Dieses Protokoll beschreibt die Induktion einer Ischämie-Reperfusion (IR) Modell auf Mausohrhaut mit Magnetspann. Mit Hilfe eines speziell angefertigten intravital Bildgebung Modell untersuchen wir in vivo Entzündungsreaktionen post-Reperfusion. Das Grundprinzip hinter der Entwicklung dieser Technik besteht darin, das Verständnis zu verlängern, wie Leukozyten Haut IR Verletzung reagieren.
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Methodenartikel
Induzierende Ischemia-Reperfusionsschaden in der Maus-Ohr-Haut für intravital Multiphotonenionisation Imaging von Immunantworten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Eine Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) tritt auf, wenn aufgrund der Obstruktion des Blutflusses (Ischämie) eine vorübergehende Hypoxie vorliegt, gefolgt von einer anschließenden Reoxygenierung des Gewebes (Reperfusion). In der Haut ist die Ischämie-Reperfusion (IR) der Hauptfaktor, der zur Pathophysiologie von Druckgeschwüren beiträgt. Während die Kaskade von Ereignissen, die zur Entzündungsreaktion führen, gut untersucht wurde, sind die räumlichen und zeitlichen Reaktionen der verschiedenen Untergruppen von Immunzellen auf eine IR-Verletzung nicht gut verstanden. Bestehende IR-Modelle, die die Klemmtechnik an der Hautflanke verwenden, sind hochinvasiv und ungeeignet für die Untersuchung von Immunreaktionen auf Verletzungen, während ähnliche nicht-invasive Magnetklemmstudien in der Hautflanke für intravitale Bildgebungsstudien nicht ideal sind. In diesem Protokoll beschreiben wir ein robustes Modell der nicht-invasiven IR, das auf der Ohrhaut von Mäusen entwickelt wurde, wobei wir die zelluläre Reaktion von Immunzellen nach der Reperfusion mittels Multiphotonen-Intravitalbildgebung (MP-IVM) in Echtzeit visualisieren wollen.
Einleitung
Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) tritt auf, wenn eine vorübergehende Hypoxie aufgrund der Behinderung des Blutflusses (Ischämie) durch eine nachfolgende Wiedersauerstoffversorgung der Gewebe (Reperfusion) gefolgt ist. In der Haut, Ischämie-Reperfusion (IR) gilt als einer der Faktoren für die Pathophysiologie von Dekubitus zu sein, wo längere Bettruhe langfristige Krankenhauspatienten zu Verletzungen prädisponiert. Bei diesen Patienten sowohl die Haut und die darunter liegenden Muskeln sind ständig Gewichtsdruck ausgesetzt über Bereiche der Knochenvorsprung ausgeübt wird, in lokalisierten Verletzungen führt , die, wenn sie unbehandelt, nekrotischen 1 werden kann.
Die Schäden in einer IRI beteiligt sind zweifach. Während der Ischämie führt die Okklusion von Blutgefäßen zu einem drastischen Abfall der Sauerstoffzufuhr zu den Geweben. Dies führt zu einer Abnahme von ATP und pH, die ATPasen involviert in den Zellstoffwechsel inaktiviert. Im Gegenzug Spike zellulären Kalziumspiegel und gestresst oder c beschädigtells Apoptose oder Nekrose 2. Die Freisetzung von intrazellulären Inhalte oder Schäden associated molecular patterns (DAMP), wie HMGB1, trägt zu der entzündlichen Reaktion 3. Die zweite Beleidigung tritt während der Reperfusion. Obwohl Sauerstoff und pH-Werte während der Reperfusion wiederhergestellt werden, führt dies zu der Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die auf die Oxidation von intrazellulären Lipiden führt, DNA und Proteinen. Folglich werden pro-inflammatorischen Mediatoren aktiviert, die aus setzt eine sekundäre Entzündungsreaktion, die die Rekrutierung von Immunzellen zur Entzündungsstelle 2 umfasst. Während die Kaskade biochemischer Ereignisse bis zu der Entzündungsreaktion führen gut beschrieben worden ist, sind die räumliche und zeitliche Regulierung der Immunzellaktivitäten nicht gut verstanden.
