Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Identifizierung von intrazellulärer Induzierte in lebenden Zellen durch Interaktion Signalisierung mit Benachbarte Zellen, die eine programmierten Zelltods

8.1K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/54980

⸱

27. Dezember 2016

 ,  ,  ,  , 
1Section of Nephrology, Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Section of Nephrology, Department of Medicine, Jesse Brown Veterans Affairs Medical Center, 3Department of Biology, Kutztown University of Pennsylvania, 4Division of Rheumatology, Department of Medicine, Research Institute of the McGill University Health Centre, 5Department of Microbiology & Immunology, University of Illinois at Chicago

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Bestimmung intrazellulärer Signalereignisse, die in lebensfähigen Zellen durch physikalische Interaktion mit benachbarten toten oder sterbenden Zellen induziert werden. Das Protokoll konzentriert sich auf Signalereignisse, die durch Rezeptor-vermittelte Erkennung der toten Zellen induziert werden, im Gegensatz zu ihrer phagozytären Aufnahme oder Freisetzung löslicher Mediatoren.

Zusammenfassung

Die Zellen durch Apoptose sterben, auch bezeichnet als regulierte Zelltod, mehrere neue Aktivitäten zu erwerben, die es ihnen ermöglichen, die Funktion von benachbarten lebenden Zellen zu beeinflussen. Vitale Aktivitäten, wie das Überleben, die Proliferation, das Wachstum und die Differenzierung, gehören zu den vielen Zellfunktionen durch apoptotische Zellen moduliert. Die Fähigkeit, apoptotische Zellen zu erkennen und zu reagieren scheint ein universelles Merkmal aller Zellen zu sein, unabhängig von Lineage oder Organ des Ursprungs. Allerdings ist die Vielfalt und Komplexität der Reaktion auf apoptotischen Zellen vor, dass große Sorgfalt, die für ein bestimmtes Ergebnis in sezieren die Signalereignisse und Wege genommen werden. Insbesondere muß man unter den mehreren Mechanismen unterscheiden, durch die apoptotischen Zellen intrazelluläre Signalwege innerhalb tragfähige Responderzellen beeinflussen können, einschließlich: Rezeptor-vermittelte Erkennung der apoptotischen Zellen, die Freisetzung von löslichen Mediatoren durch die apoptotische Zelle und / oder Eingriff der phagocytic Maschinen. Hier stellen wir ein Protokoll zur Identifizierung von intrazellulären Signalereignissen, die lebensfähige Responderzellen nach ihrer Exposition gegenüber apoptotischen Zellen induziert werden. Ein Hauptvorteil des Protokolls liegt in der Aufmerksamkeit es Dissektion des Mechanismus zahlt, durch die apoptotischen Zellen Ereignisse innerhalb reagiert Zellen modulieren signalisiert. Während das Protokoll für eine konditional immortalisierten Mausniere proximalen röhrenförmigen Zelllinie (BU.MPT Zellen) spezifisch ist, ist es leicht zu Zelllinien, die angepasst Ursprungs und / oder abgeleitet von anderen Organen als der Niere nicht-epithelialen sind. Die Verwendung von toten Zellen als Stimulus stellt einige einzigartige Faktoren, die den Nachweis von intrazellulären Signalereignisse behindern. Diese Probleme sowie Strategien zu minimieren oder zu umgehen, sie werden innerhalb des Protokolls erörtert. Die Anwendung dieses Protokolls sollte unsere wachsenden Wissen der breiten Einfluss unterstützen, die toten oder sterbenden Zellen auf ihre Live-Nachbarn ausüben, sowohl in den Bereichen Gesundheit und in disease.

Einleitung

Apoptosis oder regulierte Zelltod 1 trägt in wesentlicher Weise zur Erhaltung und Entwicklung von Geweben. Gesehen am einfachsten, Apoptose Genehmigungen im Alter, beschädigt oder überschüssige Zellen ohne Schaden für das umgebende Gewebe 2,3 beseitigt werden. Der Beitrag der Apoptose Gewebshomöostase jedoch wesentlich dynamischer und vielfältig. Die Zellen durch Apoptose erwerben mehrere neue Aktivitäten zu sterben, beide abgesondert und zellassoziierte, die es ihnen ermöglichen 4-10 die Funktion benachbarter lebenden Zellen zu beeinflussen. Frühere Untersuchungen über die Fähigkeit von apoptotischen Zellen konzentriert Entzündung 11-16, aber apoptotischen Zellen zu unterdrücken , auch ein breites Spektrum von Zellfunktionen modulieren, einschließlich solcher vital Aktivitäten als Überleben 4,9,10, 4,9,10 - Proliferation, Differentiation 17, Migration 18 und 19 das Wachstum. Außerdem sind diese Wirkungen nicht auf professionelle Phagozyten beschränkt ist, wie Makrophagens, aber auf praktisch allen Zelltypen und Abstammungslinien erstrecken, einschließlich traditionell nicht-phagozytische Zellen, wie Epithelzellen und Endothelzellen 7,9,10,18-21.

