Methodenartikel

Drosophila Vorbereitung und Longitudinal Imaging der Herzfunktion in vivo unter Verwendung optischer Kohärenzmikroskopie (OCM)

DOI:

10.3791/55002

⸱

12. Dezember 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Bioengineering Program, Lehigh University, 2Center for Photonics and Nanoelectronics, Lehigh University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Lehigh University, 4State Key Laboratory of Software Engineering, Wuhan University, 5Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier werden die experimentellen Protokolle für die Vorbereitung von Drosophila in verschiedenen Entwicklungsstadien und die Durchführung einer optischen Längsschnittbildgebung von Drosophila-Herzschlägen mit einem speziellen optischen Kohärenzmikroskopie-System (OCM) beschrieben. Die morphologischen und dynamischen Veränderungen des Herzens können durch die Analyse der strukturellen und funktionellen Parameter des Herzens aus OCM-Bildern quantitativ charakterisiert werden.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Längsschnittuntersuchung des Herzschlags bei Kleintieren trägt zum Verständnis struktureller und funktioneller Veränderungen während der Herzentwicklung bei. Die optische Kohärenzmikroskopie (OCM) hat sich als fähig erwiesen, Kleintierherzen mit hoher räumlicher Auflösung und ultrahoher Bildgebungsgeschwindigkeit abzubilden. Der hohe Bildkontrast und die nicht-invasiven Eigenschaften machen OCM ideal für die Durchführung von Längsschnittstudien, ohne dass Gewebedissektionen oder Färbungen erforderlich sind. Drosophila wurde aufgrund ihrer hohen Anzahl orthologer menschlicher Krankheitsgene, ihrer Ähnlichkeit der molekularen Mechanismen und genetischen Signalwege mit Wirbeltieren, ihres kurzen Lebenszyklus und ihrer geringen Kulturkosten häufig als Modellorganismus in kardialen Entwicklungsstudien verwendet. Hier werden die experimentellen Protokolle für die Präparation von Drosophila und die optische Bildgebung des Herzschlags mit einem kundenspezifischen OCM-System über den gesamten Lebenszyklus der Probe beschrieben. Wenn Sie die in diesem Bericht beschriebenen Schritte befolgen, können transversale M-Mode- und 3D-OCM-Bilder aufgenommen werden, um Längsschnittstudien der kardialen Morphologie und Funktion der Drosophila durchzuführen. Die OCM-Bilder auf der Fläche und in axialen Schnitten sowie die Histogramme der Herzfrequenz (HR) und der Herzaktivitätsperiode (CAP) wurden ebenfalls gezeigt, um die strukturellen Veränderungen des Herzens zu analysieren und die Herzdynamik während der Drosophila-Metamorphose zu quantifizieren, kombiniert mit den Videos, die mit M-Mode-Bildern erstellt wurden, um die Herzaktivität intuitiv zu verfolgen. Aufgrund der genetischen Ähnlichkeit zwischen Drosophila und Wirbeltieren könnte eine Längsschnittuntersuchung der Herzmorphologie und -dynamik bei Fruchtfliegen dazu beitragen, die Ursprünge menschlicher Herzkrankheiten aufzudecken. Das Protokoll hier würde eine effektive Methode bieten, um eine breite Palette von Studien durchzuführen, um die Mechanismen von Herzerkrankungen beim Menschen zu verstehen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Langzeitstudie des Herzens bei Kleintieren trägt eine Vielzahl von menschlichen verwandte kardiovaskuläre Erkrankungen zu verstehen, wie Gen - 1,2 angeborener Herzfehler bezogen. In den vergangenen Jahrzehnten von verschiedenen Tiermodellen, wie Maus 3,4, Xenopus 5,6, Zebrabärbling 7,8, Vogel- 9 und Drosophila 10-16, wurden verwendet , das menschliche Herz-Entwicklung im Zusammenhang mit Forschung zu betreiben. Das Maus - Modell wurde in großem Umfang mit dem menschlichen Herzen 3,4 studieren normalen und abnormalen Herzentwicklung und Herzfehler Phänotypen aufgrund ihrer Ähnlichkeiten verwendet. Der Embryo Xenopus ist besonders nützlich bei der Untersuchung der Herzentwicklung aufgrund seiner einfachen Handhabung und Teiltransparenz 5,6. Die Transparenz des Embryos und der frühen Larve des Zebrabärbling - Modell ermöglicht eine einfache optische Beobachtung der Herzentwicklung 7,8. Das aviäre Modell ist ein gemeinsames Thema Entwicklungsherz Studien because kann das Herz leicht , nachdem sie die Eischalen Entfernen zugegriffen werden und die morphologische Ähnlichkeit der aviären Herzen auf den Menschen 9. Das Drosophila - Modell hat einige einzigartige Eigenschaften , die es ideal für die Durchführung Längsschnittstudien des Herzens zu machen. Erstens ist das Herz Rohr Drosophila ~ 200 & mgr; m unterhalb der dorsalen Oberfläche, die Bequemlichkeit für den optischen Zugang und die Beobachtung des Herzens liefert. Zusätzlich sind viele molekulare Mechanismen und genetischen Pfade zwischen Drosophila und Wirbeltieren konserviert. Die Orthologe von über 75% der menschlichen Krankheitsgene wurden in Drosophila gefunden , die es weithin 11,13 in transgenen Studien gemacht. Darüber hinaus hat sie eine kurze Lebensdauer und geringe Wartungskosten und 14-16 für Entwicklungsbiologie Forschung häufig verwendet als Mustermodell wurde.

