Eine schnelle und Chemiefreie Hämoglobin-Assay mit Photothermische Winkellichtstreuung

Zusammenfassung

Ein photothermischer Winkellichtstreusensor (PT-AS) ermöglicht die schnelle und chemikalienfreie Hämoglobin-Bestimmung von Blutproben im Nanoliter-Maßstab. Hier werden Details zum PT-AS-Aufbau und ein Messprotokoll für die Hämoglobinkonzentration im Blut zur Verfügung gestellt. Repräsentative Ergebnisse für anämische Blutproben werden ebenfalls vorgestellt.

Zusammenfassung

Photothermischen Winkellichtstreuung (PT-AS) ist ein neues optisches Verfahren zur Messung der Hämoglobinkonzentration ([Hb]) von Blutproben. Auf der Basis der intrinsischen Lichtwärmeumsetzmaterial Reaktion von Hämoglobin-Molekülen ermöglicht der Sensor mit hoher Empfindlichkeit, chemikalienfreie Messung von [Hb]. [Hb] Erfassungsfähigkeit mit einem Grenzwert von 0,12 g / dl über den Bereich von 0,35 bis 17,9 g / dl zuvor nachgewiesen wurde. Das Verfahren kann leicht unter Verwendung von preiswerten elektronischen Geräten wie beispielsweise ein Laser-Pointer und eine Webcam implementiert werden. Die Verwendung einer Mikro Kapillarrohr als Blutbehälter ermöglicht auch die Hämoglobin-Assay mit einem Nanoliter-Maßstab Blutvolumen und niedrigen Betriebskosten. Hier detaillierte Anweisungen für den PT-AS optischen Aufbau und Signalverarbeitungsverfahren werden vorgestellt. Experimentelle Protokolle und repräsentative Ergebnisse für Blutproben in anämischen Zuständen ([Hb] = 5,3, 7,5 und 9,9 g / dl) sind ebenfalls vorgesehen, und die Messungen werden mit denen verglichen froma Hämatologieanalysator. Seine Einfachheit in der Implementierung und Betrieb sollte ihre breite Akzeptanz in der klinischen Laboratorien und mit beschränkten Ressourcen ermöglichen.

Einleitung

Ein Bluttest wird häufig durchgeführt, insgesamt die menschliche Gesundheit zu bewerten und Biomarkern zur Erkennung bestimmter Krankheiten im Zusammenhang. Zum Beispiel dient die Cholesterinkonzentration im Blut als Kriterium für Hyperlipidämie, die in engem Zusammenhang mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Pankreatitis zusammenhängt. Die Blutzucker Inhalte sollten häufig gemessen werden, da die Glucosespiegel mit Komplikationen wie diabetischer Ketoazidose und hyperglycemic hyperosmolar Syndrom assoziiert ist. Schwere Erkrankungen wie Malaria, Human Immunodeficiency Virus und Acquired Immune Deficiency Syndrome werden durch Blutuntersuchungen diagnostiziert, und die Quantifizierung von Blutkomponenten, einschließlich Erythrozyten, Thrombozyten und Leukozyten ermöglicht Screening von Bauchspeicheldrüsen- und Nierenerkrankungen.

Hämoglobin (Hb), eine kritische Komponente von Blut, macht etwa 96% der Erythrozyten auf, und transportiert Sauerstoff an menschlichen Organen. Wesentliche Veränderung seiner Massenkonzentration ([Hb]) kann mir zeigentabolic Veränderungen, Leber - Gallen - Erkrankungen und neurologischen, Herz - Kreislauf- und endokrinologischen Störungen ^1. [Hb] wird deshalb routinemäßig bei Bluttests gemessen. Insbesondere anämischen Patienten, Dialysepatienten und schwangere Frauen sind stark zu überwachen [Hb] als eine wichtige Aufgabe ² empfohlen.