Die spezifische Reaktion benachbarter lebenden Zellen zu apoptotischen Zellen nach der Exposition, hängt von mehreren Faktoren, die sowohl die lebensfähigen reagierenden Zellen beziehen, und den apoptotischen Zellen selbst. Obwohl beispielsweise Exposition gegenüber apoptotischen Zellen hemmt , die Proliferation von sowohl murinen Makrophagen und Nieren proximalen tubulären Epithelzellen (ptecs), wobei diese beiden Zelltypen unterscheiden sich erheblich in ihrem Überleben Reaktion auf apoptotische Zellen 4,6,9,10. Apoptotischen Zellen fördern das Überleben von Makrophagen, aber der apoptotischen Tod von ptecs 4,6,9,10 induzieren. Bemerkenswert ist , kann die Reaktion auf apoptotische Zellen unterscheiden sich auch Zellen der gleichen Abstammungslinie, abhängig von der Reaktion Zelle Ursprungsorgan 10 (beispielsweise Nieren ptecs Vergleich Brustepithelzellen unter reagiertZellen) oder Zustand der Aktivierung 22 (zB Neutrophile). Umgekehrt kann apoptotischen Zellen unterschiedliche Antworten in der gleichen Zelle evozieren von der Art des apoptotischen Stimulus abhängig 10,23 oder das Stadium der Apoptose 10,14.

Da müssen die Verschiedenheit und Komplexität der Reaktion auf apoptotischen Zellen, große Sorgfalt in sezieren die Signalereignisse und Wege für einen bestimmten Ergebnis verantwortlich gemacht werden. Erstens Antworten direkte physikalische Interaktion zwischen lebens- und apoptotischen Zellen erfordern , müssen von den durch lösliche Mediatoren durch die apoptotische Zelle 3,6-10 freigesetzt oder erzeugt ausgelöst differenziert werden. Wenn physikalische Wechselwirkung erforderlich ist, dann sollte eine weitere Differenzierung vorgenommen werden. Signalisierungsereignisse können auf Rezeptor-vermittelte Erkennung der apoptotischen Zelle, unabhängig von nachfolgenden engulfment abhängen, oder Phagozytose, unabhängig von dem spezifischen Rezeptor, der die apoptotische Zelle bindet 3-7,9,10,19. Im letzteren Fall ist die Antwort auf apoptotischen Zellen nicht spezifisch, und kann von jedem Material phagozytischen 4,6 ausgelöst werden.

Die Bedeutung dieser Unterscheidung kann wiederum durch kontras die Antworten von Makrophagen und Nieren ptecs geschätzt. Für beide Zelltypen, Exposition gegenüber apoptotischen Zellen verändert die Aktivität des Pro-Überleben kinase Akt. Die Modulation ist abhängig von physikalischen Wechselwirkung, da die Trennung von Reaktion und apoptotischen Zellen durch eine 0,4 um Polycarbonatmembran hebt die Antwort 4,9,10,19. Jedoch ist die Reaktion von ptecs rezeptorvermittelten und unabhängig von Phagocytose, während die Reaktion der Makrophagen durch Phagozytose 4,9,10,19 angetrieben wird. Diese Schlussfolgerung wird durch die Tatsache verstärkt , dass die Exposition gegenLatexKügelchen, einem neutralen phagozytischen Reiz, keine Auswirkungen auf die Akt - Aktivität in ptecs hat, sondern ahmt die Wirkung von apoptotischen Zellen in Makrophagen 4,9.

"> Obwohl weniger gut untersucht, sterbende Zellen durch Nekrose oder zufälligen Zelltod 1, modulieren auch die Funktion der lebensfähigen Zellen in der Nähe 3-10,19. Wie apoptotischen Zellen, nekrotische Zellen üben ihre Wirkungen durch eine Vielzahl von Mechanismen, insbesondere der Leckage der intrazellulären Inhalte durch ihre geplatzten Zellmembran 3,5,6,9,24. Viele Zellen, einschließlich ptecs und Makrophagen besitzen ausgeprägte nicht-konkurrierende Rezeptoren für durch Nekrose 5,9 sterbende Zellen. Verpflichtungs dieser Rezeptoren signal~~POS=TRUNC induziert, die durch den Eingriff der Rezeptoren für apoptotische Zellen zu denen häufig entgegengesetzte 4-10,19 induziert , z. B. in ptecs erhöhen nekrotischen Zellen die Phosphorylierung von Akt, während apoptotischen Zellen Phosphorylierung 9,10,19 verringern.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Identifizierung von intrazellulären Signalereignisse induziert in lebensfähige Niere ptecs durch Rezeptor-vermittelte Erkennung von benachbarten apoptotischen ptecs 9,10,19. Während das Protokoll für eine konditional immortalisierte Zellinie PTEC bekannt als BU.MPT Zellen 9,10,19,25,26 spezifisch ist, ist es leicht zu Zelllinien , die angepasst Ursprungs und / oder abgeleitet von anderen Organen nicht-epithelialen sind als die Niere. Wichtig ist, stellt die Verwendung von apoptotischen Zellen als Zell Reiz bestimmte inhärente experimentellen Schwierigkeiten nicht vorhanden mit löslichen Liganden. Der wichtigste davon ist, dass apoptotische Zellen als Suspension zugegeben werden müssen und nicht als eine Lösung. Diese Schwierigkeiten, sowie Strategien zu minimieren oder zu umgehen, sie werden innerhalb des Protokolls erörtert. Fast alle der in dem Protokoll beschriebenen Techniken sind einfach und Standard-Zellkultur. Der Vorteil dieses Protokolls liegt in seiner Aufmerksamkeit auf die mehrere Mechanismen, durch die apoptotischen Zellen Signaltransduktion innerhalb reagierenden Zellen modulieren. Diese Mechanismen schließen die Bindung über Oberflächendeterminanten oder Brückenmoleküle an spezifische Rezeptoren auf der Wiederchenden Zelle, die Freisetzung von löslichen Mediatoren und / oder der Eingriff der phagozytischen Maschinen. Nekrotische Zellen werden in allen Experimenten eingeschlossen, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse sind spezifisch für die Art des Zelltods, und nicht eine verallgemeinerte Reaktion auf tote Zellen. Eine sorgfältige Ansatz, wie in diesem Protokoll empfohlen, ist von entscheidender Bedeutung für unser Verständnis von der stetig wachsenden Einfluss, den sterbenden Zellen auf ihre Live-Nachbarn ausüben, sowohl in Gesundheit und Krankheit.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

