Method Article

Entwicklung eines Direkt Pulp-Kappungsmodell für die Beurteilung von Pulpal Wundheilung und Reparative Dentinbildung bei Mäusen

DOI:

10.3791/54973

⸱

January 12th, 2017

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1The Shapiro Family Laboratory of Viral Oncology and Aging Research, The UCLA School of Dentistry, 2UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center, 3David Geffen School of Medicine at UCLA

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir beschreiben eine Schritt- für -Schritt - Methode der direkten Pulpe an Mäusen Zähne für die Bewertung der Pulpa Wundheilung und reparative Dentin Bildung in vivo Capping durchgeführt wird .

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zahnpulpa ist ein lebenswichtiges Organ eines Zahnes, das vollständig durch Zahnschmelz und Dentin geschützt ist. Wenn die Pulpa aufgrund von kariogenen oder iatrogenen Verletzungen freigelegt wird, wird sie oft mit biokompatiblen Materialien bedeckt, um die Heilung der pulpalen Wunde zu beschleunigen. Das ultimative Ziel ist die Regeneration des reparativen Dentins, einer physikalischen Barriere, die als "biologisches Siegel" fungiert und das darunter liegende Pulpagewebe schützt. Obwohl dieses direkte Pulpa-Capping-Verfahren in der Zahnmedizin schon lange eingesetzt wird, ist der zugrundeliegende molekulare Mechanismus der pulpalen Wundheilung und der reparativen Dentinbildung noch wenig verstanden. Um reparatives Dentin zu induzieren, wurde die Pulpaabdeckung experimentell bei großen Tieren durchgeführt, bei Mäusen jedoch weniger, vermutlich aufgrund ihrer geringen Größe und der daraus resultierenden technischen Schwierigkeiten. Hier stellen wir eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Methode zur Durchführung eines Pulpa-Capping-Verfahrens bei Mäusen vor, einschließlich der Präparation einer Klasse-I-ähnlichen Kavität, des Platzierens von Pulpa-Capping-Materialien und des Restaurationsverfahrens mit Zahnkomposit. Unser Pulpa-Capping-Mausmodell wird maßgeblich dazu beitragen, die grundlegenden molekularen Mechanismen der pulpalen Wundheilung im Zusammenhang mit reparativem Dentin in vivo zu untersuchen, indem es den Einsatz von transgenen oder Knockout-Mäusen ermöglicht, die in der Forschungsgemeinschaft weit verbreitet sind.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zahnkaries ist eine der häufigsten Munderkrankungen und bei fast allen Personen die Hauptursache für chirurgische Eingriffe in das Gebiss1,2. Die Prognose von chirurgischen Eingriffen und Restaurationen eines Zahnes hängt weitgehend von der richtigen Reaktion der Pulpa und einer erfolgreichen Wundheilung ab. In der Tat führt Karies, die tief in den Zahnschmelz und das Dentin eindringt, häufig zur Freilegung des darunter liegenden Pulpagewebes, das oft mit Dentalmaterialien wie Calciumhydroxid (Ca(OH)2) oder hydraulischen Calciumsilikatzementen (HCSCs), einschließlich mineralischer Trioxid-Aggregate (MTA), "bedeckt" ist. Das ultimative Ziel eines solchen Pulpa-Capping-Verfahrens ist es, die Heilung der pulpalen Wunde durch die Regeneration von reparativem Dentin zu beschleunigen, einer physikalischen Barriere, die als "biologische Versiegelung" fungiert, um das darunter liegende Pulpagewebe zu schützen und die Lebenserwartung des Zahns und die allgemeine Mundgesundheit zu erhöhen. Der zugrundeliegende Mechanismus der pulpalen Wundheilung und der reparativen Dentinbildung ist jedoch nicht vollständig verstanden.

Um die Mechanismen der pulpalen Wundheilung und der reparativen Dentinbildung in vivo besser zu verstehen, wurden zuvor mehrere Tiere verwendet, darunter Affen, Hunde und Schweine3-5. Unter ihnen werden häufig Ratten verwendet, da sie im Vergleich zu den anderen Tieren relativ kleiner sind, aber ihre Zähne groß genug sind, um eine direkte Pulpaabdeckung ohne technische Schwierigkeiten durchzuführen6-10. Diese Tiermodelle sind ideale Alternativen zu Humanstudien zur Untersuchung der pulpalen Reaktionen und der reparativen Dentinbildung. Ihre Verwendung ist jedoch auf Beobachtungsstudien auf zellulärer Ebene beschränkt und sie liefern kaum mechanistische Einblicke in die reparative Dentinbildung auf molekularer Ebene.

