Die histologische Quantifizierung der chronischen Myokardinfarktes bei Ratten

Zusammenfassung

Die postmortale Beurteilung des Myokardinfarkts (MI) bei Nagetieren basiert auf der Quantifizierung des Infarkts an gefärbten Herzschnitten. Wir beschreiben eine genaue Methode zur Quantifizierung der Infarktgröße unter Verwendung systematischer Probenahmen von entnommenen Rattenherzen von der Basis bis zur Spitze und Bildanalysen von trichromgefärbten histologischen Schnitten.

Zusammenfassung

Myokardinfarkt ist definiert als Tod von Kardiomyozyten aufgrund einer anhaltenden Ischämie; eine Entzündungsreaktion und Narbenbildung (Fibrose) folgen der ischämischen Verletzung. Nach der anfänglichen akuten Phase verändert der chronische Umbau des linken Ventrikels (LV) die Struktur und Funktion des Herzens. Die permanente Koronarligatur bei Kleintieren wurde häufig als Referenzmodell für ein chronisches Modell des Myokardinfarkts verwendet. Die Ausdünnung der Infarktwand entwickelt sich progressiv zu einer transmuralen Fibrose. Die histologische Beurteilung der Infarktgröße wird häufig durchgeführt; Dennoch fehlt eine Standardisierung der Methoden zur Quantifizierung. Wichtige methodische Aspekte, wie die Anzahl der analysierten Abschnitte und die Probenahme- und Quantifizierungsmethoden, werden in der Regel nicht beschrieben und schließen daher einen Vergleich zwischen Untersuchungen aus. Zu oft wird die Quantifizierung an einem einzigen Schnitt durchgeführt, der auf Höhe der Papillarmuskulatur erhalten wird. Da neuartige Strategien zur Reduzierung der Infarktausdehnung und des Umbaus untersucht werden, besteht ein wichtiger Bedarf an der Standardisierung genauer Herzprobenahmeprotokolle. Wir beschreiben eine genaue Methode zur Quantifizierung der Infarktgröße anhand einer systematischen Probenahme von geernteten Rattenherzen und Bildanalysen von trichromatisch gefärbten histologischen Schnitten, die von der Basis bis zur Spitze entnommen wurden. Wir liefern auch den Nachweis, dass die Berechnung des Expansionsindex (EI) eine Beurteilung der Infarktgröße unter Berücksichtigung von Veränderungen des linken Ventrikels während des Umbaus ermöglichte.

Einleitung

Myokardinfarkt (MI) ist eine führende Ursache für Tod und Behinderung weltweit. Die koronare Herzkrankheit ist die Hauptursache; MI ergibt sich aus Ischämie in Folge einer koronaren Ereignissen wie Okklusion. Wenn Reperfusion nicht innerhalb der ersten 6 Stunden durchgeführt, induziert Ischämie irreversible myocardial necrosis. Bei Patienten, stützt sich die Charakterisierung von MI auf verschiedene Diagnose - Tools, einschließlich der klinischen Symptome, der Elektrokardiographie, die Beurteilung der Plasmaspiegel von Biomarkern, Echokardiographie, MRT - Bildgebung und histologische Analysen ^1. nach dem Zeitpunkt der myokardialen Nekrose relativ zu der Zeit der Koronarverschluss akuten und chronischen MI als zwei verschiedene Phasen Verletzungs eingestuft. Die akute Phase, während der ersten 7 Tage stattfindet, wird mit dem Verlust von Kardiomyozyten, ausgedehnte Entzündungen, und die Rekrutierung von Fibroblasten. Die subakuten Phase durch Heilung des Herzgewebes und die Bildung einer Narbe gekennzeichnet, auftrittzwischen 1 und 4 - 6 Wochen. Erweiterung des Infarkts, Ventrikel Wandverdünnung und Ventrikel Dilatation charakterisieren die chronische Phase. Umfangreiche Neugestaltung des linken Ventrikels führt schrittweise in schwerer Herzinsuffizienz ^2.