1. Vorbereitungen

Anmerkung: In diesem Protokoll werden zwei oder mehrere Zelllinien oder primäre Zellkulturen werden unabhängig hergestellt unter spezifischen Bedingungen. Diese Präparate enthalten apoptotischen Zellen (Protokoll 1), nekrotische Zellen (Protokoll 2) und gesunden Responderzellen (Protokoll 3). Nach unabhängige Herstellung sind apoptotischen oder nekrotischen Zellen zu Responderzellen zugegeben und die erhaltene Signaltransduktion wird überwacht (Protocols 4, 5 und 6).

  1. Bereiten Kulturmedien und Reagenzien
    1. Bereiten Sie 500 ml Kulturmedium A (für den Einsatz, wenn die Zellen unter permissiven Bedingungen wachsen, siehe Abschnitt 1.2) durch die Kombination der folgenden: 1x Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), das 4,5 g / l Glucose, 584 mg / l ʟ-Glutamin, 110 mg / l Natriumpyruvat, 100 Einheiten / ml Penicillin-Streptomycin, 10% (v / v) fötalem Rinderserum (FBS) und 10 Einheiten / ml Interferon-γ (IFN-γ).
    2. Bereiten 500 ml Kulturmedium B (zur Verwendung when Serum-hungernde Zellen unter nicht-permissiven Bedingungen, Abschnitt 1.2) von FBS und IFN-γ aus dem Rezept des Kulturmediums A. Auslassen Um Zellen unter nicht-permissiven Bedingungen (vor der Serum-Hunger) wachsen, mit 10% v sehen / v FBS Kulturmedium B.
    3. Bereiten 0,4% (v / v) Paraformaldehyd, pH 7,2, in 1x Dulbecco-phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) von 4% Paraformaldehyd Lager zur Fixierung von toten Zellen.
      Hinweis: Paraformaldehyd ist giftig und entsprechende Vorsicht ist bei seiner Verwendung ausgeübt werden.
  2. Kultur BU.MPT Zellen
    1. Tauen aus flüssigem Stickstoff ein Fläschchen BU.MPT Zellen.
      Hinweis: BU.MPT ist eine Maus Niere proximale röhrenförmige Epithelzellen (PTEC) Linie von einer transgenen Maus abgeleitet ist eine temperaturempfindliche (ts) Mutation (tsA58) des SV40 großen Tumor Antigen (Tag) unter der Kontrolle des Maus-tragenden Haupt Histocompatibility Complex (MHC) H-2K b Klasse I - Promotor 25,26.
    2. Platten-Zellen auf sterile polystyrene Vakuum-Gasplasma behandelten Gewebekulturschalen (~ 5 × 10 6 Zellen pro 100 mm Durchmesser - Schale).
    3. Wachsen Zellen unter permissiven Bedingungen in einem befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre.
      Anmerkung: permissiven Bedingungen, die als Kultur definiert werden bei 33 bis 37 ºC in Gegenwart von IFN-γ, ermöglichen eine stabile Expression des tsA58-mutierten TAg Transgen. Im Gegensatz zu Primärkulturen von Maus Niere PTEC, die mehr überleben nicht als eine einzige Passage oder zwei, kultiviert BU.MPT unter permissiven Bedingungen unbegrenzt passagiert werden.
      1. Passage-Zellen mindestens dreimal nach dem Auftauen vor ihnen in einem Experiment verwendet wird.
        1. Zur Passage - Zellen, 1 ml von 0,05% Trypsin pro 100 - mm - Schale, und Inkubation in einem befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre bei 37 ° C für 5 min. Neutralisieren des Trypsins durch Zugabe von 10 ml Medium A. aspirieren die abgelösten Zellen und Split im Verhältnis 1: 3 bis 1: 5 in neue 100 mm sterile Polystyrol Vakuum-Gasplasma behandelt tissue Kulturschalen. In Medium A das Volumen zu bringen, bis zu einer Gesamtmenge von 10 ml pro 100 mm Schale.
    4. In Vorbereitung für die experimentelle Verwendung als Zellen reagiert, Zellen wachsen in einer befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre unter nicht-permissiven Bedingungen (dh bei 39 ºC in Abwesenheit von IFN-γ [Medium B mit 10% v bis zur Konfluenz / v FBS]).
      Hinweis: Unter nicht-permissiven Bedingungen, die Expression des tsA58 mutierten TAg Transgen gehemmt durch> 95%, und BU.MPT Zellen verhalten sich wie Primärkulturen von Maus Niere PTEC.

2. Herstellung von apoptotischen Zellen BU.MPT (Protokoll 1)

Hinweis: Dieses Protokoll für BU.MPT Zellen als Quelle von apoptotischen Zellen und Staurosporin als Verfahren zur Apoptoseinduktion spezifisch ist. Alternativ kann eine andere Zellinie oder primäre Zellkultur, kann als Quelle für apoptotische Zellen verwendet werden, wobei die Apoptose durch standardisierte Protoco induziertels für diesen bestimmten Zelltyp und ein Verfahren zur Induktion der Apoptose.

