungen in HuH7-Zellen zu untersuchen. Je nach Zelltyp können jedoch alternative Isofor...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken allen Menschen in unserem Labor, die das Protokoll beigetragen zu optimieren und zu validieren. Diese Arbeit wurde von INSERM und der nationalen Forschungsagentur (ANR-09-JCJC-0116 UND ANR-11-BSV1-033-02) unterstützt. ET wurde während ihrer Promotion durch ein Forschungsstipendium aus dem Französisch Ministerium für Hochschulbildung und Forschung unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
FormaldehydSigmaF-8775
GlycinSigmaG-8898
TritonSigmaT8532
35 mm GlasbodenkulturschalenMatTeK CorporationP35G-0-14-C
BlockierungslösungSigmaDUO-92004 oder DUO-92002in den Duolink PLA-Sonden enthalten, Sigma
VDAC1 AntikörperAbcamab14734
IP3R1-H80 AntikörperSanta Cruzsc28614
CypD AntikörperAbcamab110324
Grp75 AntikörperSanta Cruzsc13967
TBS 10xeuromedexET220Verdünnt zu 1x
Tween 100xeuromedex2001-BVerdünnung in TBS zu 0,01%
PLA Sonden Maus MINUSSigmaDUO-92004Duolink, Sigma
PLA Sonden Rabbit PLUSSigmaDUO-92002Duolink, Sigma
Duolink Detektionsreagenzien rotSigmaDUO-92008Duolink, Sigma
LigationslösungSigmaDUO-92008Teil der Duolink Detektionsreagenzien rot, Sigma
LigaseSigmaDUO-92008Teil der Duolink Detektionsreagenzien rot, Sigma
AmplifikationslösungSigmaDUO-92008Teil der Duolink Detektionsreagenzien rot, Sigma
PolymeraseSigmaDUO-92008Teil der Duolink Detektionsreagenzien rot, Sigma
Duolink EindeckmediumSigmaDUO80102Duolink, Sigma
Softwares
Blob-Finder-SoftwareBlobFinder ist eine frei vertriebene Software, die Berechnungen an Zellen aus Fluoreszenzmikroskopie-Bildern durchführen kann. Diese Software kann kostenlos vom Zentrum für Bildanalyse an der Universität Uppsala heruntergeladen werden, das die Software entwickelt hat, und die Arbeit wurde durch das EU-RP6-Projekt ENLIGHT und Olink Bioscience unterstützt. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm
ImageJ SoftwareKann kostenlos heruntergeladen werden bei: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html

Referenzen

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Schlagwörter

Endoplasmic Reticulum Mitochondria InteractionsMitochondria Associated MembranesVDAC1 IP3R1 ComplexFixed Cell ImagingProximity Ligation Assay ProtocolER Mitochondria Contact QuantificationCalcium Channeling ComplexGRP75 IP3R1 PairCyclophilin D IP3R1

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