Hier beschreiben wir eine robuste IR-Modell auf Mausohrhaut mit einfachen Magnetspann. In Verbindung mit Multiintravital Bildgebung (MP-IVM), werden wirwurde ein Modell , um die in - vivo - Entzündungsreaktionen zu untersuchen , die auftreten , nach der Reperfusion stattfindet. Der Grund für die Entwicklung und Anwendung dieser Technik ist, um zu versuchen, zu verstehen, wie sowohl interstitielle und infiltrierenden Zellen IR in Echtzeit zu antworten.
Bestehenden Modellen von IR die Spanntechnik auf der Haut Flanke verwenden , sind sehr invasiv, da sie die chirurgische Implantation von Stahlplatten in der Haut Flanke erfordern, so dass sie weniger als ideal für immunologische Studien 4. Eine ähnliche nicht-invasive Spanntechnik ist in der Maushaut Flanke 5,6 beschrieben. Da jedoch der Einbau der intravitalAbbildungsKomponente in diesem Verfahren haben wir stattdessen die Ohrhaut als IR Stelle gezielt, da sie Bewegungen aufgrund von Atem umgeht und bietet Stabilität 7,8 während der Bildgebung. Außerdem Leukozytenuntergruppen, die das Interstitium umspannen identisch sind zwischen dem Ohrhaut und der Haut flankieren, obwohl dieZahlen und Proportionen können geringfügig 9 variieren. Somit stellt die Ohrhaut eine ideale Abbildungsstelle.
Darüber hinaus abgerufen die meisten Daten aus diesen IRI Modelle sind begrenzt auf makroskopische Auswertungen (Einstufung von Geschwüren) und mikroskopische Analysen von Endpunktentzündungsindikatoren 10. Unter Verwendung dieses Modells Echtzeit-Visualisierung der zellulären Antwort von Neutrophilen nach der Reperfusion in der Haut eines fluoreszierenden Reporter Maus aktiviert. Eine zuvor veröffentlichte intravital Ohr Abbildungsmodell 8 mit zusätzlichen Modifikationen verwendet (1, 2).
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Protokoll
Alle Experimente mit lebenden Tieren zu tun wurden in Übereinstimmung mit allen relevanten Tier Verwendung und Pflege Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.
1. Wahl des fluoreszierenden Reporter-Mäuse
- Verwenden 6- bis 12-Wochen alten LysM-eGFP 11 Mäuse (keine Präferenz entweder für Männer oder Frauen).
Anmerkung: Die Verwendung verschiedener zellspezifischen fluoreszierenden Reportermäusen ermöglicht die Visualisierung von verschiedenen Immunzellen in vivo. In diesem Stamm zirkulierenden Neutrophile (GFP Hallo - Zellen), können Monozyten (GFP lo Zellen) und Makrophagen dermal (GFP lo Zellen) zirkulierende visualisiert werden. Mit der Abbildungsparameter verwendet wird, nur die hellen Signale von GFP-positive Neutrophile erkannt.
Hinweis: Eine Liste von immunzellspezifischen fluoreszierenden Reportermausstämme geeignet für diese Art von Hautabbildungs Studie kann in Referenz 8 gefunden werden.
Hinweis: Es wird dringend empfohlen, dass Albino-Mäuse für die Bildgebung verwendet werden, wie pigmented Mäuse sind anfälliger für Lichtschäden. Dies liegt daran, dass die pigmentierte Ohrhaut zu laserinduzierten Sprenkelung (indikativ Gewebe Brennen) viel empfindlicher ist. Als Ergebnis neutrophilen Rekrutierung und Akkumulation kann sogar 8,12 während des stationären Zustands beobachtet werden. - Halten Sie die Mäuse in spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen mit 12-h-Hell-Dunkel-Zyklen.