In früheren Berichten beschrieben , die Protokolle zur Überwachung Drosophila Herzfunktionen wie erArtbeat. Jedoch wurden Verfahren Dissektion erforderlich 17,18. Optisches Abbildungs ​​bietet einen effektiven Weg Herzentwicklung bei Tieren aufgrund seiner nicht-invasive Natur zu visualisieren. Unterschiedliche optische Bildgebungsverfahren wurden bei der Durchführung von Tierherzstudie, wie Zwei-Photonen - Mikroskopie 19, konfokale Mikroskopie 20,21, Lichtbogenmikroskopie 22 und die optische Kohärenztomographie (OCT) 16,23-26 angewendet. Vergleichsweise ist Oktober der Lage große Bildtiefe in Kleintierherzen Bereitstellung ohne Kontrastmittel verwendet werden, während eine hohe Auflösung und das einen extrem hohen Bildgebungsgeschwindigkeit zu halten, die für die Bildgebung wichtig sind lebende Tiere. Darüber hinaus hat die niedrige Kosten ein OCT-System für die Entwicklung dieser Technik zur optischen Abbildung von Proben populär. Oktober wurde für die Langzeitstudie von Drosophila erfolgreich eingesetzt. Unter Verwendung Oktober hat Herz-morphologische und funktionelle Bildgebung der Herzstrukturen zu studieren, die Func ausgeführt worden isttionale Rollen von Genen, und die Mechanismen kardiovaskulärer Defekte in mutant Modelle während der Herzentwicklung. Zum Beispiel altersabhängige Abnahme der Herzfunktion wurde mit herunterreguliert Angiotensin-Converting - Enzym-bezogenen (ACER) Gen in Drosophila mit 27. Oktober bestätigt. Phänotypisierung von Gen im Zusammenhang mit Kardiomyopathie wurde in Drosophila mit Oktober 28-33 demonstriert. Forschung unter Verwendung von Oktober zeigte auch die funktionelle Rolle des menschlichen SOX5 Gen im Herzen von Drosophila 34. Im Vergleich zu Oktober verwendet OCM ein Objektiv mit einer höheren numerischen Apertur bessere Quer Auflösung bereitzustellen. In der Vergangenheit führte die Fehlfunktion des Herzens durch ein Ortholog menschlichen zirkadianen Gen dCry / dclock Silencing wurde mit einem benutzerdefinierten OCM - System 15,16 studierte, sowie den Effekt der fett-Diät auf Kardiomyopathien in Drosophila Fettleibigkeit induzierten Mensch zu verstehen Herzerkrankungen. 15

Hier the experimentelle Protokoll wird auf den zweiten Häutungsstadium (L2), dritten Häutungsstadium (L3), puppen Tag 1 (PD1), puppen Tag 2 (PD2), puppen Tag 3 (PD3) für Langzeitstudie der Herz morphologische und funktionelle Veränderungen in Drosophila zusammengefasst , Puppe Tag 4 (PD4), Puppe Tag 5 (PD5) und Erwachsenen (Abbildung 1) mit OCM Untersuchung der menschlichen bezogenen kongenitalen Herzerkrankungen zu erleichtern. Herzfunktionsparameter, wie HR und GAP wurden in verschiedenen Entwicklungsstadien quantitativ analysiert, um die Herzentwicklung Merkmale offenbaren.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Herstellung von OCM - System für die optische Bildgebung von Drosophila 16

  1. Wählen Sie ein Spektrometer und ein Hochgeschwindigkeits - Zeilenkamera , die eine Bildrate von mindestens 80 Bilder / s bereitstellt , so wird das OCM System in der Lage sein , den Herzschlag von Drosophila zu lösen.
  2. Verwenden , um eine Breitbandlichtquelle , die axiale Auflösung von 2 & mgr; m , um sicherzustellen , das Herz Struktur Drosophila zu identifizieren.
  3. Verwenden Sie ein 10X-Objektiv eine hohe Quer Auflösung zu erhalten.
  4. Verwenden Sie einen 45 ° Stabspiegel des Referenzarmes Lichtstrahl zu reflektieren und einen ringförmigen Probenarm Lichtstrahl zu erzeugen, um die Tiefenschärfe in den Proben zu verlängern.
  5. Entwickeln Sie eine benutzerdefinierte Computerprogramm das OCM-System zur Steuerung und Messungen durchführen.

