Methodenartikel

Peptid abgeleitete Methode zu schleusen Gene und Proteine ​​über zelluläre und Organell-Barrieren in Pflanzen

DOI:

10.3791/54972

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16. Dezember 2016

 ,  , 
1Enzyme Research Team, RIKEN Center for Sustainable Resource Science

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Bestehende Methoden zur Modifikation von Pflanzen sind nur begrenzt anwendbar. Die hier vorgeschlagene neuartige Peptid-abgeleitete Technologie verspricht sowohl Einfachheit als auch Effizienz bei der Einführung von exogenen Proteinen oder Genen in die gewünschten intrazellulären Kompartimente intakter Pflanzen.

Zusammenfassung

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Die Fähigkeit, exogene Proteine einzuführen und spezifische Gene in Pflanzen zu exprimieren (oder herunterzuregulieren), bietet ein mächtiges Werkzeug für die Grundlagenforschung sowie für neue Anwendungen im Bereich der Pflanzenbiotechnologie. Praktikable Methoden, die es derzeit für den Protein- oder Gentransfer in Pflanzenzellen gibt, nämlich Agrobacterium und Mikroprojektilbeschuss, haben Nachteile wie eine geringe Transformationsfrequenz, eine begrenzte Wirtsreichweite oder hohe Kosten für Geräte und Microcarrier. Das folgende Protokoll skizziert eine einfache und vielseitige Methode, bei der rational gestaltete Peptide als Verabreichungsmittel für eine Vielzahl von Nukleinsäure- und Protein-basierten Ladungen in Pflanzen verwendet werden. Peptide werden aufgrund ihrer biologischen Abbaubarkeit, ihrer reduzierten Größe, ihrer vielfältigen und einstellbaren Eigenschaften sowie ihrer Fähigkeit, intrazellulären/organellären Zugang zu erhalten, als Werkzeuge für die Entwicklung des Systems ausgewählt. Die Herstellung, Charakterisierung und Anwendung optimierter Formulierungen für jede Art der breiten Palette der gelieferten Ladungen (Plasmid-DNA, doppelsträngige DNA oder RNA und Protein) werden beschrieben. Kritische Schritte innerhalb des Protokolls, mögliche Modifikationen und bestehende Einschränkungen der Methode werden ebenfalls diskutiert.

Einleitung

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Pflanzengentechnik wird konventionell verwendet, um nützliche Eigenschaften auf Pflanzen zu übertragen. In den letzten Jahren wurde diese Technologie eingesetzt, um Pflanzen in Biofabriken umzuwandeln, um pharmazeutisch wichtige und kommerziell wertvolle Proteine herzustellen, von denen viele nicht chemisch synthetisiert werden können und die Herstellung mit tierischen oder mikrobiellen Systemen sehr kostspielig ist1. Durch die Einführung neuer Gene kann der pflanzeneigene Stoffwechsel für die Produktion verschiedener Biopharmazeutika wie Antikörper, Stoffwechselenzyme, Hormone, Antigene oder Impfstoff2 manipuliert werden.

Etablierte Gentransfertechnologien für Pflanzen sind die Agrobacterium-vermittelte Verabreichung3, das Bombardement mit DNA-beschichteten Mikroprojektilen (Biolistika)4 und die Elektroporation5 oder Polyethylenglykol6 Behandlung von Protoplasten. Techniken, die Protoplasten erfordern, werden im Allgemeinen vermieden, da sie zeitaufwändig und umständlich sind und zu inkonsistenten Ergebnissen führen7. Infolgedessen werden derzeit bei praktisch allen Pflanzenmodifikationsarbeiten entweder Agrobacterium oder Mikroprojektile für den Gentransfer verwendet. Die Agrobacterium-Methode wird häufiger verwendet, ist aber auf viele wirtschaftlich wichtige Pflanzenarten nicht anwendbar. In der Zwischenzeit ist der Beschuss von Mikroprojektilen aufgrund eines breiten Spektrums anfälliger Pflanzen vielseitiger, erfordert jedoch spezielle Ausrüstung und verursacht oft schwere Gewebeschäden. Darüber hinaus beinhalten diese Methoden entweder einen zufälligen (Biolistik) oder einen komplexen (Agrobacterium) Verabreichungsmechanismus und weisen variable Transformationsratenauf 8. Daher ist eine neuartige Pflanzentransformationstechnologie erforderlich, die einfach, aber effektiv ist und auf verschiedene Pflanzentypen anwendbar ist.