2. Maus Anesthesia
- Anästhesieren die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin-Xylazin (8 & mgr; l g -1 Körpergewicht), bestehend aus einer Mischung von 15 mg ml -1 Ketamin und 1 mg ml -1 Xylazin in sterilem Wasser gelöst.
- Platzieren Sie die Maus auf einem Heizkissen auf seine Körpertemperatur auf 37 ° C während des gesamten Herstellungsverfahrens aufrechtzuerhalten. Achten Sie auf ausreichende Anästhesie durch ein Fehlen einer Zehe Prise Reflex zu beobachten.
Hinweis: Nach der ersten Stunde, anschließende Quartal Dosen von Narkose müssen subkutan eine zu verabreichended wird jeder für etwa 0,5 Stunden dauern. Das Zucken der Whisker oder der Schwanz kann auch bedeuten, dass die Betäubung ausgeschaltet trägt und dass ein Top-up ist nicht erforderlich. - Verwenden Sie ophthalmische Schmiermittel auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
3. Depilation
- Anwendung sorgfältig Enthaarungscreme auf die oberen zwei Drittel des Ohres dorsalen Maus mit Baumwolle-Spitze Applikatoren.
- Warten Sie 2 - 3 Minuten vor der Sahne nassen Baumwollspitze Applikatoren in einer gründlichen, aber schonend zu entfernen.
Hinweis: Nicht Enthaarungscreme erlauben zu lange auf der Maus Ohr zu bleiben, da es 13,14 Entzündung auslösen können.
4. Induktion von Ischämie und Reperfusion Injury
- Verwenden vergoldet, N42-Grade-Neodym-Magneten, 12 mm Durchmesser x 2 mm dick und mit einem Gauß-Rating von etwa 3000 Ischämie im Mausohr Haut zu induzieren.
Anmerkung: In diesem Fall wird die genoppte Fläche der Magneten DeNOtes sein Nordpol. - Slot die Magnete in ihre einzelnen Kunststoffführungen.
Hinweis: Die Kunststoff-Führung die Platzierung und die Trennung der hochfesten Magneten zu erleichtern dient. Aufgrund ihrer starken Magnetkraft noch geringe Bruchfestigkeit, außerdem nicht mit Einzelmagneten in enger Nähe zueinander oder zu anderen Metallen. Bruch und Splittern kann auftreten, wenn sie aufeinander zu ziehen. - Positionieren Sie den ersten (dorsale) Magneten , so dass nur der Rand ist in Kontakt mit dem zweiten (ventralen) Magneten (3a)
Hinweis: Dies verhindert, dass die Magnete aus schnappen zusammen, bevor sie richtig positioniert ist. - Positionieren Sie die beiden Magneten , so dass der ventralen Magnet liegt flach auf dem Ohr (Abbildung 3a).
Hinweis: Vor dem Ischämie induziert wird, gewährleisten, dass die Maus auf 37 ° C gehalten wird und daß eine ausreichende Anästhesie aufrechterhalten wird (siehe Schritt 2.2). - Einmal fertig, lassen Sie sorgfältig die Magnete zusammen kommen (3a ).
Anmerkung: Für Abbildungszwecke klemmen nur die Hälfte des Ohrs, so dass ein IR und nicht-IR-Bereich beobachtet werden kann. - Nach 1,5 h von Ischämie, entfernen Sie die Magnete durch die Magnete voneinander entfernt Verdrehen der Kunststoffführungen verwenden, so dass der Reperfusion stattfinden soll.
Hinweis: Es muss die Ohren von Falten, wenn die Magnete angeordnet sind, zu verhindern. Unvollständige Ischämie ist offensichtlich , wenn die makroskopisch sichtbaren großen Blutgefäße wieder perfuse sofort (dh Blut füllt die Gefäße sofort) , nachdem die Magnete entfernt werden. Obwohl Reperfusion nur transient tritt nicht unmittelbar nach dem Entfernen des Magneten ist Blutgefäßverschluss. Als solches ist es zwingend notwendig, die Maus Ohr für die Abbildung so schnell wie möglich vorzubereiten.