2. Drosophila Kultur

  1. Standard - Fly Essenszubereitung
    1. Setzen Sie ~ 5 ml Instant Drosophila Formel in eine Polystyrol FläschchenRohr mit Hilfe eines Papierschacht ein.
    2. Gießen ~ 8 ml Wasser in die Formel richtig die Nahrung sättigen.
    3. In verschiedenen Ergänzungen zur Standardfliegenfutter für verschiedene Experimente. Wenn für all - trans - Retinal (ATR) Nahrung für die optogenetische Vorbereitung Experiment Stimulation 35, verwenden Sie eine Pipette 100 mM ATR zu extrahieren und in ~ 8 ml Wasser auflösen , um die ATR - Konzentration von 1 mM in Essen. Nachdem die Lösung gleichmäßig mischen, gießen Sie die Lösung in die Formel und rühren Sie es ausreichend.
    4. Eine fettreiche Diät-für die Untersuchung im Zusammenhang mit Fettleibigkeit Herzstörungen in Drosophila, 10,15 Mix ~ 10 ml Formel mit 15 ml Wasser in eine Tasse und Hitze für 30 Sekunden in der Mikrowelle zuzubereiten. Setzen Sie etwas kaltgepresstes Bio-Kokosöl in einem anderen Becher und erhitzen Sie es für 90 Sekunden in der Mikrowelle.
    5. Extrakt 7,5 ml Kokosöl und mischen sich mit dem vorbereiteten Formel ausreichend, das Gewicht / Volumen-Verhältnis von Kokosöl zu Nahrungsmitteln zu machen ~ 30/100 und then-Extrakt ~ 2 ml gemischt Lebensmittel und legte es aus einem Rohr nach unten.
    6. Warten Sie 1 Minute, bis das Medium gründlich gesättigt ist. Komprimieren Sie die Lebensmittel sorgfältig mit einer flachen Oberfläche , die Lebensbedingungen für die Drosophila zu optimieren. In 6 - 8 Körner von Hefe auf die vorbereitete Formel, und schließen Sie das Rohr mit einem Cluster von Baumwolle.
  2. Fruchtfliegen - Kreuze und Kultur
    1. Nehmen Sie einen Schlauch mit vorbereiteten Standard-Fliegen Essen, und entfernen Sie die eingesteckt Baumwolle. übertragen Sie vorsichtig die erwachsenen Fliegen (männlich und weiblich) mit dem Rohr, und stecken Sie sofort das Rohr mit Baumwolle. Überprüfen Sie die Baumwolle, um sicherzustellen, dass es keine Lücke zwischen der Baumwolle und der Rohrwand zu verhindern Fliegen aus aus dem Rohr austritt.
    2. Halten Sie die Fruchtfliegen im Inkubator bei 25 ° C für Einkreuzungen. Die meisten der Gene aktiv sind und die zellulären Proteine werden bei 25 ° C 36-39 synthetisiert.
    3. Nehmen Sie den Schlauch aus dem Inkubator aus nach 8 Hand Übertragung der eindult fliegt aus der Röhre, die Eier in ähnlichem Alter für experimentelle Kontrolle zu erhalten.
    4. Weiterhin die Eier Kultivierung im Brutschrank bei 25 ° C, die für Drosophila - Entwicklung mit der Entwicklungszeit 8,5 Tage 40,41 der Standardtemperatur ist.
      HINWEIS: Die Temperatur beeinflusst die Entwicklungszeit (Ei bis zum erwachsenen) und Expression von verschiedenen Genen.