Derzeit werden Pflanzen in erster Linie durch die Abgabe von exogener DNA, die für ein gewünschtes Merkmal kodiert, einer genetischen Veränderung unterzogen, anstatt durch die direkte Abgabe eines Zielproteins. Die höhere Stabilität der DNA gegenüber Proteinen ist ein wesentlicher Vorteil; Zu den potenziellen Problemen im Zusammenhang mit der DNA-Übertragung gehören jedoch die zufällige Insertion exogener DNA in das Pflanzengenom und die unbeabsichtigte Übertragung von Antibiotikaresistenzgenen auf pathogene Bakterien über horizontalen Gentransfer9. Für Genom-Editing-Zwecke kann die Möglichkeit, Pflanzengenome zu bearbeiten, ohne fremde DNA in Zellen einzubringen, regulatorische Bedenken im Zusammenhang mit gentechnisch veränderten Pflanzen umgehen. Eine alternative DNA-freie Strategie für die Modifikation von Pflanzen durch direkte Verabreichung von Proteinen wird daher in der Lage sein, diesen Bedürfnissen gerecht zu werden.

Hier stellen wir ein peptidbasiertes System vor, das ursprünglich für die menschliche Gentherapie10-14 entwickelt wurde, für die gezielte Abgabe von exogenen Genen oder Proteinen in intakten Pflanzen. Peptide sind in der Lage, die DNA vor dem Abbau von Nukleasen zu schützen und können den Gentransfer über Zell- und Organellenmembranen vermitteln15-17. Sie haben auch vielfältige und einstellbare Eigenschaften, abgesehen davon, dass sie nicht zytotoxischsind 18-20. Noch wichtiger ist, dass Gene mit Hilfe von Peptiden präzise auf intrazelluläre Organellen wie die Mitochondrien21 oder Plastiden (Chloroplasten)22 zur Expression ausgerichtet werden können - eine Aufgabe, die durch biolistische oder Agrobacterium-vermittelte Transformation nicht erreicht werden kann. Abhängig von der Art der Ladung kann diese neue Pflanzenmodifikationstechnologie genutzt werden, um Proteine23 zu transportieren und entweder spezifische Gene innerhalb der Pflanze, in ihrem zytosolischen Raum24-26 oder innerhalb eines spezifischen Organellenkompartiments21 zu exprimieren (Plasmid21, 24 oder doppelsträngige RNA25) oder herunterzuregulieren (doppelsträngige RNA 26). Die entworfenen Trägerpeptide bestehen aus einer kationischen Domäne in Form von entweder Polylysin (K8) oder Polylysin-Co-Histidin (KH)9 zur Bindung und/oder Kondensation von negativ geladenen Ladungen, die an zellpenetrierende (BP100-Peptid) oder Mitochondrien-Transitsequenzen (Cytcox-Peptid) konjugiert ist.

Protokoll

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1. Herstellung von Peptidbasierte Formulierungen

  1. Vorbereitung Stammlösungen von jedem Peptid , wie folgt: (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml oder 800 nM), Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml), BP100 (1 mg / ml) und (BP100) 2 K 8 (70 & mgr; M). Wiegen Sie die erforderliche Menge eines jeden Peptids in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen eingewogen und autoklavierten Reinstwasser, um das Peptid aufzulösen. Gut mischen durch wiederholtes Pipettieren, bis eine klare Lösung erhalten wird.
  2. Amplifizieren, und die Plasmid-DNA (pDNA), doppelsträngige DNA (dsDNA) und doppelsträngige RNA (dsRNA) nach Standardmethoden Molekular reinigen. In 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, Stammlösungen mit einer Konzentration von 1 mg / ml (pDNA und dsDNA) oder 400 nM (dsRNA) zu machen.
  3. Bereiten Sie die Protein - Stammlösung mit einer Konzentration von 7 uM, die durch Lösen von 1 mg des Proteins (z. B., Alkohol - Dehydrogenase, ADH) Pulver in 1 ml Natriumcarbonat - Lösung (0,1 M, pH 9). Beschriften Sie das Protein mit fluorescent Sonden wie Rhodamin B (RhB) Standardprotokollen nach mikroskopische Visualisierung der in die Zellen geliefert Protein zu ermöglichen.
  4. Kombinieren der jeweiligen Komponenten in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    1. Für Peptid-pDNA Formulierungen in das Zytoplasma Targeting, fügen 6,4 ul (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) zu 20 ul pDNA (1 mg / ml) und gut mischen durch Pipettieren. Lassen Sie die Mischung bei 25 ° C für 15 Minuten zu stabilisieren. Hinzufügen 773,6 ul autoklaviert Reinstwasser die Lösung auf ein Endvolumen von 800 & mgr; l zu verdünnen. Verwenden Sie das pDNA Konstrukt , das für Kernexpression (P35S-RLuc-tnos, Tabelle 1).
    2. Für Peptid-pDNA Formulierungen die Mitochondrien - Targeting, fügen 6,6 ul Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml) zu 20 ul pDNA (1 mg / ml) und gut mischen durch Pipettieren. Lassen Sie die Mischung bei 25 ° C für 15 Minuten zu stabilisieren und dann 2,4 ul BP100 (1 mg / ml) hinzufügen. Lassen Sie die Mischung für 15 min bei 25 zur Stabilisierung6; C für weitere 15 min. Hinzufügen 771 ul autoklaviertem Reinstwasser die Lösung auf ein Endvolumen von 800 & mgr; l zu verdünnen. Verwenden Sie die pDNA - Konstrukt für mitochondriale Expression entworfen (pDONR-cox2: Rluc, Tabelle 1).
    3. Für Peptid-dsDNA Formulierungen, fügen 5,1 ul (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) auf 8 ul dsDNA (1 mg / ml) und gut mischen durch Pipettieren. Lassen Sie die Mischung bei 25 ° C für 15 Minuten zu stabilisieren. Hinzufügen 786,9 ul autoklaviert Reinstwasser die Lösung auf ein Endvolumen von 800 & mgr; l zu verdünnen.
    4. Für Peptid-dsRNA Formulierungen, fügen Sie 50 ul (KH) 9 -BP100 (800 nM) zu 50 ul dsRNA (400 nM) und gut mischen durch Pipettieren. Lassen Sie die Mischung bei 25 ° C für 15 Minuten zu stabilisieren. Hinzufügen, 700 & mgr; l RNase-freiem Wasser, die Lösung auf ein Endvolumen von 800 & mgr; l zu verdünnen.
    5. Für Peptid-Protein - Formulierungen, fügen Sie 16 ul (BP100) 2 K 8 (70 & mgr; M) bis 16 & mgr; l von ADH (7 uM) und mischengut durch Pipettieren. Lassen Sie die Mischung bei 25 ° C für 15 Minuten zu stabilisieren. Hinzufügen 768 ul autoklaviertem Reinstwasser die Lösung auf ein Endvolumen von 800 & mgr; l zu verdünnen.
  5. Erlauben die Formulierungen für 15 min bei 25 ° C zu stabilisieren.