MI durch permanente linken vorderen absteigenden Arterie (LAD) Ligatur stellt die Standard-Nagetiermodell von chronischem Myokardinfarkt induziert. Die koronare Ligatur ahmt die Koronarokklusion. Die Größe des Infarkts hängt von der Stelle der Ligatur. Charakterisierung von myokardialen ischämischen Verletzung in einem Nagetiermodell klassisch unter Verwendung von Biomarkern Plasmaspiegel, wie Troponin ausgeführt I und T ^3, Echokardiographie, MRT und Histologie ^4,5. Biomarkers Pegel werden mit dem Ausmaß der Kardiomyozyten Tod korreliert. Echokardiographie wertet die linke Beeinträchtigung der Ventrikelfunktion aus regionalen Wandbewegungsstörungen. Zusätzlich können nicht-invasive Bildgebungsverfahren, wie MRI oder hochauflösendeEchokardiographie, erlauben die Beurteilung der Verringerung der Wandbewegung, das Volumen des Narbenbereich mit reduzierten Perfusion und vitales Myokard und der Wandverdünnung. LV Abmessungen ermöglichen die genaue Auswertung der Infarktgröße. Schließlich kann die Quantifizierung der lebenden und toten Myokard durchgeführt werden post mortem spezifischen Flecken von histologischen Schnitten von geernteten Herzen verwendet und ermöglicht die Überprüfung der Infarktgröße (IS). Ein weiteres wichtiges Merkmal ist die Auswertung des Infarkts Erweiterungsindex (EI) ^6. Die EI wird mit dem transmuralen Infarkt und beginnt innerhalb der ersten 3 Tagen verbunden. Die EI wird durch eine progressive Verringerung der Wandstärke, einer Erhöhung in der LV Hohlraumgröße und folglich Veränderungen in LV Form charakterisiert.

Um die therapeutische Wirksamkeit von neuartigen Behandlungen zu bewerten - insbesondere die regenerative Strategien basierend auf Zellen, Matrizen und Genübertragung-genaue Beurteilung von MI bei Nagetieren ist von größter Bedeutung.Wenn auf einem einzigen Querschnitt an der Papillarmuskel Ebene erhalten gemessen, kann die IS Größe kann aufgrund der großen Variabilität vorgespannt werden, die nach LAD-Ligation in die Infarktentwicklung vorhanden ist; der Scheitel Infarkt abgedeckt werden, könnten dann. Wichtig sind für Mäuse ^7-9 oder Ratten beschrieben, genauere Methoden zu bestimmt MI Größe ^10. Dennoch ist nicht ausreichend, um genau LV Umbau oder therapeutisch induzierten Reduktionen (oder Verhinderungen) der Umbau zu quantifizieren. Tatsächlich wird üblicherweise als Prozentsatz der gesamten LV Volumen auf Querschnitte des Herzens beurteilt ausgedrückt. Obwohl dieses Verfahren zur Behandlung von akuter MI gültig ist, bleibt die Ausdünnung der LV Wand während des Umbaus auftretenden ^11,12 untersucht. Eine vollständige morphometrische Quantifizierung der Infarktgröße und strukturelle Änderungen sollten einige Parameter, wie endokardialen und epikardialen Längen und Durchmesser sowie Infarkt und gesunde Bereiche zu quantifizieren. Wir beschreiben eine methodische ca.oach genau zu beurteilen, MI und Umbau in einem chronischen Rattenmodell.

Protokoll

Alle Tiere erhielten humane Pflege im Einklang mit der Europäischen Konvention zum Tierpflege. Chirurgische Eingriffe wurden in Übereinstimmung mit dem Schweizer Tierschutzgesetzes durchgeführt, nachdem die Erlaubnis des Staates Veterinäramt zu erhalten, Fribourg, genehmigt durch das Bundesamt für Veterinärwesen, Schweiz.

1. Herzernte

HINWEIS: Alle chirurgischen Eingriffe wurden unter Isofluran-Narkose durchgeführt. Es wurden Anstrengungen unternommen Leiden der Tiere zu verringern. Insbesondere erhielten alle Tiere eine subkutane Injektion von 0,1 mg / kg Buprenorphin Präanästhesie. Das chirurgische Protokoll für Myokardinfarkt inducting wurde bereits an anderer Stelle ¹³ beschrieben.

1. Führen Sie eine Sternotomie auf einem myocardial Infarkt Tier unter Narkose (intubiert Tier, 2,5% Isofluran, richtige von Pfote Prise Reflex bestätigt Anästhesie).
   1. Öffnen Sie das Tier durch die Haut schneiden und dann die Muskelnmit chirurgische Scheren. Schneiden Sie die Rippen auf der linken und rechten Seite, und dann auf die Brust zu entfernen.
   2. Entfernen Sie die restlichen Adhäsionen nach der vorhergehenden Operation (LAD-Ligation). Schneiden Sie die Aorta und entfernen Sie das Herz. Legen Sie das Gewebe in 1 M KCl (in PBS), und dann waschen Sie es mit PBS.