  1. Nach dem Durchgang auf 100 mm Durchmesser sterile Polystyrolvakuumgasplasma behandelte Gewebekulturschalen wachsen BU.MPT Zellen in einer befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre unter permissiven Bedingungen zur Konfluenz (dh bei 37 ºC in Kulturmedium A an 10 ml pro 100-mm-Schale), wie in Abschnitt 1.2.3 beschrieben.
  2. Spülen Sie die adhärenten Zellschicht dreimal mit Kulturmedium B, unter Verwendung von 10 ml pro Spülung.
  3. Apoptose induzieren , indem die Zellen in Kulturmedium B enthält Staurosporin Inkubieren einer nicht - selektiven Proteinkinase - Inhibitor, bei 1 & mgr; g / ml für 3 Stunden in einem befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre bei 37 ºC.
  4. Saugen Sie das Staurosporin haltigen Medium "schwebenden" apoptotischen Zellen enthalten, die von der einschichtigen abgelöst haben. Zentrifuge dieses Medium für 10 Minuten bei 500 · g, den Überstand verwerfen, waschen Sie das Pellet dreimal mit Kulturmedium B, undfügen Sie das Pellet zurück zu den Zellen im nächsten Schritt gesammelt, 2.5.
  5. Lösen sich die verbleibenden adhärenten Zellen aus den Schritten 2.3 und 2.4 durch Zugabe von 5 mM (Ethylendiamintetraessigsäure) EDTA in 1x Ca 2 + - und Mg 2 + -freien DPBS bei 1 ml pro Schale für 5 min. Saugen Sie das EDTA-haltige Medium abgelöst apoptotischen Zellen enthält, und bündeln die abgelösten Zellen mit den "schwebenden" apoptotischen Zellen aus Schritt 2.4 in einem sterilen 15 ml Polystyrol-Zentrifugenröhrchen.
  6. Waschen Sie die apoptotischen Zellen dreimal durch Zentrifugation für 10 min bei 500 xg und Resuspension in 10 ml 1x Ca + 2 - und Mg + 2 -freie DPBS pro Waschung.
  7. Nach der letzten Waschung unterbrechen die apoptotischen Zellen in frischem Kulturmedium B bei ~ 5 × 10 6 Zellen pro ml vor der Verwendung zu Responderzellen zu stimulieren. Alternativ fixieren gewaschen apoptotischen Zellen in 0,4% (v / v) Paraformaldehyd in 1x DPBS für 30 Minuten, und dann dreimal waschen mit KulturMedium B, vor Suspension in Kulturmedium B.
  8. Gegebenenfalls bestätigen Induktion von Apoptose mittels Durchflusszytometrie eine getrennte Herstellung von apoptotischen Zellen (oder durch einige Zellen für diesen Zweck reserviert), wie zuvor beschrieben 6,9,10,15.
    Anmerkung: Frühe apoptotische Zellen intakte Zellmembranen und erscheinen als Propidiumiodid (PI) -negativen und Annexin V-positive Zellen verringerte Zellgröße (bezogen auf den lebensfähigen Zellen). Späten haben apoptotische Zellen nicht intakten Zellmembranen und erscheinen als PI-positive und Annexin V-positive Zellen der Zellgröße verringert. Mit dem aktuellen Protokoll, typische Zubereitungen enthalten ~ 85% früh apoptotischen und ~ 15% spät apoptotischen Zellen.
  9. apoptotischen Zellen In den Responderzellen (Protokoll 3) an einem apoptotischen-to-Responderzellverhältnis von 1 BU.MPT: 1, entweder direkt oder nach der Fixierung von apoptotischen Zellen für 30 min mit 0,4% (v / v) Paraformaldehyd in 1x DPBS .
    Hinweis: Die apoptotischen Zellfixierung vor der Stimulation der Responder solltenbeeinflussen die Ergebnisse nicht, es sei denn , die beobachteten Signalereignisse aufgrund Freisetzung eines löslichen Mediator (Tabelle 1) sind.

3. Herstellung von Nekrotischer BU.MPT Zellen (Protokoll 2)

Hinweis: Dieses Protokoll für BU.MPT Zellen als Quelle von nekrotischen Zellen und Erhitzen als Verfahren zur Nekrose Induktions spezifisch ist. Alternativ kann eine andere Zellinie oder primäre Zellkultur kann als Quelle von nekrotischen Zellen verwendet werden, wobei durch standardisierte Protokolle für diesen bestimmten Zelltyp und ein Verfahren zur Nekrose Induktion induzierte Nekrose.