3. Durchführung Optical Imaging mit OCM

  1. Berg Fly Larve für Optical Imaging
    ANMERKUNG: Das Ei von Drosophila Schraffuren in 22 bis 24 Stunden bei 25 ° C zu der ersten instar Larven (L1). Die zweite Larvenstadium tritt nach weiteren 24 Stunden. Die größte Larvenform ist das dritte Larvenstadium, die nach etwa 24 Stunden häutet. Strukturmerkmale in Larve kann verwendet werden, um ihre verschiedenen Entwicklungsstadien unterscheiden. Die Größe der Mundwerkzeuge zwischen dem ersten und dem zweiten instar instar unterscheidet. Der MundHaken der ersten instar Larven sind sehr klein und sehen aus wie zwei Paare von winzigen schwarzen Punkten, während die Mundhaken des zweiten Larvenstadium sind größer und die Struktur ist klarer. Die Stigmen sind in der Regel verwendet, um die zweite instar und den dritten Häutungsstadium zu identifizieren. Die zweite Larvenstadium hat vorderen Stigmen geprügelt, während für das dritte Larvenstadium, die vorderen Stigmen verzweigt sind. Ein dunkelorange Ring beginnt an der Spitze der hinteren Stigmen im dritten Larvenstadium zu erscheinen.
    1. Tragen Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband an einem sauberen Mikroskop Objektträger aus Glas. Vertreibt die Luftblasen unter dem Band die Reflexionen durch Luftblasen während der Bildgebung zu vermeiden.
    2. Nehmen Sie eine der Röhren mit den gezüchteten Fliegen aus dem Inkubator im Larvenstadium.
    3. Identifizieren Sie die Larve in den Medien, entfernen Sie sie aus den Medien mit einer weichen Bürste und auf einem sauberen Tuch. Entfernen Sie alle an die Larve stecken Essen mit einem feuchten weichen Bürste und trocknen Sie sie auf das Gewebe.
    4. Bewegen Sie den cleaneauf ein Gewebe unter der Objektivlinse eines Weitfeld-Mikroskop d fliegen.
    5. Stellen Sie den Fokus des Mikroskops eine klare Sicht auf die Fliege zu finden. Identifizieren Sie die richtigen Entwicklungsstadium der Larve durch seine strukturellen Eigenschaften mit dem Mikroskop.
    6. Positionieren Sie die Fliege den weichen Bürste. Sicherstellen, dass der Körper gerade mit der Rückenseite nach oben weist zur Montage auf dem Glasobjektträger von der dorsalen Seite vorzubereiten. Führen Sie diesen Schritt unter dem Mikroskop.
    7. Achten Sie darauf, die Larve vor der Montage auf dem Band vollständig trocken ist. Andernfalls wird die Larve nicht auf dem Band haften.
    8. Kleben Sie die Rückenseite des positionierten Fliege zum doppelseitigen Klebeband auf dem Glasträger mit mäßigem Druck. Beachten Sie, dass zu viel Druck kann die Fliege und zu wenig Kraft zu töten führen Bewegung während der Bildgebung zu fliegen.
  2. Optical Imaging von Drosophila an Larvalstadien (L2 und L3) mit OCM
    HINWEIS: Eine breite Lumen des Herzens Rohr fo sein kannund befindet sich in den Segmenten zwischen A5 bis A8 in den Larvenstadien (Abbildung 1). Die Quer OCM M-Modus-Bilder (2D + Zeit) wurden für jede Larve im A7 Segment des Herzrohr erfasst den systolischen und diastolischen Analyse zu erleichtern.
    1. Platzieren Sie die montierte Larve auf die einstellbare Probenstufe des OCM System entlang der Y-Querrichtung mit der Rückenseite nach oben weisend unterhalb der Objektivlinse. Ein kleines Loch in der Probentisch ist zum Platzieren der Larve notwendig sein Kontakt mit der Tischebene zu vermeiden.
    2. Stellen Sie den Probentisch das Herz Rohr der Fruchtfliege zu der Brennebene des Abbildungsstrahls zu bewegen. Um bequem die A7-Segment zu finden, finden Sie den hinteren Bereich des Herzens Rohr mit dem Echtzeit-Querschnitts OCM Bilder in der Bilderfassungssoftware. Dann bewegen uns auf die Bühne, bis die A7 Segment sichtbar ist.