2. Gewebepräparation

1. Setzen Sie das Infarkt Herz in Längsrichtung in einem Acrylrattenherz-Matrix. Halten Sie es bei -20 ° C für 1 Stunde.
2. Schneiden Sie das Herz direkt in der Matrix eine Rasierklinge mit einer Quer verwenden. Stellen Sie sicher, jede Scheibe ist 2 mm dick. Schneiden Sie ca. 5 bis 7 Rutschen für jedes Herz (basierend auf dem Umbau Ebene); dies ist eine systematische Probenahme genannt.
3. Bei diesem Schritt ist es, die 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) Färbung durchführen optional (halten Sie die Ausrichtung des Herzens Scheiben Basis-Spitze).
   1. Inkubieren in 1% TTC in PBS für 50 min bei 37 ° C. Inkubieren es in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bis 1 Std. Setzen Sie die Abschnitte between zwei Glasplatten mit 2-mm-Distanzscheiben und nehmen Sie Bilder mit einem stereo Mikroskop gekoppelt mit einer Kamera bei 15-facher Vergrößerung.
      VORSICHT! Paraformaldehyd ist giftig.
4. Slide Einfrieren (1 ^st Option)
   1. Setzen Sie jede Folie in einer Kunststoff-Form (10 x 10 x 5 mm) mit Eindeckmittel für die Kryotomie (optimale Schnitttemperatur, OCT), halten Sie die Ausrichtung (der Ort, den Scheitel orientierte Seite des Abschnitts nach unten auf dem Boden der Form). Frieren Sie die Blöcke mit 2-Methyl Dämpfe unter Kühlung mit flüssigem Stickstoff 10 - 15 min. Schließlich lagern Sie das Gewebe bei -80 ° C.
5. Paraffinization ^(2. Option)
   1. Platzieren Sie jede Folie in Kassetten Einbetten (halten Sie die Ausrichtung, indem die Spitze orientierte Seite des Abschnitts nach unten auf dem Boden der Kassette) und dann in 4% PFA für 24 Stunden. Legen Sie es in einem Gewebe-Prozessor-Maschine über Nacht.
      1. Inkubieren in 70% igem Ethanol für 2 Stunden. Inkubieren es in ethan95% für 2 Stunden ol. Inkubieren es in Ethanol 100% für 3 Stunden. Inkubieren es in Xylol 4 Stunden. Inkubieren es in Paraffin (geschmolzenes bei 60 ° C in einem Ofen) für 5 Std. Schließlich machen Blöcke durch jedes Herz Dia in Paraffin eingebettet wird.

3. Masson-Goldner Trichromfärbung

1. Machen Sie Gewebeschnitte aus Paraffinblöcken mit einem manuellen Mikrotom (Dicke: 5 um) oder von Oktober Blöcke mit einem Kryostaten auf -18 ° C (Dicke: 7 & mgr; m).
2. Stain eine Folie aus jedem Herzteil für jede Ratte (3 bis 4 Querschnitte pro Folie) mit Masson-Goldner Trichrom - Färbung (siehe Anhang).
   HINWEIS: Starten Sie von diesem Schritt für die Paraffinschnitten.
   1. Schmelzen die Objektträger bei 60 ° C in einem Ofen. Unter einem Abzug Deparaffinisieren sie in Xylol zweimal für jeweils 10 min. Rehydrieren sie in 100% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol und destilliertem Wasser für 3 min pro.
      HINWEIS: Starten Sie von diesem Schritt für die Kryoschnittess.
   2. Fix sie in Bouin-Lösung über Nacht. Dann spülen Sie Leitungswasser für 10 in Laufen - 15 min. Spülen Sie sie in destilliertem Wasser. Inkubieren sie in Mayers Hämatoxylin für 3 min.
   3. Entfernen Sie die Folien und lassen Sie sie in destilliertem Wasser für 5 min. Dann brüten sie in Säure Fuchsin-Ponceau für 5 min. Spülen Sie sie in 1% Essigsäure für 1 min.
   4. Als nächstes für 1 min sie in Phosphomolybdänsäure Orange G inkubiert. Spülen Sie sie in 1% Essigsäure für 1 min, brüten sie in hellgrünen Farbstoff für 10 min, und spülen sie in 1% Essigsäure für 1 min.
   5. Dehydrieren sie in 70% Ethanol (30 sec), 95% Ethanol (30 sec) und 100% igem Ethanol (5 min). Geben Sie einen Tropfen eines harzigen Eindeckmedium auf den Gewebeschnitten, bedecken sie mit Deckgläsern, und lassen Sie sie trocknen.