5. Die Injektion von Blutgefäß Markierungsmittel
- Unmittelbar nach dem Magnetentfernung, verabreichen intravenös (über retro-orbitale oder Schwanzveneninjektion) Evans - Blau (10 mg mL -1in PBS oder Kochsalzlösung; 1 & mgr; l g -1 Körpergewicht) oder ein anderes Blutgefäß Markierungsmittel der Wahl.
Hinweis: Vor der Injektion sicherzustellen, dass eine ausreichende Anästhesie noch, indem sanfte Zehen Einklemmen gehalten wird.
6. Platzierung des Ohres auf dem Imaging-Plattform
- Schneiden 2 Stück Abdeckband 1,5 cm lang und 1,8 cm in der Breite.
- Lassen Sie die Klebeseiten zusammenkleben, während etwa 1 mm von Klebstoff entlang ihrer Breite zu verlassen.
- Schneiden Sie das Abdeckband in zwei, in Längsrichtung, seine Platzierung innerhalb des Schlitzes am Ohr Plattform aufzunehmen.
- Einfügen dieses Abdeckband etwa auf halbem Weg durch den Schlitz, so dass die Klebeseite nach oben zeigt.
- Bewegen Sie die Maus auf dem Heizkissen, so dass das Ohr abgebildet werden soll, neben dem Kreppband-Streifen.
- Durch die Verwendung von zwei PBS-angefeuchteten Wattespitze Applikatoren, drücken Sie vorsichtig das Ohr gegen den Klebestreifen.
- Mit dem Streifen als Führer, bringen Sie die Mausohrdurch den Schlitz einstellen, während gleichzeitig die Maus näher an der Bühne.
- Um das Klebeband entfernen, fügen Sie zuerst einen Tropfen PBS die Haftung des Bandes zu reduzieren.
- Trennen Sie die Mausohr vom Abdeckband so schonend wie möglich einen feinen Pinsel.
- Glätten Sie das Ohr an Ohr Plattform vorsichtig mit einem feuchten Baumwollspitze Applikator über dem Ohr rollen.
- Geben Sie einen Tropfen PBS unter dem Deckglas (die in ihrer Position auf dem Deckglas Halter gehalten wird unter Verwendung von Fett; Abbildung 2) und sanft über das Ohr auf . Top mit mehr PBS, falls erforderlich.
Hinweis: Der Deck Halter erhöht die Stabilität während der Bildgebung. - Legen Sie die Sonde Rektaltemperatur und schließen Sie die Kabel an das Heizungssystem gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Hinweis: Stellen Sie die Temperatur des Körpers Heizkissen auf 37 ° C und das Ohr Bühnenplattform bis 35 ° C.
7. Multiphotonenionisation Mikroskop Setund Imaging-Parameter
Hinweis: Dieses Protokoll verwendet einen einzigen Strahl, Multi Mikroskop mit einem abstimmbaren (680 - 1.080 nm) Ti: Sa-Laser (3,3 W bei 800 nm, Pulslänge von 140 fs, 80 MHz Repetitionsrate) mit einem 20x Wasser Objektiv (NA = 1.0) für intravital Bildgebungsstudien.
- Öffnen Sie die Imaging-Software.
- Richten der Laser gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 950 nm.
Hinweis: GFP und Evans blau bei 950 nm gleichzeitig angeregt werden können. - Zur Vorschau, verwenden Sie die folgenden Einstellungen: 500 & mgr; m 2 Scanfeld, 505 x 505 Pixel Auflösung und eine Abtastfrequenz von 800 Hz in einer einzigen Zeile Scan. Klicken Sie auf "Vorschau".