2. Charakterisierung von Peptid-basierte Formulierungen

  1. Bringen Sie jede Lösung (800 ul) in eine Küvette für dynamische Lichtstreuung (DLS) Analyse. Bestimmen den hydrodynamischen Durchmesser und Polydispersitätsindex von gebildeten Komplexe mit einem zeta Nanosizer, mit einem 633 nm He-Ne-Laser bei 25 ° C mit einem Backscatter-Erfassungswinkel von 173 °.
  2. Folgende Größenmessungen, übertragen jede Lösung (800 ul) in eine gefaltete Kapillarzelle zum Zeta-Potential-Messungen an Standardparameter der Dielektrizitätskonstante, Brechungsindex und der Viskosität von Wasser bei 25 ° C.
  3. Beobachten eines kleinen Volumens von komplexen Lösung für DLS-Analyse verwendet, durch Rasterkraftmikroskopie (AFM). Kaution 10 ul-Komplex-Lösung auf die frisch freigelegten gespaltenen Oberfläche eines Glimmerplättchen und lassen Sie die Glimmer trocken über Nacht in einer bedeckten Petrischale aus Kunststoff an der Luft.
  4. Erwerben Sie ein Bild der Komplexe in Luft bei 25 ° C , um einen Silizium - Cantilever mit mit einer Federkonstante von 1,3 N / m in Tapping - Modus 27,28.

3. Einschleusung von Pflanzenblätter

  1. Verwenden Sie 3 Wochen alten Boden gewachsenen Pflanzen (Arabidopsis thaliana 24, Nicotiana benthamiana 24 oder Pappel 26). Transfizieren mindestens 3 Blätter als dreifacher Ausführung für die Quantifizierung von Genexpression oder Proteinabgabe zu dienen.
  2. Laden einer 1 ml Kunststoffspritze nadel mit 100 ul komplexe Lösung für die Transfektion eines Blattes. Positionieren Sie die Spitze der Spritze auf der abaxial Oberfläche des Blattes.
  3. Drücken Sie die Spritzenspitze gegen das Blatt leicht und drücken Sie den Spritzenkolben langsam, während ein Gegendruck mit dem i ausübtndex Finger eines Latex-Handschuh von der gegenüberliegenden Seite. Erfolgreiche Infiltration kann als die Ausbreitung eines mit Wasser getränkten Bereich in dem Blatt zu beobachten. Beschriften Sie die infiltrierten Blätter zur leichteren Identifizierung.
  4. Inkubieren der transfizierten Blatt für optimierte Dauern folgende Infiltration mit Peptid-pDNA (12 h), Peptid-dsDNA (12 h), Peptid-dsRNA (9-48 h) und Peptid-Protein (6 h) Formulierungen unter den folgenden Bedingungen: 16 Stunden Licht / 8 Stunden Dunkelheit bei 22 ° C für A. thaliana und Pappel oder 24 - Stunden - Dauerlicht bei 29 ° C für N. benthamiana.