4. Infarktgrößenanalyse

1. Erwerben Sie ein Bild von jeder Folie auf einem Stereomikroskop (15-facher Vergrößerung) gekoppelt mit einer Kamera. Fotografieren Sie ein Lineal mit der gleichen Einstellungs.
2. Verwenden der Bildanalyse-Software die Narbendicke in der Mitte des Infarkts, das Septum Dicke zu messen, den linken Ventrikel (LV) Hohlraumbereich, der Infarktbereich und dem Gewebe LV Bereich verwendet wird.
   1. Stellen Sie die Waage mit dem Lineal Bild (Abbildung 1A).
      1. Klicken Sie auf Messungen dann Set Umrechnungsfaktor wählen. Zeichnen Sie eine Linie auf der Kalibrierungs bar. Rechtsklick auf das Bild und klicken Sie auf End - Kalibrierung. Notieren Sie sich den Bar - Wert und dann auf OK klicken.
   2. Wählen Sie die LV aus dem gefärbten Herz Bild (Abbildung 1B). Verwenden Sie das Multiple - Segment - Tool. Wählen Sie den LV Punkt-für-Punkt, und dann einen Rechtsklick Kopieren / Einfügen überall.
   3. Messen Sie die Narbe und Septum Dicke mit dem einzigen Segment Messwerkzeug (1C ).
   4. Automatische Erkennung der LV Hohlraum, Infarkt und LV Bereiche der automatischen Bereich Messwerkzeug im RGB - Modus (Abbildung 1D) verwendet wird .
      1. Klicken Sie auf das Werkzeug. Aktivieren Sie nur Grenzen und Angrenzend im RGB - Modus. Schließlich, klicken Sie in den Bereich von Interesse, es zu erkennen. Falls erforderlich, Präzisionswerkzeuge.
3. Berechne die Infarktgröße als das Verhältnis der Infarktbereich zum Bereich LV.
4. Berechnen Sie den Erweiterungsindex wie folgt: [LV Hohlraumbereich / gesamte LV-Bereich] / [Infarktdicke / Septum Dicke], mit der gesamten LV-Bereich einschließlich der LV Hohlraum und LV Gewebebereiche.
5. Schließlich berechnen für jedes Herz ein "durchschnittlich" wie folgt: [durchschnittlich Erweiterungsindex aus den Infarkt Dias] * [Anzahl der Infarkt Dias / Gesamtzahl der Folien].

Ergebnisse

Sechs Wochen nach der LAD-Ligation, Herzen wurden von Lewis-Ratten geerntet. 2-mm-Gewebeschnitte wurden von der Spitze zur Basis erhalten. Eine TTC - Färbung Verfahren wurde ausgeführt , um den Infarktbereich sichtbar zu machen, die in weiß erscheint, und das gesunde Myokard, die in rot (Abbildung 2) erscheint. Je nach der Stelle der Ligation der LAD variiert der Infarktgröße. Für große MI wurden transmurale Infarkte von der Spitze zur Basis (2A) beobach...

Diskussion

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls

Fibrotische Gewebe genau in einem chronischen MI Rattenmodell bewertet werden analysiert unter Verwendung von systematischen Probenahme des geernteten Herz und Bild von Trichromie-gefärbten histologischen Schnitten von der Basis bis zur Spitze erhalten. Zwei Schritte sind besonders wichtig für ein erfolgreiches Protokoll-Implementierung. Erstens ermöglicht die Verwendung von KCl für Herz Ernten des Herzmuskels in einem entspannten ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Rattenherzmatrix aus Acryl 2 mm	72-5015	Harvard Appartus
Inspira fortschrittliches volumengesteuertes Beatmungsgerät	Harvard Apparat	557058
Katheter Insyte 14 G	BD	381267
O.C.T	. BDHA361603E	VWR
TTC	T8877-10G	Sigma Aldrich
Mayer Hämatoxylin	MHS32-1L	Sigma Aldrich
Acid Fuchsin CI 42685	F8129-50G	Sigma Aldrich
Ponceau Xylidin CI 16150	P2395-25G	Sigma Aldrich
Orange G CI 16230	O3756-100G	Sigma Aldrich
Hellgrün CI 42095	L5382-25G	Sigma Aldrich
KCl	P9333-500G	Sigma Aldrich
Xylol	10315083	HoneyWell
Ethanol absolut	10303990	HoneyWell
2-Methylbutan	M32631-1L	Sigma Aldrich
Stereogisches Mikroskop	SM2800	Nikon
Formaldehyd	99340	Reactolab
Einbettkassette	K113.1	Carl Roth
Bersoft Bildmesssoftware		Bersoft.com	Lizenzierte Software