    3. Die Parameter der Bildaufnahme-Software auf 100 A-Scans pro B-Scan (Rahmen), 100 B-Scans und die scanner Spannung zu bedecken ~ 0,28 mm in der x-Querrichtung, und 0 V in der Y-Querrichtung. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Start" in der Software, um die Hintergrundrauschen Daten für Untergrundsubtraktion zu erwerben, indem die Probe Strahlengang mit einem dunklen Tuch blockiert.
      HINWEIS: 3 der 100 Rahmen für den Hintergrundabzug verwendet werden.
    4. Set Parameter der Datenerfassungs-Software zu 128 A-Scans pro B-Scan, 4096 B-Scans und der Scannerspannung abzudecken ~ 0,28 mm in der x-Querrichtung, und 0 V in der Y-Querrichtung. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Start" in der Software , die Quer M-Modus Bilder über das A7 - Segment des Fliegenherzrohr über einen Bereich zu erwerben Abdeckung 0,28 x 0,57 mm 2 für etwa 30 Sekunden.
    5. Blockieren Sie den Abbildungsstrahl ein dunkles Tuch während der Datenspeichervorgang mit längerer Einwirkung der Fliege Herz dem Abbildungslicht zu vermeiden.
    6. Wiederholen Sie die Messung für 5 mal zuverlässige Messung der Herz Spaß zu bekommenction.
    7. Set Parameter der Bildaufnahme-Software zu 400 A-Scans pro B-scan, 800 B-Scans und der Scannerspannung abzudecken ~ 1,7 mm in der x-Querrichtung, und ~ 4 mm in der Y-Querrichtung. Bewegen Sie die Bühne in beiden Richtungen die ganze Fruchtfliege, um sicherzustellen, können abgebildet werden. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Start" in der Software einen Datensatz zu erwerben Bilder von der Fruchtfliege in 3 Dimensionen zu erhalten. Hinweis: Die 3D-Struktur fliegen kann gemacht werden mit Amira 3D-Software
    8. Verwenden Sie einen feuchten weichen Bürste die gemessene Fliege zu befeuchten und vorsichtig aus dem Glasobjektträger zu entfernen. Bewegen Sie es in ein separates Rohr für die kontinuierliche Entwicklung. Das Röhrchen für Langzeitstudie über die nächsten Entwicklungsstufen.
  3. Bild Drosophila bei Puppenstadien
    HINWEIS: Alle Fruchtfliegen wurden für die Bildgebung von PD1 bis PD5 entnommen. Wie in der schematischen Larve in 1b gezeigt ist , verbleibt ein breites Lumen in A5 bis A8 Segmenten the Herz Rohr bis PD1. Von PD2, beginnt eine konische Kammer zwischen A1 bis A4 Segmente zu entwickeln. Um konsistente Bilder erwerben und Herzanalyse, quer M-Modus - Bilder wurden von der A7 Segment PD1 erhalten und von der A1 - Segment nach PD2 wie gekennzeichnet in 1b erleichtern.
    1. Bild Drosophila bei PD1
      HINWEIS: Drosophila wird eine weiße Puparium für eine kurze Zeitfenster haben ( das 0 - 1 h) während PD1. Dieses Zeitfenster ist ideal für die optische Abbildung des frühen pupa Durchführung, da die hohe Transparenz zu einer höheren Lichteinfall für die OCM-Bildgebung führt.
      1. Da die Fruchtfliegen an der Rohrwand gefunden werden, wenn sie Puppe geworden, mit einem feuchten weichen Bürste, die Puppe aus einzelnen Rohren für die Bildgebung bei PD1 entfernen und die Puppe mit der Bürste reinigen, wenn es Nahrung für den Körper geklebt ist.
      2. Montieren Sie die Fruchtfliege auf einem kleinen Glasobjektträger direkt mit dem nassen Pinsel und halten Sie die Rückenseite nach oben zeigt (Abbildung 1a
      3. Überschüssiges Wasser von der Seite des Flugkörpers.