4. Beurteilung der Transfektionseffizienz

  1. Excise die ganze transfizierten Blatt von kleineren Anlagen (z. B. A. thaliana) oder eine 1 cm 2 Abschnitt des infiltrierten Bereich für größere Anlagen (z. B. N. benthamiana).
  2. Für Experimente Transfektion Renilla - Luciferase (Rluc) Reportervektor verwendet, bestimmen die transfection Effizienz ein Rluc Assay Kit quantitativ verwenden.
    1. Legen Sie jedes Blatt herausgeschnitten oder Blattabschnitt in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. 100 l 1 × Rluc Assay Lysepuffer pro Röhrchen. Auf die gleiche Weise, bereiten Lysaten von nicht transfizierten Kontrollblätter (dreifach).
    2. Grind das Blatt eine Homogenisierung zerstoßen und Inkubation des resultierenden Lysat bei 25 ° C für 6 bis 10 Stunden.
    3. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 12.470 × g in einer Mikro für 1 min. Transfer 20 & mgr; l des geklärten Lysat auf eine Vertiefung in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, und verwenden die verbleibende Volumen für die Quantifizierung der Gesamtproteinkonzentration eines BCA Protein Assay Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
    4. 100 l 1 × Rluc Assay Substrat (verdünnt, um die Rluc Testpuffer verwendet wird) in den Brunnen und mischen durch langsame Pipettieren. Legen Sie die Mikrotiterplatte in einem Multimode-Mikroplatten-Reader und initiieren Messung.
    5. Ziehen Sie den Hintergrund Lumineszenz (Mittelwert der keinn-transfizierten dreifacher Ausfertigung) von jeder Lumineszenz der Versuchsprobe. Berechnen des Verhältnisses von Photolumineszenz (relative light units, RLU) zu der Menge an Protein (mg).
  3. Für Transfektionsexperimente grün fluoreszierende Protein (GFP) Reportervektor mit oder fluoreszenzmarkierten Protein (z. B. ADH-RhB), beobachten die Fluoreszenz eines konfokalen Laser - Scanning - Mikroskop.
    1. Schneiden Sie die Ränder eines ganzen Blattes (die Entfernung von Lufträumen zu unterstützen), während eine geschnittene Blatt kann verwendet werden, wie es ist. Entfernen Sie den Kolben aus einer 10-ml-Spritze und legen jeweils herausgeschnitten Blatt oder Blattabschnitt in der Spritze.
    2. Setzen Sie den Kolben und drücken Sie sie sanft auf den Boden der Spritze ohne das Blatt zerdrücken. Zeichnen Sie Wasser in die Spritze, bis es etwa die Hälfte gefüllt ist.
    3. Richten Sie die Spritze nach oben und drücken in der Kolben Luft aus der Spritze durch die Spitze zu entfernen. Decken Sie die Spitze der Spritze und ziehen Sie den Kolben langsam nach unten Luft aus dem lea zu vertreibenf. Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals, bis das Blatt durchscheinend erscheint.
    4. Bedecken die Oberfläche eines Objektträgers mit einem Klebeband. Schneiden Sie eine quadratische Fläche auf dem Band groß genug, um die Blattprobe unter Verwendung einer Klinge aufzunehmen, und ziehen Sie das Quadrat Stück Klebeband mit einer Pinzette aus einer Probenkammer zu schaffen. Das Band wird als Abstandshalter zwischen dem Schieber und Deckglas dienen.
    5. Legen Sie das Blatt in der Kammer mit dem abaxial Oberfläche nach oben zeigt und füllen die verbleibende Kammerbereich mit Wasser. Dichten Sie das Blatt in der Kammer mit einem Deckglas und sichern Sie die Kanten des Deckglases mit Klebeband.
    6. Überprüfen Sie die Blattprobe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop unter einem 40X-Objektiv oder ein 63X Wasserimmersionsobjektiv verwendet wird. GFP oder RhB Fluoreszenz kann bei Anregungswellenlängen von 488 nm bzw. 555 nm bzw. sichtbar gemacht werden.

Ergebnisse

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Ein Array von Nukleinsäure und Protein Ladungen wurden erfolgreich in verschiedene Pflanzen eingebracht, die entworfen Peptide als Zuführungsvektoren verwendet wird. Elektrostatische Wechselwirkungen zwischen kationischen Peptiden und negativ geladenen Ladungen führte zur Bildung von Transfektionskomplexen , die direkt in die Pflanzen infiltriert werden können Blätter eine nadellose Spritze (Abbildung 1). Optimierte Formulierungen (empirisch in diesen Studien bestimmt 21,23-26) für die Transfektion von Pflanzenzellen sind in Tabelle 1 aufgeführt, wobei jeder Typ der Vielzahl von gelieferten Ladungen (pDNA, dsDNA, dsRNA und Protein) dargestellt wird. Die mittleren Durchmesser aller peptidbasierten Formulierungen wurden in ungefähren Bereich von 150 bis 300 nm. Basierend auf DLS-Analyse zeigten alle Formulierungen relativ geringe Größe Polydispersitäten, was darauf hinweist, dass die gebildeten Peptid-Fracht-Aggregate eine einheitliche Größenverteilung aufweisen. Die MorphologienKomplexe zwischen Peptid und pDNA (2A) oder Protein (2B), auf Glimmer wurden durch AFM abgebildet. Homogene globuläre Komplexe wurden mit den Daten von DLS-Messungen für beide Peptid-pDNA und Peptid-Protein-Kombinationen in Übereinstimmung beobachtet. In Bezug auf das Zetapotential von Komplexen (Tabelle 1), pDNA- und dsDNA abgeleitete Komplexe hatten negative Nettooberflächenladungen während dsRNA-basierte Komplexe eine nahezu neutrale Oberflächenladung hatte. Peptid-Protein-Komplexe, auf der anderen Seite, wurden positiv geladen.