- Schalten Sie den Dämpfer (Laser) Leistung. Stellen Sie sicher, dass alle wesentlichen Signale ohne Aussetzen des Abbildungsfeldes zu übermäßigen Mengen an Laserleistung aufgenommen, die Hitzeschäden hervorrufen kann.
Hinweis: Beginnen Sie mit einer niedrigen Dämpfungsglied Leistung und erhöhen, wenn der Signal dim. Als Neutrophilen fehlen wird aus dem Interstitium zu frühen Zeitpunkten nach der Reperfusion, können Makrophagen als Maß verwendet werden, um die minimale Leistung erforderlich, um zu bestimmen, wie der ehemalige Dimmer als Neutrophile sind.
Hinweis: Wenn dieser Schritt zum ersten Mal zu tun ist, passen Sie die Einstellungen in den nicht-ischämische Zone, wo intakte Gefäß Integrität erwartet wird, und wird die Einstellung der Dämpfungsleistung zu erleichtern. In nachfolgenden Experimenten, diese Einstellungen nicht viel geändert werden müssen, es sei denn die Laserleistung instabil ist. - Passen Sie die PMT-Einstellungen.
Hinweis: Prüfen Sie mit dem Hersteller für die maximale optimale Verstärkung Spannung für die PMT. Einstellen der PMT-Spannung über den empfohlenen Schwellwert wird in einem höheren Signal-zu-Rausch-Verhältnis führen. Die allgemeine Empfehlung ist die PMT-Verstärkung Spannung auf den empfohlenen Grenzwert zu setzen und die Dämpfung Leistung wie nötig zu erhöhen, sollte zu schwach das Signal sein. - Wählen Sie eine Abbildungsregion, die in unmittelbarer Nähe zuder Rand der Ischämie, gekennzeichnet durch massive Evans Blau Leckage.
- Sammeln GFP und Evans Blau-Signale mit 525/50 Bandpass (BP) und 655/40 BP-Filter sind. Für Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) Signale von Kollagenfasern in der Haut Fach, verwenden Sie ein 475/42 BP-Filter.
- Erstellen Sie einen Ordner, um die Bilder in einem Format zu speichern, die für die verfügbare Bildanalyse-Software kompatibel ist.
- Zum Erwerb, verwenden Sie die folgenden Einstellungen: 500 & mgr; m 2 Scanfeld, 505 x 505 Pixel Auflösung und eine Abtastfrequenz von 400 Hz in einer einzigen Zeile Scan.
- Ein 100 & mgr; m z-Stapel mit einer Schrittweite von 4 um kann wiederholt über die Zeit in 1 min Intervallen erfasst werden, Neutrophilen-Infiltration zu überwachen.
Hinweis: Vor allem für Leukozyten (zB Neutrophile) mit einer höheren Wanderungsgeschwindigkeit, ein Intervall , das länger als 1 min ist , kann in Schwierigkeiten bei der Zellverfolgungsanalyse führen. In diesem Fall kann der Benutzer entweder die Dicke der ac reduzierenwerb stapeln oder die Scan-Frequenz erhöhen.
Anmerkung: Während der erforderliche Akquisitionsstapel der ischämischen Zone kann kleiner als Folge der Kompression erscheinen (alternativ durch eine höhere SHG Intensitäts gekennzeichnet), führt anschließende Reperfusion in massiven Entzündung, die das Ohr verursacht, quellen. Signifikante Drifts in der Z-Richtung gerechnet. Als solches ist der Erwerb eines großen z-Stack notwendig, um die Drift zu berücksichtigen. - Während der gesamten Imaging, ganz oben auf der PBS und Wasser regelmäßig auf die Ohr feucht und die Objektivlinse in Wasser getaucht zu halten.
Hinweis: Ein typisches Experiment in der Regel für 2 dauert - h 4. Je nach Versuchsanordnung, und in Verbindung mit einer gut gesteuerten Anästhesie Regime ist die Dauer der bildgebenden Verlängerung möglich.