  1. Nach dem Durchgang auf 100 mm Durchmesser sterile Polystyrolvakuumgasplasma behandelte Gewebekulturschalen wachsen BU.MPT Zellen in einer befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre unter permissiven Bedingungen zur Konfluenz (dh bei 37 ºC in Kulturmedium A an 10 ml pro Schale), wie in Abschnitt 1.2.3 beschrieben.
  2. Spülen Sie die adhärenten Zellschicht dreimal mit Kulturmedium B, unter Verwendung von10 ml pro Spülung.
  3. Lösen sich die Zellen durch Zugabe von 5 mM EDTA in 1x Ca + 2 - und Mg + 2 -freie DPBS bei 1 ml pro Schale für 5 min. Saugen Sie das EDTA-haltige Medium abgelösten Zellen enthält, und fügen Sie in ein steriles 15 ml Polystyrol-Zentrifugenröhrchen die Zellsuspension.
  4. Waschen Sie die Zellen dreimal durch Zentrifugation für 10 min bei 500 xg und Resuspension in 10 ml Ca + 2 - und Mg + 2 -freie DPBS pro Waschung.
  5. Nach der letzten Waschung, um die Zellen in frischem Kulturmedium B bei ~ 5 × 10 6 Zellen pro ml einzustellen.
  6. Induce Nekrose von Zellen auf 70 ° C für 45 min in einem Wasserbad, sanft verwirbelt die Zellsuspension alle 10 min erhitzt wird.
  7. Inkubiere Zellen für 2 h in einem befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre bei 37 ° C. alle 15 min vorsichtig Vortex, um die Zellsuspension.
  8. Gegebenenfalls bestätigen die Induktion von Nekrose mittels Durchflusszytometrie eine separate Herstellung ne mitcrotic Zellen (oder durch einige Zellen für diesen Zweck reserviert), wie zuvor beschrieben 6,9,10,15.
    Hinweis: Nekrotische Zellen Zellmembranen aufgebrochen sind, und erscheinen als PI-positive Zellen mit erhöhter Zellgröße (bezogen auf den lebensfähigen Zellen). Mit dem aktuellen Protokoll, typische Zubereitungen enthalten ≥ 95% nekrotischen Zellen. Alternativ Induktion von Nekrose und den Verlust der Membranintegrität kann durch Trypan-Blau-Färbung bestätigt.

4. Herstellung von BU.MPT Responderzellen (Protokoll 3)

Hinweis: Dieses Protokoll für BU.MPT Zellen als Quelle von Responderzellen spezifisch ist. Alternativ kann eine andere Zellinie oder primäre Zellkultur, können als Responderzellen verwendet werden. Vor der experimentellen Verwendung kann quiescence kann über Nacht durch standardisierte Protokolle im Labor induziert.

  1. Wachsen BU.MPT Zellen in sterilen 100-mm-Gewebekulturschalen unter permissiven Bedingungen in Kulturmedium A bei 10 ml pro Schale, bis sie erreichen ~85% Konfluenz.
  2. Absaugen Kulturmedium A, und spülen Sie die Zellen dreimal mit Kulturmedium B bei 10 ml pro Spülung. Serum-verhungern die Zellen über Nacht für 18 bis 24 h in einer befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre unter nicht-permissiven Bedingungen (dh bei 39 ºC in Kulturmedium B bei 10 ml pro Schale), wie im Abschnitt 1.2 0,4, um Ruhe zu induzieren. Alternativ wachsen Zellen in Kulturmedium B plus 10% (v / v) FBS bei 39 ºC für einen Tag, bevor Serum Zellen hungern ohne FBS über Nacht in Kulturmedium B.
  3. Beschriften Sie eine separate Gewebekulturschale konfluierender BU.MPT Zellen für jede Versuchsbedingung.
  4. Umfassen die folgenden sechs Bedingungen: Stimulation von lebensfähigem BU.MPT Responder mit entweder Vehikel oder epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) für 15 min, nach ihrer Belichtung für 30 min bis entweder keine Zellen, apoptotische Zellen oder nekrotischen Zellen.
    Hinweis: Die Einwirkung der toten Zellen können entweder stimulieren oder den Grad der Aktivität eines gi hemmenven Signalmolekül. Die Stimulation wird am besten über einem niedrigen Ausgangswert nachgewiesen (zB Abwesenheit von EGF), während die Hemmung wird am besten von einem hohen Ausgangswert nachgewiesen (zB Vorhandensein von EGF). Da die Wirkung der Stimulation mit toten Zellen a priori nicht bekannt ist, wird empfohlen , alle Studien sowohl in der Abwesenheit und Anwesenheit von EGF auszuführen.