Die Wirkungsgrade von Peptid-pDNA und Peptid-dsDNA Formulierungen in der Transfektion von A. thaliana oder N. benthamiana als Modellpflanze Systeme Vermittlung wurden als qualitativ quantitativ als auch bewertet. Rluc Genexpression Assay für die Quantifizierung von Genexpressionsniveaus (Tabelle 1), daher für dieses Experiment verwendet wurde , oder pDNAdsDNA Rluc-Gen kodiert, müssen zur Komplexierung mit den jeweiligen Träger Peptide verwendet werden. Mit dem (KH) 9 -BP100 / pDNA Formulierung kann nuklear gezielte Abgabe und Expression von pDNA erreicht werden, nach einer Inkubationszeit von 12 Stunden mit einem geschätzten RLU / mg - Wert von etwa 1 × 10 5. Für mitochondriale-zielgerichtete Abgabe und Expression von pDNA, eine Kombination von Peptiden, Cytcox- (KH) 9 und BP100, wird für die Komplexbildung erforderlich ist . Mit der gleichen optimierten Inkubationszeit von 12 Stunden jedoch eine viel niedrigere Niveau der Transfektion (etwa 1 × 10 3 RLU / mg) wurde erreicht. Inzwischen ähnliche Inkubationszeit (12 h) und Gen - Expressionsniveau (etwa 1 × 10 3 RLU / mg) wurde erforderlich / aufgezeichnet für dsDNA-Komplexen, auch die (KH) 9 -BP100 Peptid formuliert werden. Qualitative Bewertung der Genexpression wurden durch direkte mikroskopische Beobachtung der Blätter mit Komplexe prepar behandelt durchgeführted mit pDNA oder dsDNA kodiert, das GFP-Reporter-Gen. In Zellen , die mit Nicht-Zielpeptid-pDNA - Komplexen transfiziert, diffundieren grüne Fluoreszenz mit entsprechenden GFP - Expression deutlich beobachtet wurde und die in das Cytosol (3A) zu lokalisieren. Deutliche Unterschiede in der Lokalisation Muster der GFP-Fluoreszenz waren in Zellen offensichtlich mitochondrialen gezielte Peptid-pDNA Komplexe infiltriert mit. Hier punctate grüne Fluoreszenz , die mit der mitochondrialen stain colokalisieren sichtbar war, was die Spezifität der Genexpression ausschließlich in der mitochondrialen Kompartiment von Zellen (3B) bestätigt.

Im Fall von Peptid-Protein-Formulierungen, Konjugation des Proteins Ladung (ADH) mit einem Fluorophor (RhB) wird die Visualisierung des gelieferten Protein im intrazellulären Kompartiment ermöglichen. Innerhalb einer kurzen Inkubationszeit von 6 Stunden, ADH-RhB Protein (blau) wurde festgestellt, überall verteilt werdendas Cytosol und Vakuole von infiltrierten Zellen (3C). unter Verwendung von Peptid-dsRNA Formulierungen Inzwischen konnte eine schnelle und effiziente Herunterregulation der Genexpression in verschiedenen Anlagen durchgeführt werden. Im ersten Experiment, A. thaliana Blatt wurde mit dem Peptid-dsRNA infiltriert Komplexe der Chalkon - Synthase - Gen (CHS) verantwortlich für Anthocyan (rotes Pigment) Biosynthese unter Dürrebedingungen zum Schweigen zu bringen. Der Unterschied im Auftreten von A. thaliana Blätter unter normalen (3D, a) und Trockenheit (3D, b) ein einfaches Mittel vorgesehen CHS zu bewerten Silencing die optimierte Peptid-dsRNA - Formulierung unter Verwendung von (Pfeil 1 zeigt die infiltriert region). In dem zweiten Experiment wurden Peptid-dsRNA - Komplexe wurden in den Blättern von transgenen A. thaliana infiltriert gelb fluoreszierendes Protein exprimieren (YFP). Eine scheinbare Reduktion der YFP-Expression konnte in den epidermalen Zellen 9 h p zu sehenOst-Transfektion (3E, F). Die Wirksamkeit der Formulierung in Herunterregulierung der Genexpression in einem anderen Anlagensystem (Pappel, 12 h nach der Transfektion) wurde ebenfalls nachgewiesen (Abbildung 3G, H).