      4. Setzen Sie den Glasobjektträger auf der Probenbühne des OCM-System, halten die Fruchtfliege an der Spitze. Finden klare Echtzeit-Bild des A7 Segment der Fliege Herz die gleiche Strategie in der Larve Messung beschrieben verwendet.
      5. Stellen Sie die gleichen Parameter der Datenerfassungs-Software, wie in Abschnitt 3.2 und Bild die Herzschläge an der A7 Segment quer M-Modus und 3D-Bilder zu erwerben.
      6. Nach der Bebilderung verwenden eine Pinzette die Glasobjektträger mit Puppe zu legen zurück in das Rohr für die kontinuierliche Kultur.
    2. Bild Drosophila bei PD2 bis PD5 Stages
      HINWEIS: Da die Probe mehr und mehr opak während der Puppenstadien wird, wird die Eindringtiefe des Abbildungssystems reduziert.
      1. Verwenden Sie eine Pinzette vorsichtig das Glas s entfernenLiDE montiert mit der Fliege an PD2 aus der Tube für die Bildgebung. Bei PD2, wird die Probenschale gelblich und der Körper wird weniger transparent gegenüber PD1 (Abbildung 1).
      2. Setzen Sie den Schieber auf der Probenbühne des OCM-System.
      3. Stellen Sie die Probenbühne die Fliege in der Brennebene des Abbildungsstrahlen des OCM-System zu bewegen. Finden Sie das vordere Ende des Herzschlauches mit Echtzeit-Querschnitts OCM Bild. Bewegen Sie ~ 50 & mgr; m zurück in die hintere Richtung der A1-Segment des Herzschlauches zu finden.
        HINWEIS: An diesem Punkt der Herzentwicklung (PD2), wird die konische Kammer sehr klein sein und nicht zu schlagen sein.
      4. Sammeln Quer M-Modus-Datensätze aus dem A1-Segment als auch 3D-Daten der gleichen Methode wie in früheren Entwicklungsstufen verwendet wird.
      5. Setzen Sie den Schlitten zurück in die Röhre vorsichtig für eine kontinuierliche Kultur.
        HINWEIS: Bei PD3, die Farbe der Probe in der Schale ist dunkler als die bei PD2 Stufe. Bei PD4 Bühne, ca schwarzen Streifenn innerhalb der Schale der Proben beobachtet werden. Einige Fliegen entwickeln in Erwachsenen aus dieser Phase in den nächsten Tag, während andere in PD5 entwickeln wird. Bei PD5 Stadium sind schwarze Streifen noch offensichtlich in den Fruchtfliegen gesehen. Diese Fliegen werden Erwachsene in den nächsten Tag werden.
  4. Bild Drosophila an der Volksbühnen
    HINWEIS: Bei adulten Stadium, weibliche und männliche Fliegen können durch die Größe des Körpers und der Farbe des Unterleibs zu unterscheiden. Weibliche Erwachsene haben größere Größe, während die Männchen sind kleiner und dunkel gefärbten in den Unterleib.
    1. Nehmen Sie den Schlauch aus dem Inkubator, wenn die Fruchtfliege in einen Erwachsenen entwickelt und übertragen die Erwachsenen zu einer ~ 45 ml Fläschchen leer fliegen.
    2. Tauchen Sie das saugfähige Ende (ca. 1 cm Länge, ca. 3 mm Durchmesser) eines Zauberstab in die Anästhesie, legte den Stab in das Fläschchen, und stecken Sie das Rohr mit einem Cluster von Baumwolle das Anästhetikum Ende zu halten, knapp unterhalb der gesteckten Baumwolle und anesthetize die Fliege für 3 min. Die Dauer der Anästhesie hängt von der Größe der Fliege, und kann zwischen 2,5 bis 3,5 min variieren (zum Beispiel: männlich für 2,5 min, weiblich für 3 oder 3,5 min).
    3. Vorbereiten eines Glasobjektträger mit einem Stück doppelseitigem Klebeband.
    4. Bewegen Sie den narkotisierten Fliege auf dem Glasobjektträger mit Rückenseite nach oben zeigt die weichen Bürste.
    5. Trennen Sie die Flügel eine Pinzette mit und halten die Flügel auf dem Band unter dem Mikroskop die Fliege zu fixieren und den Herzbereich für die Bildgebung aus.
    6. Bild die Fliege von der A1 - Segment der Fliege Herz (Abbildung 1). Am Ende des Experiments kann die fly geopfert werden.