5. Die Stimulation der Responder-Zellen mit apoptotischen und nekrotischen Zellen (Protokoll 4)

  1. Absaugen Kulturmedium B aus voretikettierten Gerichte der Ruhe (Serum-ausgehungert) BU.MPT Responderzellen (Protokoll 3).
    Hinweis: Nach der Nacht-Kultur unter nicht-permissiven Bedingungen, BU.MPT Zellen wie Primärkulturen von Maus Niere PTEC verhalten soll.
  2. Pro 100-mm-Schale, 2 ml eines der folgenden: Kulturmedium B (keine Zellen); apoptotischen Zellsuspension bei ~ 5 x 10 6 Zellen pro ml in Kulturmedium B (Protokoll 1); oder nekrotischen Zellsuspension bei ~ 5 x 10 6 Zellen pro mL in Kulturmedium B (Protokoll 2).
    1. Verteilen Sie die 2 ml Suspension von toten Zellen gleichmäßig über die 100-mm-Schale, und halten Sie die Zeit für sie, auf ein Minimum zu begleichen. Um dies zu erreichen, verteilen die tote Zellsuspension tropfenweise mit einer breiten Spitze Pipette über die gesamte Oberfläche der Responderzell Gerichte. Verwenden Sie ein Volumen von 2 ml als Kompromiss zwischen der Einschwingzeit minimiert und die Verklumpung von toten Zellen zu vermeiden.
      Hinweis: Die Verwendung einer Suspension von toten Zellen als Anregung eine Reihe von speziellen Überlegungen zur Folge hat , die im Folgenden näher beschrieben werden (Tabelle 2 und Diskussion).
    2. Erreichen Sie einen Toten-to-Responder - Zellen - Verhältnis von ~ 1: 1 durch Zugabe von 2 ml toten Zellen bei ~ 5 × 10 6 Zellen pro ml zu einem konfluenten 100 - mm - Schale, die ~ 10 x 10 6 Zellen enthält. Alternativ kann, um die Dosisabhängigkeit von irgendwelchen beobachteten Signalereignisse zu etablieren, variieren das Verhältnis von Toten zu Responderzellen kontinuierlich durch progressive Verdünnung in Kulture Medium B der toten Zellsuspensionen in den Protokollen 1 und 2 hergestellt.
  3. Vorsichtig die Teller wirbeln, dann in einem befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre bei 37 ºC inkubiert.
  4. Nach 30 Minuten Stimulierung entweder die Responderzellen mit Vehikel oder 50 nM EGF, entsprechend der vorge Kennzeichnung der Kulturschale.
  5. In einem befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre bei 37 ° C für 15 min inkubieren.
  6. Waschen Sie die toten Zellen entfernt durch Zugabe von 5 ml eiskaltem 1x DPBS, wirbeln die Schüssel, und Absaugen der Waschflüssigkeit. Dreimal wiederholen.
  7. Ab sofort legen Sie die Responderzellschalen auf Eis für die weitere Verarbeitung.
  8. Bereiten Sie Zelllysaten
    1. Bereiten Zelllysepuffer folgendes enthält: 1 × Tris-gepufferter Salzlösung (TBS), 10 mM Natriumpyrophosphat, 0,5% w / v Desoxycholat, 0,1% w / v SDS, 10% Glycerin und 25 mM Natriumfluorid.
      1. Unmittelbar vor der Lyse der Zelle, die folgende in der exakten Reihenfolge im ind gegeben hinzufügencated Konzentrationen: mini EDTA-freie Proteaseinhibitorcocktail (1 Tablette pro 10 ml Lyse-Puffer), 10% (v / v) Triton X-100, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) und 10 mM Natriumorthovanadat.
    2. In 700 ul eiskaltem Zelllysepuffer pro 100 mm Schale frisch stimuliert Responderzellen auf Eis aus Schritt 5.7. Scrape-Zellen mit einem Zellschaber und übertragen das Lysat vorab gekühlt 1,5 ml Mikroröhrchen. Pflegen Sie die Röhrchen auf Eis für 15 min.
    3. Beschallen Lysaten auf Eis mit 10 Impulsen von 20 Hz, weniger als eine Sekunde pro Dauer. Vermeiden Sie die Erstellung von Schaum an der Gas / Flüssig-Grenzfläche, da dies die Proben überhitzen kann. Tauchen Sie voll und ganz die Beschallungsgerät Sonde in die Mikroröhrchen Lysaten vor der Beschallungsgerät einschalten, und schalten Sie das Beschallungsgerät aus, bevor die Sonde aus den Lysaten zu entfernen.
    4. Zentrifuge bei 20.000 g für 10 min bei 4 ° C, übertragen Sie die Überstände in frische vorgekühlte Mikroröhrchen, Und lagern bei -70 ºC.
    5. Führen Gelelektrophorese und Immunoblotting auf Überständen von Lysaten, wie zuvor beschrieben 6,9,10,15.

6. Vermeiden von direkter physischer Kontakt zwischen Targets und Responders Mit einem Semipermeable Polycarbonat-Membran (Protokoll 5)

  1. Bereiten Sie BU.MPT Responderzellen gemäß Protokoll 3, mit einer Ausnahme; wachsen Zellen in sterilen Kultur Polystyrol Gewebe behandelt 12-Well-Clustern.
  2. In ausgewählten Wells, legen Sie ein durchlässiges Trägersystem eine 0,4 um Polycarbonatmembran enthält physikalische Wechselwirkung zwischen toten und Responderzellen zu verhindern. Umfassen Kontrollvertiefungen ohne Membran in dem gleichen Experiment.
  3. Absaugen Kulturmedium B aus experimentellen Vertiefungen von Serum-ausgehungert BU.MPT Responderzellen.
  4. Folgen Protokoll 4 zur Stimulation der Responder-Zellen mit apoptotischen oder nekrotischen Zellen, mit den folgenden Modifikationen:
    1. Pro Vertiefung der 12-Well-Cluster, mit 0,1 ml eines der folgenden: Kulturmedium B (keine Zellen); apoptotischen Zellsuspension bei ~ 5 x 10 6 Zellen pro ml in Kulturmedium B (Protokoll 1); oder nekrotischen Zellsuspension bei ~ 5 x 10 6 Zellen pro ml in Kulturmedium B (Protokoll 2).
      Hinweis: Da ein konfluenter Vertiefung einer 12-Well - Cluster enthält ~ 0,5 × 10 6 Zellen, Zugabe von 0,1 ml der toten Zellen bei ~ 5 x 10 6 Zellen pro ml ergibt eine dead-to-Responderzellenverhältnis von ~ 1: 1.
    2. Um Brunnen die durchlässige Trägersystem enthält, fügen Sie die toten Zellen auf der Oberseite des 0,4 um Polycarbonatmembran innerhalb des durchlässigen Trägersystem, so gibt es keine direkte physikalische Wechselwirkung zwischen toten und Responderzellen.