8. Terminieren des Experiment
- Euthanize die Maus durch Erstickung mit Kohlendioxid nach der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) Institution procedures.
Hinweis: einschläfern immer die Maus nach anerkannten Methoden bestimmt, wie von den Regeln der Institution, Vorschriften und Richtlinien. Wenn wiederholte Abbildung benötigt wird, halten Sie die Maus auf dem Heizkissen, bis die Betäubung nachlässt. Sobald die Maus genügend Bewusstsein wiedererlangt hat und mobil ist, kehren Sie mit der Maus in seinen Käfig.
9. Bildanalyse
Anmerkung: Die Daten von der Bildgebungsexperiment erzeugt wird, durch verschiedene Softwarepakete visualisiert werden.
- Öffnen Sie die Bildanalyse-Software.
- Surpass-Modus Under, importieren Sie die Datei (Open → wählen Sie eine beliebige Datei in den gewünschten Ordner → Klicken Sie auf "Öffnen").
- Bearbeiten Pseudofarben, wenn die Standardfarben gelten nicht (Edit → Displayeinstellungen → Unter der Registerkarte Kanal, wählen Sie die gewünschte Farbe aus der Farbpalette).
- Stellen Sie die Helligkeit, den Kontrast und Hintergrund (Bearbeiten → Anzeige Einstellung → Toggle Max und Min-Werte).
- Stellen Sie sicher, dass die Datei Dimensionen korrekt sind (Bearbeiten → Bildeigenschaften → Unter der Registerkarte Geometrie, überprüfen Sie die Voxelgröße. In diesem Protokoll X = 0,99, Y = 0,99, und Z = 4).
Hinweis: Man leite X und Y durch die Scanfeld Dimension durch die Pixelauflösung geteilt wird. Z ist die Dicke zwischen jeder Scheibe.
Hinweis: Die Ausgabe dieser Datensätze können als maximale Projektion Filme präsentiert werden.
Hinweis: Tracking - Analyse erforderlich ist , um vollständig die zellulären Aktivitäten und Interaktionen , um charakterisieren ihre Funktion in vivo zu verstehen. Detaillierte Anweisungen von Zellverfolgung der Punktfunktion in der Software kann in dem Protokoll in Referenz 15 zu finden.
Hinweis: Es gibt viele Möglichkeiten zur Quantifizierung von Leukozyten-Migration, deren Einzelheiten können 16 in dem Übersichtsartikel in Reference.
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Ergebnisse
Dieses Protokoll verwendet einen speziell angefertigten Ohrhaut Imaging - Plattform, wie in Abbildung 1 dargestellt. Einige Merkmale dieser Plattform sind speziell Bildgebung zu erleichtern konzipiert, während physiologische Einstellungen beibehalten. Platzieren des Ohres auf der beheizten Messing Plattform nicht hält nur das Ohr bei einer physiologischen Temperatur von 35 ° C, aber es Isolate auch das Ohr von unvermeidlichen Bewegungen durch Atmung. Die Zugabe eines Met...