Jüngste technische Fortschritte in der Gentechnik lieferten unschätzbare und unverzichtbare Forschungswerkzeuge - Mäuse, die ein Gen beherbergen, das entweder überexprimiert oder gelöscht ist - die für die Untersuchung molekularer Mechanismen menschlicher Krankheiten in vivo hilfreich sind. Die Zahl der verschiedenen Stämme von transgenen oder Knockout-Mäusen, die strategisch zellspezifisch induzierbar sind, nimmt in der wissenschaftlichen Gemeinschaft stetig zu. Daher würde die Untersuchung der pulpalen Wundheilung und der reparativen Dentinregeneration bei diesen Mäusen sehr dazu beitragen, unser Verständnis dieser Prozesse auf molekularer Ebene zu beschleunigen. Der Einsatz von Mäusen wird jedoch deutlich gedämpft, da die Durchführung eines Pulpa-Capping-Verfahrens an einem Mauszahn aufgrund seiner Miniaturgröße technisch anspruchsvoll ist. Hier stellen wir unsere reproduzierbare Methode zur Durchführung des direkten Pulpa-Capping bei Mäusen zur Beurteilung der pulpalen Wundheilung und der reparativen Dentinbildung in vivo vor.

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Protocol

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Die Mäuse wurden von Jackson Laboratory erworben und in einem keimfreien Vivarium in der UCLA Abteilung für Labortiermedizin (DLAM). Die Experimente wurden aus dem Kanzler Animal Research Committee (ARC # 2016-037) nach den anerkannten Richtlinien des Instituts durchgeführt.

1. Maus Betäubung

  1. Verwenden Sie acht Wochen alten weiblichen C57 / BL6-Mäusen (n = 3).
  2. Anästhesieren die Mäuse unter Verwendung von Ketamin (80-120 mg / kg Mausgewicht) / Xylazin (5 mg / kg Mausgewicht) Lösungen und administrieren intraperitoneal (ip) in einer Dosis von 10 ml / kg.
  3. Bereiten Ketamin (80 - 120 mg / kg) / Xylazin (5 mg / kg) Lösungen und verwalten sie intraperitoneal (ip) in einer Dosis von 10 ml / kg.
  4. Bestätigen Sie, dass die Mäuse durch Ausführen einer Zehe Prise vollständig betäubt werden.