7. Die Hemmung der Phagozytose mit Cytochalasin D (Protokoll 6)

  1. Bereiten Sie BU.MPT Responderzellen gemäß Protokoll 3.
  2. Bereiten Sie den Cytoskelettinhibitor Cytochalasin D in dimethyl Sulfoxid (DMSO) bei 4 mg / ml (1000 ×). In den vormarkiert Speisen der BU.MPT Responderzellen entweder 10 & mgr; l Vehikel (DMSO) oder 10 & mgr; l von Cytochalasin D eine Endkonzentration von 4 ug / ml in 10 ml Kulturmedium zu erreichen, B.
    Hinweis: Bei dieser Konzentration von Cytochalasin D, Phagozytose von BU.MPT Zellen und Makrophagen - Zelllinie von ≥90% 9,10 gehemmt wurde.
  3. Inkubieren für 2 h bei 37 ºC in einem befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre.
  4. Folgen Protokoll 4 zur Stimulation der Responder-Zellen mit apoptotischen oder nekrotischen Zellen.
  5. Gegebenenfalls bestätigen die Hemmung der Phagozytose von abgestorbenen Zellen mittels Durchflusszytometrie eine getrennte Herstellung von Toten und Responderzellen (oder für diesen Zweck reservierten Zellen), wie zuvor beschrieben 9,10.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

In Abbildung 1 stellen wir eine schematische Darstellung der Timing- und kritischen Schritte bei der Herstellung von apoptotischen Zellen beteiligt (Protokoll 1) und nekrotischen Zellen (Protokoll 2) und die Stimulation von Responderzellen mit Suspensionen von apoptotischen und nekrotischen Zellen (Protokoll 4).

In Figur 2 stellen wir repräsentative Ergebnisse , die Wirkung von apoptotischen Z...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Wir stellen hier ein Protokoll, um die intrazelluläre Signalisierungsereignisse für die Charakterisierung in lebenden Zellen induziert nach ihrer Exposition gegenüber Zellen, die einer Apoptose unterliegen, oder anderen Formen von Zelltod. Das Protokoll betont die mehrere Mechanismen, durch die Exposition gegenüber apoptotischen Zellen intrazelluläre Signalwege innerhalb tragfähige Responderzellen modulieren können. Diese Mechanismen sind: die Interaktion (über Moleküle oder Oberflächendeterminanten auf die tote Zelle o...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde, ganz oder teilweise, durch institutionelle Mittel von Dr. José A. Arruda und der Sektion für Nephrologie, Universität von Illinois in Chicago (an J. S. L.) unterstützt; und finanziell von der medizinischen Abteilung der McGill University und dem Forschungsinstitut des McGill University Health Centre (an J. R.)

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Zellkulturmaterialien
DMEM, 1x mit [4,5 g/L] Glukose, ʟ-Glutamin & Natrium-PyruvatMediatech (Manassas, VA)10-013-CV
HyClone Fetal Clone II, fetales RinderserumGE Healthcare (Logan, UT)SH30066.0310% (v/v)  zum Kulturmedium hinzufügen Ein
Penicillin-Streptomycin-Glutamin, 100xLife Technologies (Grand Island, NY)10378-016100 Einheiten/ml zu den Nährmedien A und B
&gamma hinzufügen;-Interferon, Maus rekombinant, aus Escherichia coliCalbiochem, Millipore (Billerica, MA)40730310 Einheiten/ml zum Kulturmedium hinzufügen A
Falcon Polystyrol-Gewebekulturschalen, pyrogenfreiesCorning (Durham, NC)353003steril,
Falcon Zentrifugenröhrchen aus PolystyrolBoden Corning (Durham, NC)352095steril, 15 mL
Trypsin-EDTA, 0,05%, GibcoFisher (Waltham, MA)25300062steril, 100
mLName<>CompanyKatalogKommentare
Chemicals and inhibitors
Staurosporin, aus Streptomyces sp.Sigma (St. Louis, MO)S4400bei [1 μ g/ml] für 3 h zur Induktion der Apoptose
Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), [1 mg/ml]Millipore (Billerica, MA)EA140bei 50 nM zur Stimulation von Responder-Zellen
UltraPure, 0,5 M EDTA, pH 8,0Life Technologies (Grand Island, NY)15575-0385 mM zur Ablösung anhaftender Zellen
Trypanblau-Lösung, 0,4%MP Biomedicals (Santa Ana, CA)91691049zur Färbung
toter ZellenParaformaldehydlösung, 4% in DPBSAffymetrix (Santa Clara, CA)19943verwenden Sie 0,4% (v/v) in 1x DPBS für die Zellfixierung
Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS), 1x, GibcoLife Technologies (Grand Island, NY)14040133Stammlösung
Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS), Ca2+- und Mg2+-frei, 1x, GibcoLife Technologies (Grand Island, NY)14190367Stammlösung
Cytochalasin D, 4 mM in Dimethylsulfoxid (DMSO), aus Zygosporium mansoniiSigma (St. Louis, MO)C8273Anwendung bei [4 μ g/mL] zur Hemmung der Phagozytose
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma (St. Louis, MO)D2650Lösungsmittel für Cytochalasin D
[header]
Cell lysis buffer ingredients
Tris-buffered salz (TBS), 10x, pH 7,4BioRad (Hercules, CA)1706435für Zelllysepuffer
NatriumpyrophosphatSigma-Aldrich (St. Louis, MO)22136810 mM für Zelllysepuffer
NatriumdesoxycholatSigma-Aldrich (St. Louis, MO)D67500,5 % w/v für Zelllysepuffer
Natriumdodecylsulfat (SDS)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)L37710,1 % w/v für Zelllysepuffer
GlycerolSigma-Aldrich (St. Louis, MO)G551610% für Zelllysepuffer
NatriumfluoridSigma-Aldrich (St. Louis, MO)45002225 mM für Zelllysepuffer
Komplette Mini-EDTA-freie Proteasehemmer-CocktailtabletteRoche Diagnostics (Indianapolis, IN)4693159001für Zelllysepuffer, 1 Tablette pro 10 ml Puffer
Triton X-100Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)T878710% für Zelllysepuffer
Dithiothreitol (DTT)MP Biomedicals (Santa Ana, CA)11DTT000051 mM für Zelllysepuffer
Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF)MP Biomedicals (Santa Ana, CA)48002631 mM für Zelllysepuffer
NatriumorthovandateMP Biomedicals (Santa Ana, CA)215966410 mM für Zelllysepuffer
NameUnternehmenKatalogKommentare
Ausrüstung
Sorvall T6000B ZentrifugeDu Pont (Wilmington, DE)T6000B
Fisher Tissuemat, WasserbadFisher (Waltham, MA)
Sonic Dismembrator (Ultraschallgerät), Modell 100Fisher (Waltham, MA)
Verschiedenes
zur Bestimmung des Stadiums der Apoptose
Eppendorf Mikrozentrierröhrchen, 1,5 mLSigma-Aldrich (St. Louis, MO)T9661
Transwell permeable Halterung, 0,4 μ m Polycarbonat-MembranCorning (Corning, NY)3413steril, Polystyrol, Gewebekultur behandelt
NameUnternehmen<>KatalogKommentare
>Antikörper
Phosphoglykogensynthase-Kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyklonaler AntikörperCell Signaling Technology9331polyklonaler Kaninchen-Antikörper
Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) monoklonaler Antokörper ( (14C10) )Cell Signaling Technology2118monoklonaler Kaninchen-Antikörper
mit 100 mm Durchmesser, konischer Zellzählkammer, Neubauer Hawksley (Lancing, Sussex, UK)AC2000 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II Millipore (Billerica, MA)CBA059 für PI- und Annexin V-Färbung