4. Imaging - Analyse 16

  1. Entwickeln Sie Matlab-Programme, die 2D- und 3D-Binär-Dateien mit dem Bildaufnahme-Software zur Bilddateien gesammelt zu konvertieren.
  2. Verwenden Sie ImageJ das Herz Rohrbereich in den Quer M-Modus-Bilder und einen Zauberstab Algorithmus zur Identifizierung createa Maske des Herzbereich für jeden Quer M-Modus-Bild. Segment den maskierten Bereich und mit einem Spitzenfindungsalgorithmus die systolischen und diastolischen Stellen zu identifizieren. Berechnen Sie die zeitabhängigen Herzdurchmesseränderungen von den Quer M-Modus-Bilder.
  3. Basierend auf den erfassten zeitabhängigen Herz Durchmesser, berechnen die Herzparameter wie HR, Herzaktivitätsperiode (CAP), Ende der Diastole Durchmesser (EDD), Ende der Systole Durchmesser (ESD), Ende der Diastole Bereich (EDA) und Systole Bereich Ende ( ESA). Berechnen Sie die fraktionelle Verkürzung (FS) mit figure-protocol-1
  4. Verwenden Sie ImageJ die 3D-OCM Bilder zu analysieren, um die strukturelle Entwicklung der Fliege Herz zu visualisieren.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Längsherzbildgebung wurde mit dem 24B-GAL4 / + Dehnung bei Raumtemperatur mit OCM mit den Fruchtfliegen durchgeführt. Messungen wurden bei L2, L3, und bei 8 Stunden Intervallen von PD1 bis PD4 und Erwachsenen Tag 1 durchgeführt (AD1) die Metamorphose - Verfahren (Tabelle 1) zu verfolgen. Larve, früh puppen, späte Puppe und erwachsenen Fliegen wurden auf den Glasobjektträger aufgebracht , wie in 1A gesehen. Die Segmentmerkmale des Herzens für Larven und erwachsenen Fliegen wurden in ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die schnellen Herzschlag von Drosophila, mit einem Maximum HR rund 400 bpm bei Larven und adulte Stadien, erfordert eine hohe Abbildungsgeschwindigkeit der Herz Diastolen und Extrasystolen (nicht weniger als 80 Bilder / s auf den Erfahrungen basiert) zu lösen. Aufgrund der geringen Größe und Herzkammer micron Skala Herzwanddicke (von 5 bis 10 & mgr; m), eine hohe räumliche Auflösung (besser als 2 & mgr; m) wird zur Lösung der Herzrohrstrukturen erforderlich. In dieser Studie wurde eine hohe Auflösung un...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit der aktuellen Studie gibt.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde unterstützt vom Lehigh University Start-Up Fund, dem NIH (R00EB010071 zu C.Z., R15EB019704 zu C.Z. und A.L., R03AR063271 zu A.L. und R01AG014713 und R01MH060009 zu R.E.T.), der NSF (1455613 zu C.Z. und A.L.), dem Cure Alzheimer's Fund (zu R.E.T.) und dem Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award an A.L.). M.C. und Y.M. wurde unterstützt durch das National Key Basic Research Program China (973-Programm) unter der Fördernummer 2014CB340404.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Kundenspezifisches OCM-BildgebungssystemEntwickelt in unserem Labor
my Temp Mini Digital IncubatorBenchmarkH2200-HC
DeckglasAmScope200PCS
Cotton BallRITE AID
Instant Drosophila FormulaCAROLINAformula 4-24
HefeActiveDry
MikroskopSONYWILD M420
BürsteLoew-Cornell245Bzum Bewegen von Proben
Labview-SoftwareNational Instruments
ImageJNational Institutes of Health
MatlabMathworks
PinzetteWihaAA SAzum Fixieren der Früchte FlyWings
FlyNapCarolina Biological Supply Company4.224.898
Scotch Permanent Doppelseitiges Klebeband, 3 mScotch
PipetteFisherbrandMU18837
Organic Extra Coconut OilSpring Valley13183
ObjektträgerCapitolBrandM3504-E
DrosophilaFläschchenSEOH8401SS
All-trans-retinalSigma-Aldrich Co.R2500