2. Zellstoff-Capping Verfahren

  1. Platzieren Sie den Mund Halter in der Maus in den Mund.
  2. Sichern Sie den Mund Halter auf dem Tisch, so dass die erAnzeige nach oben zeigt.
  3. Platzieren Sie das Mikroskop (10fach) oben auf den Mund, so dass der erste Oberkiefermolaren vollständig sichtbar ist.
  4. Mit der ¼-Rundbohrer in einem Hochgeschwindigkeits-Handstück bei 200.000 Umdrehungen pro Minute, entfernen Sie den Zahnschmelz Teil des Zahnes in der Mitte, bis der Brei durch das transparente Dentin sichtbar ist. Sie nicht den Brei mit dem bur aussetzen.
  5. Unter Verwendung eines # 15 Endodontie K-Datei (Durchmesser von 150 & mgr; m), perforieren durch das Dentin und setzen die Zellstoff.
    HINWEIS: Besondere Vorsicht ist geboten werden, so dass das Dentin Schmutz nicht in den Brei geschoben bekommt. Dies kann vierteljährlich durch Drehen der K-Datei vermieden werden, und dann zieht die K-Datei aus.
  6. Mischungs MTA mit sterilem H 2 O gemäß den Anweisungen des Herstellers. mit der Spitze des Explorers liefern und den MTA auf die Pulpa platzieren. Verwenden Sie die Rückseite der Papierspitze (fein) durch leichtes Klopfen der MTA in die Pulpa zu packen. Die dickere Seite des Papiers Punkt ist flach und daher erlaubtfür die ordnungsgemäße Kondensation des MTA in die Pulpa.
  7. Etch den Zahn für 15 s durch die 35% ige Phosphorsäure-Ätzmittel platzieren, wo es nur um den Zahn abdeckt. Besondere Vorsicht die Platzierung des Ätzmittel zu begrenzen, da es Gingivagewebe reizen können.
    HINWEIS: Das Ätzmittel in einer Spritze kommt, und verwendet wird, um die Zahnflächen aufzurauhen, so dass Dentaladhäsive einströmen kann mikromechanischen Bindung auf den Zahn zu vermitteln. Da sie viskos sind, können sie durch die Anwendung kleiner Mengen direkt auf dem Zahn in sich geschlossen sein.
  8. Verwenden Sie negative Druck stehenden Saug- das Ätzmittel zu entfernen. Verwenden Sie einen Wattepellet , das leicht mit H 2 O getränkt wird , um die Reste des Ätzmittel zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis das Ätzmittel vollständig aus dem Zahn entfernt wird.
  9. Mit Hilfe eines Druckluftstaubtuch trocknen sanft den Zahn.
  10. Übernehmen Sie die Dentaladhäsive die Rückseite des Papierspitze verwenden.
  11. Stellen Sie die Klebeschicht dünn mit Druckluft für 3 s.
  12. Cure die Dentaladhäsive für 20 s die Aushärtung Lichteinheit.
  13. Legen Sie das fließfähige Composite in kleinen Mengen auf den Zahn, der mit MTA gekappt wurde. Verwenden Sie die Spitze des Forschers des Verbund in die Zahnrillen zu fließen.
  14. Heilung der Verbund für 30 s eine lichthärtende Einheit unter Verwendung es zu polymerisieren. Bestätigen Sie, dass der Verbund vollständig ausgehärtet ist und hart den Explorer verwenden.

3. Post-op Pflege

  1. Verabreichen Carprofen (5 mg / kg) subkutan (sc) unmittelbar nach der Pulpe-Capping Verfahren.
  2. Legen Sie die Mäuse auf einem Heizkissen bei geringer Leistung, die Tiere warm zu halten, bevor sie aufwachen.
  3. Bringen Sie die Mäuse auf das Vivarium für den Wohnungsbau.

4. Gewebebeschaffung

  1. Nach 5 - 6 Wochen, die Mäuse durch Genickbruch unter einer vollständigen Betäubung mit Isofluran Zustand einschläfern.
  2. Entfernen Sie vorsichtig den Oberkiefer aus der Basis des Schädels und steckte es in einen 50-ml-Röhrchen. Befestigen Sie den entire Oberkiefers, die über Nacht in PBS, pH 7,4, bei 4 ° C sowohl die Zellstoff- bedeckten Zahn und die kontralaterale uncapped Zahn in 4% Paraformaldehyd enthält, und es dann speichern Sie in einer 70% igen Ethanollösung.
    HINWEIS: Paraformaldehyd ist giftig und krebserregend. Die ordnungsgemäße Verwendung Paraformaldehyd sollte in den Standardarbeitsanweisungen (SOP) wie skizziert überwacht werden.
  3. Scannen Sie die Maus Maxillen die μCT Scan verwenden. Zur Sicherung des Oberkiefers während des Scannens, wickeln Sie die Proben mit Gaze, getränkt mit 70% Ethanol und legen Sie sie in den 15-ml Zellkulturröhrchen.

5. μCT Scanning

  1. Bereiten Sie die Proben für μCT Scannen. Kurz gesagt, wickeln Sie die Proben mit Gaze mit 70% Ethanol getränkt und sie in einem allgemeinen 15 ml Zellkultur konischen Röhrchen sichern. Montieren Sie das Rohr auf die μCT Scanstufe, wie in den Anweisungen des Herstellers beschrieben.
  2. Stellen Sie die Röntgenstrahlenquelle einem Strom von 145 uA, einer Spannung von 55 kVp und einer Belichtungszeit von 200 ms.
  3. Führen der Bildaufnahme mit dem μCT Scanner mit einer 20-um-Auflösung und mit einer 0,5 mm Al-Filter.
  4. Rekonstruieren Sie das Bild und visualisieren 11.
  5. Sobald der μCT Scanvorgang abgeschlossen ist, Entkalkung mit 5% EDTA und 4% Saccharose in PBS (pH 7,4) für 2 Wochen.

