Dieser Artikel beschreibt das Protokoll zur Kultivierung niedriger Dichte primären hippocampalen Neuronen wachsen auf Glasdeckgläschen über einen einschichtigen glial invertiert. Das Neuron und Glia-Schichten werden durch Paraffinwachsperlen abgetrennt. Die Neuronen durch diese Verfahren gezüchtet sind geeignet für hochauflösende optische Bildgebung und funktionelle Assays.
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Methodenartikel
Low-Density Primäre Hippocampus Kultur
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Fähigkeit, die Struktur und Physiologie der einzelnen Nervenzellen in Kultur zu untersuchen ist entscheidend für das Studium der Neurobiologie und ermöglicht Flexibilität bei der genetischen und chemischen Manipulation einzelner Zellen oder Netzwerk definiert. Eine solche einfache Manipulation in der reduzierten Kultursystem einfacher, wenn auf den intakten Hirngewebe verglichen. Während viele Verfahren zur Isolierung und Wachstum dieser primären Neuronen vorhanden sind, jeder hat seine eigenen Beschränkungen. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Kultivierung von niedriger Dichte und hohe Reinheit rodent embryonale Hippocampusneuronen auf Glasdeckgläschen, die dann über eine Monoschicht von Gliazellen suspendiert. Diese ‚Sandwich-Kultur‘ ermöglicht exklusives langfristiges Wachstum einer Population von Neuronen während von der darunterliegenden Glia einschichtigen für trophische Unterstützung ermöglicht. Wenn Neuronen ausreichenden Alters oder Reifegrad sind, können die Deckgläser werden in Neuronen Bildgebung oder funktionelle Assays klappt den glial dish und verwendet wird. Neurone grown durch dieses Verfahren typischerweise mehrere Wochen überleben und umfangreiche Dorne, synaptische Verbindungen entwickeln und Netzwerkeigenschaften.
Einleitung
Das Gehirn ist in komplizierte Netzwerke von Neuronen organisiert. Der Beitrag der einzelnen Neuronen zu Netzwerk-Aktivität und Funktion des Gehirns kann durch selektive Veränderung ihrer molekularen Zusammensetzung und perturbance ihrer physiologischen Eigenschaften untersucht werden. Genetische und chemische Manipulation einzelner Neuronen ist wohl einfacher in kultivierten Neuronen als in intakten Hirngeweben, unbelastet von dem zellulären Heterogenität und Komplexität des letzteren. Neurone in Kultur entwickelt wohldefinierte axonalen und dendritischen Dorne und miteinander umfangreiche synaptischen Verbindungen bilden.
Während Neuron....
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Protokoll
Alle Experimente und Protokolle Versuchstiere wurden von der University of Manitoba Tierethikkommission genehmigt und mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care-konform waren.
1. Herstellung von Instrumenten, Puffer und Lösungen
- Sterilisieren durch alle Dissektion Ausrüstung Autoklavierung, Glas Pasteur-Pipetten, Pipettenspitzen, Filtervorrichtung und deionisiertes Wasser.
- Vorbereiten einer 20% (w / v; 1,1 M) stock Glucoselösung in entionisiertem Wasser und Filter-Sterilisieren. Lagerung bei 4 ° C.
- Vorbereiten einer 100 mM Natriumpyruvat-Lösung in entionisiertem Wasser und Filter-Sterilisieren. ....
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Ergebnisse
In diesem „Sandwich“ -Methode von Primärnervenzellkultur wachsen Hippocampusneuronen (Figur 3) auf einem Bett von Gliazellen (Abbildung 1) , getrennt durch Paraffinkügelchen (Abbildung 2). Dadurch wird sichergestellt, dass Neuronen wächst selektiv auf Glasplättchen mit minimalen Gliazellen Kontamination aber eine angemessene trophische Unterstützung von Gliazellen auf der Gewebekulturschale wachsen. Typischerweise können Neuronen> 3 W.......
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Diskussion
Während das „Sandwich“ Verfahren zur Kultivierung Neuronen gut beschrieben worden ist , an anderer Stelle 2, 11, gibt es mehrere Schritte im gesamten Protokoll , das ziemlich schwer allein zu beschreiben , in Text, der für die Ermittler zu Frustration führen kann , die es annehmen wollen.