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223 (1), 169-180 (2000).
  2. Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev. Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
  3. Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and man. Physiol. Genomics. 15 (3), 165-176 (2003).
  4. Savolainen, S. M., Foley, J. F., Elmore, S. A. Histology atlas of the developing mouse heart with emphasis on E11.5 to E18.5. Toxicol. Pathol. 37 (4), 395-414 (2009).
  5. Yang, V. X. D., et al. High speed, wide velocity dynamic range Doppler optical coherence tomography (Part II): Imaging in vivo cardiac dynamics of Xenopus laevis. Opt. Express. 11 (14), 1650-1658 (2003).
  6. Yelin, R., et al. Multimodality optical imaging of embryonic heart microstructure. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064021(2007).
  7. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc. Res. 91 (2), 279-288 (2011).
  8. Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Annu. Rev. Genet. 46, 397-418 (2012).
  9. Drake, V. J., Koprowski, S. L., Lough, J. W., Smith, S. M. Gastrulating chick embryo as a model for evaluating teratogenicity: a comparison of three approaches. Birth Defects Res. A. 76 (1), 66-71 (2006).
  10. Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12 (5), 533-544 (2010).
  11. Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends in Cardiovas. Med. 5 (1), 21-28 (1995).
  12. Harvey, R. P. Nk-2homeobox genes and heart development. Dev. Biol. 178 (2), 203-216 (1996).
  13. Bodmer, R., Venkatesh, T. V. Heart development in Drosophila and vertebrates: conservation of molecular mechanisms. Dev Genet. 22 (3), 181-186 (1998).
  14. Cripps, R. M., Olson, E. N. Control of cardiac development by an evolutionarily conserved transcriptional network. Dev. Biol. 246 (1), 14-28 (2002).
  15. Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. J. Sel. Top. Quantum Electron. 22 (4), 6803213(2016).
  16. Alex, A., et al. A circadian clock gene, Cry, affects heart morphogenesis and function in Drosophila as revealed by optical coherence microscopy. PloS one. 10 (9), e0137236(2015).
  17. Vogler, G., Ocorr, K. Visualizing the beating heart in Drosophila. J Vis Exp. (31), e1425(2009).
  18. Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. J Vis Exp. (33), e1425(2009).
  19. Yalcin, H. C., et al. Two-photon microscopy-guided femtosecond-laser photoablation of avian cardiogenesis: noninvasive creation of localized heart defects. Am. J. Physiol. Heart C. 299 (5), H1728-H1735 (2010).
  20. Dolber, P. C., Spach, M. S. Conventional and confocal fluorescence microscopy of collagen fibers in the heart. J. Histochem. Cytochem. 41 (3), 465-469 (1993).
  21. Mao, H., Gribble, M., Pertsov, A. M., Wang, L., Shi, P. Understanding embryonic heart morphogenesis through automatic segmentation and confocal imaging with optical clearing. ISBI. , 1303-1306 (2014).
  22. Bouchard, M. B., et al. Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms. Nat. Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
  23. Boppart, S. A., et al. Noninvasive assessment of the developing Xenopus cardiovascular system using optical coherence tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (9), 4256-4261 (1997).
  24. Kagemann, L., et al. Repeated, noninvasive, high resolution spectral domain optical coherence tomography imaging of zebrafish embryos. Molecular Vision. 14, 2157-2170 (2008).
  25. Jenkins, M. W., et al. Ultrahigh-speed optical coherence tomography imaging and visualization of the embryonic avian heart using a buffered Fourier Domain Mode Locked laser. Opt. Express. 15 (10), 6251-6267 (2007).
  26. Larin, K. V., Larina, I. V., Liebling, M., Dickinson, M. E. Live imaging of early developmental processes in mammalian embryos with optical coherence tomography. J. Innov. Opt. Health Sci. 2 (03), 253-259 (2009).
  27. Liao, F. -T., Chang, C. -Y., Su, M. -T., Kuo, W. -C. Necessity of angiotensin-converting enzyme-related gene for cardiac functions and longevity of Drosophila melanogaster assessed by optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 19 (1), 011014(2014).
  28. Wolf, M. J., et al. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (5), 1394-1399 (2006).
  29. Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114 (2), e35-e36 (2006).
  30. Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Curr. Alzheimer Res. 8 (3), 313(2011).
  31. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B., Tearney, G. J. Heart wall velocimetry and exogenous contrast-based cardiac flow imaging in Drosophila melanogaster using Doppler optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 15 (5), 056020(2010).
  32. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Dis. Model. Mech. 4 (3), 411-420 (2011).
  33. Tsai, M. T., et al. Noninvasive imaging of heart chamber in Drosophila with dual-beam optical coherence tomography. J. Biophotonics. 6 (9), 708-717 (2013).
  34. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Hum. Mol. Genet. 22 (18), 3798-3806 (2013).
  35. Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Sci. Adv. 1 (9), e1500639(2015).
  36. Mirault, M. E., Goldschmidt-Clermont, M., Moran, L., Arrigo, A. P., Tissieres, A. The effect of heat shock on gene expression in Drosophila melanogaster. IEEE T. Med. Imaging. 42, 819-827 (1978).
  37. Boothroyd, C. E., Wijnen, H., Naef, F., Saez, L., Young, M. W. Integration of Light and Temperature in the Regulation of Circadian Gene Expression in Drosophila. PLoS Genet. 3 (4), (2007).
  38. McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20 (8), 384-391 (2004).
  39. Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
  40. Ashburner, M., Thompson, J. N. Jr Laboratory culture of Drosophila. 2a, Academic Press. London. 1-109 (1978).
  41. Ashburner, M. Drosophila: a laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1978).
  42. Molina, M. R., Ostia Cripps, R. M. the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech. Dev. 109 (1), 51-59 (2001).
  43. Monier, B., Astier, M., Sémériva, M., Perrin, L. Steroid-dependent modification of Hox function drives myocyte reprogramming in the Drosophila heart. Development. 132 (23), 5283-5293 (2005).
  44. Liu, L., et al. Imaging the subcellular structure of human coronary atherosclerosis using micro-optical coherence tomography. Nat. Med. 17 (8), 1010-1014 (2011).
  45. Ahsen, O. O., et al. Swept source optical coherence microscopy using a 1310 nm VCSEL light source. Opt. Express. 21 (15), 18021-18033 (2013).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Drosophila HerzBildgebung der Herzfunktiontransversaler M Mode3D OCM BildgebungQuantifizierung der HerzfrequenzPeriode der Herzaktivit tDrosophila Metamorphosenichtinvasive BildgebungLongitudinalstudie

Verwandte Artikel