6. Gewebeverarbeitung und Färbung

  1. Einbetten der entkalkt Gewebe in Paraffin. Vor dem Einbetten, schneiden Sie den Oberkiefer durch einen sagittalen Schnitt sofort auf den ersten Molaren anterioren machen. Während die Einbettung positionieren diese Fläche nach unten, so dass der Längsschnitt des ersten Molaren ist die Schnittfläche.
  2. Mit dem Mikrotom, bereiten 5 um dicke Folien. Die Zellstoff-Capping Bereiche übereinstimmen in der Regel mit dem distopalatal (DP) Wurzel, die als Orientierungspunkt verwendet werden kann. Bestimmen Sie den genauen Bereich von Interesse durch die Histologie unter dem Lichtmikroskop zu untersuchen und die μCT Bilder zu vergleichen.
  3. Für H & E-Färbung, Deparaffinize und die Folien mit Xylol (2x) rehydrieren und seriell verdünnt Ethanol (100% EtOH 2x, 95% EtOH 2x, und 70% EtOH 1x).
  4. Spülen Sie die Folien mit fließendem Leitungswasser.
  5. Fleck mit Hämatoxylin-Lösung für 2,5 min und Spülen mit Leitungswasser.
  6. Tauchen der Objektträger in 95% Ethanol für 1 min.
  7. Fleck mit Eosin-Lösung für 1 min und Spülen mit Leitungswasser.
  8. Entwässern mit seriell verdünnten Ethanol (70% EtOH 1x, 95% EtOH 2x und 100% EtOH 3x) und Xylol (3x).
  9. Montieren Sie die Folien mit Befestigungslösung.

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Results

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Hier haben wir gezeigt, die Schritt-für-Schritt-Verfahren Zellstoff zur Durchführung an Mäusen Zähne Capping. Einer der wichtigsten Aspekte der Zellstoff bei Mäusen Capping ist die entsprechende Vorrichtung haben. In dieser Hinsicht mit einem 10fach-facher Vergrößerung des Mikroskops ist von wesentlicher Bedeutung (Abbildung 1A). Um eine Klasse-I-like Vorbereitung in den Zahn zu erstellen, verwendeten wir eine ¼-Runde Grat in einem elektrischen Hochgeschwindigkeitshandst...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Derzeit gibt es mehrere verschiedene experimentelle Modelle zur Verfügung , um die in vivo - Effekte von Dentalmaterialien, Gerüste oder Wachstumsfaktoren auf odontogene Differenzierung von Zahnpulpa Stammzellen (DPSCs) 13 zu validieren. Diese Modelle sind mit ektopischen autologe Transplantation von DPSCs in ein Organ, wie die Nierenkapsel oder subkutane Transplantation von DPSCs in immunsupprimierten Mäusen mit Gerüsten 14,15. Jedoch sind diese Verfahren begrenzt, daß ihre Wirkung auf od...

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie wurde von R01DE023348 (RHK) von NIDCR / NIH und der Fakultät Research Grant (RHK) vom Rat für Forschung des Akademischen Senats der Los Angeles Abteilung der Universität von Kalifornien unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BM-LED StereomikroskopMEIJI TechnoMikroskop 
Optima MCX-LED Bien Air Dental1700588-001Elektromotor
IsofluranHenry schein animal healthNDC 11695-0500-2
1/4 round burBrasseler001092T0
Endodontic K-fileRoydent98947
ProRoot MTADentsplyPROROOT5WMTA
Paper pointHenry schein100-3941
Ultra-EtchUltradent Produkt Inc.Phosphorsäureätzmittel
OptiBond SoloPlusKerr29669Klebstoffe
Coltolux LEDColtene/whaledent Inc.C7970100115Härtungslampeneinheit
Charakterisierung TönungBiscoT-14012Fließfähiges Komposit
SkyscanBreuker1275uCT Scanner
MicromThermoHM355SMikrotom
Hämatoxylin-1Thermo Scientific7221
Eosin-YThermo Scientific7111
Cytoseal 60Thermo Scientific8310-16Eindecklösung

References

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