Glia-Kultur, Deck Vorbereitung und Neuron Kultur und Unterhaltung: Das Verfahren kann in drei großen Workflows unterteilt werden. Jede der drei Prä.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von CIHR MOP-142209 auf TJS unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Dissektionsinstrumente | |||
| Mikro-Präparierschere | Roboz | RS-5910 | |
| Mikro-Präparierfederschere | Roboz | RS-5650 | |
| Mikro-Präparierfederschere | Roboz | RS-5605 | |
| Dumont Pinzette | Roboz | RS-5045 | |
| Dumont Pinzette (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
| Name | >Company< | strong>Katalognummer | >Kommentare |
| Gewebepräparation | |||
| Trypsin (2.5%) | Gibco | 15-090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25-200-072 | |
| Swinnex Filterhalter, 25 mm | EMD | Millipore SX0002500 | Wird als Zellsieb verwendet. Zuerst mit Filter zusammenbauen und autoklavieren |
| Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | ||
| Hämozytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Grade 105 Linsenreinigungsgewebe | GE Healthcare | 2105-841 | Wird als Zellsieb verwendet. Zuerst in den Filterhalter einbauen und Autoklavieren |
| Glaspasteur-Pipetten mit Wattefilter | VWR | 14672-412 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
| Hank's Balanced Salt Solution ohne Calcium, Magnesium, Phenolrot (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
| Glaspasteur-Pipetten | VWR | 14672-380 | |
| Desoxyribonuklease I aus der bovinen Bauchspeicheldrüse (Dnase) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
| Butan-Bunsenbrenner | Wall-Lenk Mfg. Co. | Modell 65 | |
| Zentrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Name | Company | Katalognummer | Comments |
| Gewebekultur | |||
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | Gibco | 15-140-122 | |
| Petrischale (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Petrischale (60 mm) | Fisher | FB0875713A | |
| Pferdeserum | Gibco | 16050-122 | Kann anstelle von BGS verwendet werden, aber jede Charge muss aufgrund von Schwankungen zwischen den Chargen getestet werden. Eine Hitzeinaktivierung des Serums wird empfohlen. |
| Natriumhydroxid | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Natriumpyruvat | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Minimum Essentielles Medium (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
| Neurobasales Medium | Gibco | 21-103-049 | |
| L-Glutamin (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | Kann anstelle von L-Glutamin in der NBG-Medium |
| verwendet werden Kulturschale (60 mm) | Corning, Inc | 353002 | |
| Kulturflaschen (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
| Cytarabin (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| D-(+)-Glukose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Rinderwachstumsserum (BGS) | HyClone | SH3054103 | Vor Gebrauch wird eine Hitzeinaktivierung empfohlen. |
| B27 Supplement (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
| Kryofläschchen | VWR | 89094-806 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentansäure (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Name | Company | Katalognummer | Kommentare |
| Deckglas Vorbereitung | |||
| Natriumtetraborat-Decahydrat (Borax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
| Poly-L-Lysinhydrobromid | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Histoplast Paraffinwachs | Fisher | 22-900-700 | |
| Schwerkraft-Konvektionsofen | VWR | 89511-404 | Wird für eine alternative Deckglasreinigungsmethode verwendet, die im Protokoll |
| besprochen wird Ultraschallbad (Ultraschallgerät) | Fisher Scientific | 15337400 | |
| Salpetersäure-Anachämie | 62786-460 | ||
| Keramische Färbegestelle | Thomas Scientific | 8542E40 | Wird für eine alternative Deckglasreinigungsmethode verwendet, die im Protokoll besprochen wird |
| Deckgläser | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/18 | Hersteller ist sehr wichtig, da Neuronen nicht gut auf minderwertigem Glas haften |
| Borsäure | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| Name | Company | Katalognummer | Kommentare |
| >Verschiedenes | |||
| Sterile Spritzenfilter | VWR | 28145-477 | Verwendet mit BD-Spritze für Spritze zur Filtersterilisation |
| BD | 302832 | Zur Verwendung mit VWR sterilen Spritzenvorsatzfiltern für die Fliter-Sterilisation | |
| Wasserbad | Fisher Scientific | 15-460-16Q | |
| Inverses | Mikroskop Olympus | CKX41 | |
| 15 mL Konische sterile Zentrifugenröhrchen | ThermoScientific | 339650 | |
| Konische 50 mL Konische sterile Zentrifugenröhrchen | ThermoScientific | 339652 |
Referenzen
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-425 (1977).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Adamantidis, A., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