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Abbildung 1: Peptid-basierte Formulierungen für die Lieferung von Nukleinsäure und Protein Cargoes in lebenden Pflanzen.
Die entworfenen Träger Peptide bestehen aus Polykationen zu Zelle eindringende oder organellären Transitsequenzen konjugiert. Polykationen ermöglichen Bindung und / oder Kondensation von negativ geladenen Ladungen sowie Flucht aus dem endosomalen Kompartiment in Zellen nach Verinnerlichung. Lieferung von Ladungen in die Zellen und anschließend auf spezifische Organellen wird durch Zelle eindringende Sequenzen und Organell-Transitsequenzen vermittelt sind. Verschiedene Ladungen, die successfu sein könntelly in die Anlage geliefert umfassen Nukleinsäuren wie pDNA, dsDNA und dsRNA sowie Modellproteine ​​wie Rinderserumalbumin (BSA), Alkoholdehydrogenase (ADH) und Citrin (eine Variante von gelb fluoreszierendes Protein). Bioaktive Moleküle können Transfektionskomplexe mit Peptidkonjugaten über elektrostatische Wechselwirkungen zu bilden, die in Pflanzen eingeführt werden Blätter mit einer Spritze Infiltration. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2: Morphologien der Peptid-basierte Formulierungen.
(A) AFM Amplitudenbild von (KH) 9 -BP100 / pDNA Formulierung bei N / P 0,5. (B) AFM Höhenbild von (BP100) 2 K 8 / ADH Formulierung bei Molaren Ratio 10. Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung aus veröffentlichten Quellen 23,24. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 3: Die mikroskopische Beurteilung von Transfektionseffizienzen Peptid-basierte Formulierungen unter Verwendung optimiert.
(A) Cytosolic GFP - Expression (grün), deutlich von Chloroplasten - Autofluoreszenz (rot), wurde in den Schwammparenchym Zellen von A. thaliana beobachtet Blätter infiltriert mit (KH) 9 -BP100 / pDNA Formulierung (N / P 0,5; 12 h ). (B) die GFP - Expression (grün) wurde in den Mitochondrien (rot) in den epidermalen Zellen von A. thaliana leaf infiltriert mit Cytcox- (KH) 9 / BP100 / pDNA Formulierung (N / P 0,5 für jede peptid detektierte; 12 h). Vergrößerte Bilder von Mitochondrien mit GFP-Expression sind im äußersten rechten Bereich angezeigt. (C) Lieferung von ADH-RhB (blau) in die Schwammparenchym Zellen von A. thaliana Blätter durch (BP100) 2 K 8 in einem Peptid / Protein - Molverhältnis von 10, visualisiert 6 Stunden nach der Infiltration vermittelt. (D) A. thaliana leaf vor (a) und nach (b) Behandlung mit (KH) 9 -BP100 / dsRNA - Formulierung (Molverhältnis 2; 48 h), die bei der Unterdrückung der Anthocyan - Biosynthesewegs geführt. Eine ähnliche Formulierung GFP5 dsRNA enthielt , wurde in das Blatt als negative Kontrolle (c) infiltriert. Pfeile 1 und 3 zeigen den infiltrierten Bereich, während Pfeile 2 und 4, um die nicht-infiltrierten Bereich innerhalb des Blattes an. (E) A. thaliana verlässt folgende Infiltration gelb fluoreszierendes Protein (YFP) und (F) , um die verminderte YFP - Fluoreszenz zum Ausdruck mit (KH) 9 -BP100 / dsRNA - Formulierung (Molverhältnis 2; 9 h). (G) Transgenic Pappel Blätter gelb fluoreszierendes Protein (YFP) und (H) die verminderte YFP - Fluoreszenz folgende Infiltration mit (KH) 9 -BP100 / dsRNA Formulierung exprimieren (Molverhältnis 2; 12 h). Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung aus veröffentlichten Quellen 21,23,24,26. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 4: Variation in Peptid-zu-DNA (N / P) Verhältnis und die Auswirkung auf die biophysikalischen Eigenschaften von Komplexen.
Mit zunehmender Peptid zu DNA-Verhältnis, Peptid-basierten Formulierungen Abnahme der Größe, während deren Zeta-Potentialwerte Übergang von negativ zu positiv./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Tabelle 1: Charakterisierung und Bewertung verschiedener Peptid-basierte Formulierungen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.

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Tabelle 2: Ein Vergleich von Peptid-basierten und anderen vorhandenen DNA - Delivery - Technologien für Intact Pflanzen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.

Diskussion

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Kritischen Schritte in dem Protokoll, die empirisch diskutiert wurden identifiziert. Durch die Spritze Infiltration, die Peptid-basierten Formulierungen werden in die Lufträume im Inneren der Pflanze Blatt durch die Spaltöffnungen eingeführt. Um eine maximale Aufnahme der Lösung zu gewährleisten, sollte der Infiltrationsverfahren durchgeführt werden , wenn die Pflanzen unter Bedingungen, die zur Öffnung der Stomata dh förderlich sind., Versehen mit ausreichend Wasser und während der Lichtperiode. Im Hinblick auf die Herstellung von Transfektionskomplexen für Formulierungen, die eine Kombination von zwei Peptiden (für mitochondrialen DNA-Zielliefer) umfassen, wobei die Reihenfolge für die Zugabe der einzelnen Komponenten ist entscheidend und nicht invertiert werden sollte.