Referenzen

  1. Galluzzi, L., et al. Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015. Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).
  2. Wallach, D., Kang, T. -B., Kovalenko, A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: a historical perspective. Nature Rev. Immunol. 14, 51-59 (2014).
  3. Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: Apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a008748(2013).
  4. Reddy, S. M., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2. J. Immunol. 169, 702-713 (2002).
  5. Cvetanovic, M., Ucker, D. S. Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition. J. Immunol. 172, 880-889 (2004).
  6. Patel, V. A., et al. Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: implications for the delayed clearance model of autoimmunity. J. Biol. Chem. 281, 4663-4670 (2006).
  7. Cvetanovic, M., et al. Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity. J. Biol. Chem. 281, 20055-20067 (2006).
  8. Birge, R. B., Ucker, D. S. Innate apoptotic immunity: the calming touch of death. Cell Death Differ. 15, 1096-1102 (2008).
  9. Patel, V. A., et al. Recognition of apoptotic cells by epithelial cells: conserved versus tissue-specific signaling responses. J. Biol. Chem. 285, 1829-1840 (2010).
  10. Patel, V. A., et al. Recognition-dependent signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms: implications for non-immune tissue homeostasis. J. Biol. Chem. 287, 13761-13777 (2012).
  11. Voll, R. E., Herrmann, M., Roth, E. A., Stach, C., Kalden, J. R., Girkontaite, I. Immunosuppressive effects of apoptotic cells. Nature. 390, 350-351 (1997).
  12. Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2, and PAF. J. Clin. Investig. 101, 890-898 (1998).
  13. Lucas, M., Stuart, L. M., Savill, J., Lacy-Hulbert, A. Apoptotic cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion. J. Immunol. 171, 2610-2615 (2003).
  14. Ariel, A., et al. Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during immune response resolution through modulation of CCR5 expression. Nature Immunol. 7 (11), 1209-1216 (2006).
  15. Schwab, J. M., Chiang, N., Arita, M., Serhan, C. N. Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes. Nature. 447, 869-874 (2007).
  16. Rothlin, C. V., Ghosh, S., Zuniga, E. I., Oldstone, M. B. A., Lemke, G. TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response. Cell. 131, 1124-1136 (2007).
  17. Li, F., et al. Apoptotic cells can activate the "phoenix rising" pathway to promote wound healing and tissue regeneration. Sci. Signal. 3, ra13(2010).
  18. Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15 (2010), 1007-1028 (2010).
  19. Patel, V. A., et al. Apoptotic cells activate AMPK and inhibit epithelial cell growth without change in intracellular energy stores. J. Biol. Chem. 290, 22352-22369 (2015).
  20. Hess, K. L., Tudor, K. -S. R. S., Johnson, J. D., Osati-Ashtiani, F., Askew, D. S. Cook-Mills J.M. Human and murine high endothelial venule cells phagocytose apoptotic leukocytes. Exp. Cell Res. 236, 404-411 (1997).
  21. Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Sci. Signal. 2, ra51(2009).
  22. Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
  23. Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nature Med. 13, 54-61 (2007).
  24. Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15, 1007-1028 (2010).
  25. Sinha, D., et al. Lithium activates the Wnt and phosphatidylinositol 3-kinase Akt signaling pathways to promote cell survival in the absence of soluble survival factors. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F703-F713 (2005).
  26. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5096-5100 (1991).
  27. Wakasugi, K., Schimmel, P. Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA-synthetase. Science. 284, 147-151 (1999).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Responder ZellenZellinteraktionGSK3 PhosphorylierungApoptose InduktionNekrose InduktionZellkulturprotokollPhagozytose Inhibitionphysische Interaktion
Identifizierung von intrazellulärer Induzierte in lebenden Zellen durch Interaktion Signalisierung mit Benachbarte Zellen, die eine programmierten Zelltods
Kontakt
Rückmeldung an Ihre Bibliothek

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.