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Diskussion
Bedeutung
IR ist eine der führenden Ursachen von Haut Dekubitus. Die frühen Stadien (I und II) von Dekubitus beschreiben den Zustand der menschlichen Haut (wie auf die zugrunde liegenden subkutanen Gewebe und Muskeln im Vergleich). Allerdings fehlt ein Verständnis für die immunologische Ätiologie noch. Hier präsentieren wir eine einfache und robuste IR-Modell auf Mausohrhaut, um diese Lücke zu schließen. Wir simulieren Ischämie mit der Maus Ohr zwischen zwei Magneten Spann- und anschließend stu...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Wir danken Thomas Graf für die Bereitstellung der LysM-eGFP-Mäuse
.Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Mäusestämme | |||
| Lysozym-GFP C57BL/6 | Thomas Graf, Zentrum für genomische Regulation | ||
| C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | Mit Lysozym-GFP gekreuzt werden, um Albino-Lysozym-GFP für die Hautbildgebung |
| Reagents | |||
| PBS | |||
| Viaflex 0,9 % (wt/vol) Kochsalzlösung | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
| Ketamin (100 mg ml− 1 Ketaminhydrochlorid | Parnell | Ketamin ist eine kontrollierte Droge und alle relevanten lokalen Vorschriften sollten befolgt werden | |
| Ilium Xylazil-20 (20 mg mL− 1 Xylazinhydrochlorid) | Troy Laboratories | Xylazil-20 ist ein kontrolliertes Medikament und alle relevanten lokalen Vorschriften sollten befolgt werden. | |
| Evans blau (10 mg mL− 1 in PBS oder Kochsalzlösung) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
| Ultrareines Wasser | |||
| Equipment | |||
| Insulinspritze mit Nadel | BD | 328838 | |
| Transferpipetten | Biologix Research Company | 30-0135 | |
| 3 M Papier-Kreppband | 3M | 2214 | |
| Deckglaser Mikroskop-Deckglas (22 mm & 32 mm) | Paul Marienfeld | 101112 | |
| Gebogene Splitterzange | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
| Veet Haarentfernungscreme | Reckitt Benckiser | ||
| Medical Applikatoren mit Wattespitze | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| C-Falzette | Handtücher Kimberly-Clark | 20311 | |
| Kimwipes zarte Arbeitstücher | Kimtech Science | 34155 | |
| Vergoldete Neodym-Magnete der Güteklasse N42, 12 mm Durchmesser und 2 mm Dicke | first4magnets | F656S | |
| Kunststoffführung, 10 cm x 1,5 cm (Polyvinylchlorid-Material) | längs in der Mitte falten, mit Kreppband binden und Magnet in | ||
| Hochvakuumfett | Dow Corning | ||
| Mikroskop | |||
| TriM Scope II Einstrahl-Zwei-Photonen-Mikroskop | LaVision BioTec | ||
| Einstellbar (680– 1.080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:Saphir Laser (≥ 3,3 W bei 800 nm; Pulslänge von 140 fs, 80 MHz Wiederholrate) | Kohärente | ||
| Wassertauchobjektive (20&fach;, NA = 1,0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
| Miscroskop-Filter- und Spiegelsets (für die Abbildung von GFP, SHG, Evans Blue) | |||
| 495 Langpass-Chroma | T495LPXR | ||
| 560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
| 475/42 Bandpass | Semrock | FF01-475/42-25 | |
| 525/50 Bandpass | Chroma | ET525/50m | |
| 655/40 Bandpass | Chroma | NC028647 | |
| Skin-Imaging Bühnenplattform (siehe Montagediagramm) | |||
| A Grundplatte aus Metall (126 mm & mal 1 mm - 1 mm) | |||
| Eine Messingplattform für das Ohr (79 mm & 1 mm; 1 mm Dicke an der Seite, 0,5 mm Dicke in der Mitte; Abbildung 1 < / stark>) mit Schlitz (1,7 mm / mal 1 mm; 1,5 mm von der langen Kante entfernt)Zwei | |||
| Kunststoffblöcke (10 mm hoch) zur Wärmeisolierung | |||
| Gebogene Halterung zur Positionierung des Steuerthermistors auf der Ohrplattform | |||
| Schnittstellenkabel CC-28 mit DIN-Stecker und Thermistoren, einer für die Temperaturregelung und der andere für den Temperaturwächter | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | Verbinden Sie das Schnittstellenkabel mit beiden ohmschen Heizblöcken auf 35 & Grad; C |