Es gibt viele plausible Änderungen an dem Verfahren. Eine andere Möglichkeit für das Eindringen von Pflanzenzellen ist die Verwendung von Vakuuminfiltration, die die komplexe Lösung zu ganzen Pflanzen einzuführen ist in der Lage und / oder Teilgeweben, einschließlichApikalmeristemen. Für diese alternativen Verfahren werden Sämlinge in der Transfektionslösung eingetaucht, und basierend auf dem Druck, der durch das Vakuum erzeugt wird, die Peptid-Fracht Komplexe werden durch die Stomata und in die Pflanzenzellen (Yoshizumi, T., nicht veröffentlichte Daten) gezwungen.

Transient Genexpression, basierend auf Studien an tierischen Zellen wurde mit höheren DNA - Konzentrationen von 29 bis 31 zu erhöhen gezeigt. Es ist wichtig zu beachten , dass das Verhältnis von Peptid zu DNA , die die biophysikalischen Eigenschaften beeinflusst (Größe, Oberflächenladung) von Komplexen (Abbildung 4), die Transfektionseffizienz beeinflusst; Daher muss das optimale Verhältnis auch bei erhöhter DNA-Konzentration gehalten werden.

Einer der Hauptvorteile in Peptide als ein Gen / Protein-Zusteller ist, dass seine Sequenz zum Einstellen zugänglich ist, eine gewünschte Funktion zu erfüllen. Zum Beispiel beschrieb der mitochondrialen-Targeting-Domäne des Trägerpeptid in diesem Gestüty kann mit Chloroplasten oder Peroxisomen-Targeting-Sequenzen für die Lokalisierung zu dieser Organellen ersetzt werden. Während Chloroplast - Transformation in mehrere Anlagen möglich ist , unter Verwendung Biolistik 32-34 weder das Agrobacterium noch der biolistischen Methode könnte Gene in die Mitochondrien oder anderen Organellen neben dem Kern (Tabelle 2) einzuführen.

Es sind keine starren Wirtsbereich Einschränkungen für Peptid-basierende Transfektion, im Gegensatz zu dem Agrobacterium basierende Verfahren (Tabelle 2). Bisher Formulierungen für die Transfektion von A. thaliana, N. benthamiana und Pappel optimiert wurden (Tabelle 1), aber das Verfahren kann auch für Nicotiana tabacum verwendet werden, Tomatenzüchtung Micro-Tom, Reis (basierend auf Vorversuchen) und andere mono- und dikotyle Pflanzen.

Bisher gibt es keine bekannte Beschränkung in Transgen Größe, wenn Peptide ein verwendet werdens Transfektionsvektoren. Im Gegensatz dazu wurden große DNA - Moleküle wurden für die Transgene von etwa 200 kb wurde 37-39 berichtet die Transformationseffizienz von Agrobacterium -vermittelte Methoden 35,36 und eine obere Größenbegrenzung zu reduzieren gefunden. Verwendung von Biolistik, andererseits, große DNA - Fragmente können 38 während der Herstellung oder Lieferung in Pflanzen geschert werden. Obwohl keine obere Grenze hat für biolistische Transformation bisher physikalische Zwänge wurden , um die Größe der DNA zu beschränken gefunden , die übertragen werden kann , um viel weniger als 150 kb 40 bestimmt. Die Hauptvorteile der Verwendung des Peptid-basierten System für den Gentransfer im Vergleich zu bestehenden Ansätze entweder Agrobacterium oder Mikroprojektilbeschuss verwendet wird , oben erläutert, sind in Tabelle 2 zusammengefasst.

Einige Einschränkungen gibt es für dieses Verfahren, wie es steht. Erstens gezielte Abgabe von pDNA auf spezifische Organellen, wie dem mitochondria, wurde durch eine einfache Kombination von DNA-bindenden, zellpenetrierenden und Organell-Transitsequenzen möglich erwiesen, obwohl der Wirkungsgrad niedrig war. Transgen-Expression konnte festgestellt werden, durch konfokale Mikroskopie, nur in einer kleinen Population von Mitochondrien in den Zellen. Daher sind weitere Modifikationen notwendig: (i) Förderung der Translokation von mehr Komplexe durch die Zelle / Organell-Membran, und (ii) zur Expression der Dissoziation und die Übertragung von pDNA aus dem Trägerpeptid in das Ziel Organell verbessern. Zweitens wurde die transiente Expression von exogener Reportergene unter Verwendung dieses DNA-Abgabesystem, erfolgreich in den zytosolischen und mitochondrialen Kompartiment von Zellen erreicht. Stabile Inkorporation und die Expression der eingeführten Gene in der Pflanze Kern / Organell-Genoms noch nicht jedoch festgestellt worden ist, aufgrund des Fehlens von geeigneten Selektionsstrategien.

Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass es Bereiche für Verbesserungen oder weitere development, das Peptid abgeleitete Strategie beschrieben hier bleibt eine einfache und vielseitige Technik, die den Weg für die Lieferung verschiedener Ladungen in verschiedene Pflanzenarten geebnet hat.

Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

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Die Autoren möchten die Finanzierung anzuerkennen aus Japan Science and Technology Agency Exploratory Research für Advanced Technology (JST-ERATO), die Neue Energie und Industrial Technology Development Organization (NEDO) und Cross-Minister Strategic Innovation Promotion Program (SIP), Japan .

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
(KH)9-BP100Peptid Kundenspezifisch synthetisiert vom RIKEN Brain Science InstituteN/ASequenz: KHKHKHKHKHKHKHKH-
KHKKLFKKILKYL
(BP100)2-K8 PeptidKundenspezifisch synthetisiert vom RIKEN Brain ScienceInstitute N/ASequenz: KKLFKKILKYLKKLFKKIL-
KYLKKKKKKKK
BP100 PeptidKundenspezifisch synthetisiert vom RIKEN Brain Science InstituteN/ASequenz: KKLFKKILKYL
Cytcox-(KH)9Peptid Kundenspezifisch synthetisiert vom RIKEN Brain Science InstituteN/ASequenz: MLSLRQSIRFFKKHKHKH-
KHKHKHKHKHKH
P35S-GFP(S65T)-TNOS und P35S-RLuc-TNOSN/AN/AKodiert für grün fluoreszierendes Protein bzw. Renilla-Luciferase-Gene unter der Kontrolle des konstitutiven Promotors CaMV 35S (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10)
pDONR-cox2:gfp und pDONR-cox2:rlucN/AN/AKodiert für grün fluoreszierendes Protein bzw. Renilla-Luciferase-Gene unter der Kontrolle des mitochondrial-spezifischen Promotors cox2 (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751)
dsDNA (PCR-amplifiziert aus pBI221-P35S-Rluc-TNOS)N/AN/AKodiert für grün fluoreszierendes Protein bzw. Renilla-Luciferase-Gene unter der Kontrolle des konstitutiven Promotors CaMV 35S (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39)
GFP5 siRNAN/AN/AFür RNA-Interferenz-vermitteltes Silencing von grün fluoreszierendem Protein (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
CHS siRNAN/AN/AFür RNA-Interferenz-vermitteltes Silencing von Chalkonsynthase (Ref: Numata et al Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
1 ml und 10 ml KunststoffspritzenTERUMO CorporationSS-01T, SS-10ESZ
1,5 ml MikrozentrifugenröhrchenAS ONE Corporation151212
96-Well-Platte mit flachem BodenAsahi Glass Co., Ltd.3860-096
KlebebandSekisui Chemical Co., Ltd.Nr. 835
Alkohol-DehydrogenaseSigma-Aldrich Co., LLC.A-7011
RasterkraftmikroskopSeiko Instruments Inc.SPI3800, SPA 300HV
RasterkraftmikroskopHitachi High-Tech Science CorporationAFM5300E
BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific Inc.23227
Cantilever-MikroskopHitachi High-Tech Science CorporationK-A102001593
Konfokales Laser-Scanning-MikroskopCarl ZeissLSM700
KorkbohrerSigma-Aldrich Co., LLC.Z165220Für die Exzision von Blättern in Scheiben mit einem Durchmesser von 1 cm
DeckglasMatsunami Glass Ind., Ltd.C02261
KüvetteSarstedt759116
gefaltete KapillarzelleMalvern Instruments, Ltd.
ZangeShimizu Akira Inc.Rostfreie Pinzette 150
HomogenisierungsstößelIeda Trading Corp.9993
MicaNisshin EM Co., Ltd.LC23Z
MikrozentrifugeBeckman CoulterBKA46472
Microplate ReaderMolecular Devices CorporationSpectra MAX M3
Mikroskop ObjektträgerMatsunami Glass Ind., Ltd.
PipetteEppendorf Research® plus3120000909
PipettenspitzenAS ONE Corporation2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03
Petrischale aus KunststoffAS ONE Corporation1-7484-01
Renilla Luciferase Assay KitPromega CorporationE2810
Rhodamin B IsothiocyanatSigma-Aldrich Co., LLC.
RNase-freies WasserQiagen129112
NatriumcarbonatWako Pure Chemical Industries, Ltd.199-01585
Chirurgische Klinge und GriffFEATHER Safety Razor Co., Ltd.Edelstahl Nr. 14 (Klinge), Nr. 3L (Griff)
SpritzenspitzenkappeMusashi Engineering Inc.NC-3E
WaageSartoriusCPA225D
Zeta PotentiometerMalvern Instruments, Ltd.Zetasizer Nano-ZS
DTS1070S011120283924

Referenzen

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PeptidabgabeGentransportProteintransportPflanzentransformationSpritzeninfiltrationDynamische LichtstreuungMessung des Zeta PotenzialsRasterkraftmikroskopieKonfokalmikroskopieRenilla Luciferase Assay

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