| Resistive Heizblöcke RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | Resistive Heizblöcke können die Messingohrplattform auf über 100 & Grad erwärmen; C innerhalb von Minuten. Stellen Sie sicher, dass der Thermistor ordnungsgemäß in der Halterung befestigt ist, um eine Überhitzung zu vermeiden. |
| Temperaturregler TC-344B für die Ohrplattform | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
| Temperaturregler TR-200 für Maus-Heizkissen | Fine Science Tools | 21052-00 | Gerät steht nicht mehr zum Verkauf. Fragen Sie den Hersteller nach Alternativen |
| Netzteil für TR-200 | Fine Science Tools | 21051-00 | Das Gerät steht nicht mehr zum Verkauf. Fragen Sie den Hersteller nach Alternativen |
| Heizkissen | Fine Science Tools | 21060-00 | Unit steht nicht mehr zum Verkauf. Fragen Sie den Hersteller nach Alternativen. |
| Rektumsonde für Tiere | Fine Science Tools | 21060-01 | Gerät steht nicht mehr zum Verkauf. Fragen Sie den Hersteller nach Alternativen. Nachdem Sie den Rektalfühler und das Heizkissen an den Temperaturregler TR-200 angeschlossen haben, stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C ein. C |
| Deckglashalter | |||
| >2 Kunststoffstäbe, 1 cm Durchmesser, 10 cm Länge | |||
| 1 Kunststoffadapter mit gebohrten Löchern zur Aufnahme von Stangen (siehe Diagramm) | |||
| 3 Kunststoff-Spannschrauben zum Halten von | |||
| Kunststoffstäben1 Metallplatte, 6 cm x 2,5 cm, mit einem quadratischen Schnitt von 2 cm an 1 Ende, 2 mm Rand von der kurzen Kante | |||
| 1 Paar Mutter und Schraube zum Befestigen von Metallplatten an Kunststoffstangen | |||
| 1 Acrylsockel (4 cm x 5 cm x 1,5 cm) mit Magnet zum Halten des Deckglashalters auf der Hautbildbühne. 1 Stab wird dauerhaft auf dem Sockel befestigt. | |||
| Imaging Analysis Software | |||
| Imaris v8.1.2 | Bitplane | ||
Referenzen
- Black, J., et al. National Pressure Ulcer Advisory Panel's updated pressure ulcer staging system. Adv Skin Wound Care. 20, 269-274 (2007).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).
- Huebener, P., et al. The HMGB1/RAGE axis triggers neutrophil-mediated injury amplification following necrosis. J Clin Invest. 125, 539-550 (2015).
- Wassermann, E., et al. A chronic pressure ulcer model in the nude mouse. Wound Repair Regen. 17, 480-484 (2009).
- Stadler, I., Zhang, R. Y., Oskoui, P., Whittaker, M. S., Lanzafame, R. J. Development of a simple, noninvasive, clinically relevant model of pressure ulcers in the mouse. J Invest Surg. 17, 221-227 (2004).
- Tsuji, S., Ichioka, S., Sekiya, N., Nakatsuka, T. Analysis of ischemia-reperfusion injury in a microcirculatory model of pressure ulcers. Wound Repair Regen. 13, 209-215 (2005).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J Invest Dermatol. 131, 2058-2068 (2011).
- Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nat Protoc. 7, 221-234 (2012).
- Tong, P. L., et al. The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy. J Invest Dermatol. 135, 84-93 (2015).
- Saito, Y., et al. The loss of MCP-1 attenuates cutaneous ischemia-reperfusion injury in a mouse model of pressure ulcer. J Invest Dermatol. 128, 1838-1851 (2008).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Roediger, B., Ng, L. G., Smith, A. L., Fazekasde de St Groth, B., Weninger, W. Visualizing dendritic cell migration within the skin. Histochem Cell Biol. 130, 1131-1146 (2008).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci Rep. 3, 1913(2013).
- Ng, L. G., et al. Migratory dermal dendritic cells act as rapid sensors of protozoan parasites. PLoS Pathog. 4, e1000222(2008).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. , e51805(2014).
- Beltman, J. B., Maree, A. F., de Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nat Rev Immunol. 9, 789-798 (2009).
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Nachdrucke und Genehmigungen