Verschiedene [Hb] Nachweisverfahren so entwickelt worden. Das Hämoglobin Cyanid - Verfahren, eines der am häufigsten verwendeten Techniken für die [Hb] Quantifizierung verwendet Kaliumcyanid (KCN) ³ , um die Lipid - Doppelschicht von Erythrozyten zu zerstören. Das Cyanid Hämoglobin durch die chemische weist eine hohe Absorption im Bereich von 540 nm erzeugt; Somit [Hb] Messungen können über kolorimetrische Analyse durchgeführt werden. Dieses Verfahren wird weithin aufgrund seiner Einfachheit verwendet, aber die verwendeten Chemikalien (zB KCN und Dimethyllaurylamin oxide) sind toxisch für den Menschen und die Umwelt. Der Hämatokrit Regelung misst die Volumenverhältnis der roten Blutkörperchen im Vergleich zur Gesamtblut volume durch zentrifugale Trennung; jedoch erfordert sie einen relativ großen Blutvolumen (50-100 ul) ^4. Spektrophotometrie Methoden Maßnahme [Hb] genau ohne Einsatz von Chemikalien, sondern Messungen bei mehreren Wellenlängen und einem großen Blutvolumen werden ^5,6 erforderlich. In ähnlicher Weise mehrere optische Verfahren zur Messung von [Hb] wurden einschließlich der Nachweismethoden auf Basis von Lichtstreuung vorgeschlagen, aber ihre Messgenauigkeit hängt stark von der Genauigkeit der theoretischen Blutmodell.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, [Hb] Nachweisverfahren basierend auf dem Lichtwärmeumsetzmaterial (PT) Wirkung von Hb wurden kürzlich ⁷ vorgeschlagen. Hb, die hauptsächlich aus Eisenoxiden besteht, absorbiert bei 532 nm Licht und wandelt die Lichtenergie in Wärme ^8-10. Diese PT Temperaturerhöhung kann optisch erfasst werden, indem eine Änderung des Brechungsindex (RI) von Blutproben zu messen. Yim et al. Arbeitnehmer spektral-Domäne optische Kohärenz reflectometry den PT optischen Pfad-Längenänderung in einem Blut enthaltenden Kammer ¹¹ zu messen. Obwohl das Verfahren chemikalienfreie und direkte [Hb] Messung ermöglicht, kann die Verwendung eines Spektrometers und eine interferometrische Anordnung ihrer Miniaturisierung behindert. Wir stellten kürzlich eine alternative [Hb] Erfassungsverfahren, bezeichnet als photothermische Winkellichtstreuung (PT-AS) Sensor, der für die Miniaturisierung und ¹² besser geeignet ist. Der PT-AS-Sensor nutzt die hohe RI Empfindlichkeit des Rückstreu Interferometrie (BSI) PT Änderungen in der RI einer Blutprobe in ein Kapillarrohr zu messen. BSI wurden verwendet RI verschiedener Lösungen zu messen ^13-15 und biochemische Wechselwirkungen in freier Lösung ¹⁶ zu überwachen. Der PT-AS Sensor verwendet ähnliche optische Anordnung, wie sie in BSI, sondern verbindet Setup Lichtwärmeumsetzmaterial Anregung PT Anstieg von RI in Blutproben zu messen. Arbeitsweise des BSI und der PT-AS-Sensoren werden an anderer Stelle ausführlich beschrieben ^{12,15. PT-AS Sensor nachgewiesen hoher Empfindlichkeit [Hb] Messung über einen weiten Erfassungsbereich (0,35 bis 17,9 g / dl) und ist in der Lage mit Probenvolumina von <100 nl Betrieb. Kein Vorkonditionierung der Blutprobe erforderlich ist, und die Messzeit beträgt nur ca. 5 sec. Hier ist der Versuchsaufbau und ein detailliertes Messprotokoll beschrieben. Representative PT-AS Ergebnisse werden unter Verwendung von Blutproben von anämischen Patienten zur Verfügung gestellt, und die Ergebnisse werden verglichen, die aus einem Hämatologie-Analysator die Genauigkeit des PT-AS-Sensor zu bewerten.}

Protokoll

Experimente mit Blutproben wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Gesetzen und Richtlinien des Instituts durchgeführt. Die Proben wurden die restlichen Blutproben, die in der Einrichtung in klinischen Tests erfasst und verarbeitet worden war.

1. PT-AS Optischer Aufbau

HINWEIS: Man kann eine leere Mikro Kapillare für einen anfänglichen PT-AS-Setup verwenden.

1. Halterung einen leeren Mikro Kapillarrohr mit inneren und äußeren Durchmessern von 200 bis 330 & mgr; m sind, und eine Länge von mehr als ~ 5 cm auf einem Kapillarrohr fixture. Im Handel erhältliche Faser Vorrichtungen können als der Rohrbefestigung verwendet werden.
2. Sichere Verankerung eines 650 - nm - Laserpointer, dh die Sonde Lichtquelle, die Kapillare zu beleuchten. Der Sondenstrahl sollte größer sein als das Kapillarrohr sein. Legen Sie einen Bildschirm (zB weißes Papier) hinter der Kapillare eine Winkel periodisches Muster zu beobachten.
3. Für den Erfassungsteil, entfernen Sie alle Linsen in einer Webcam direkt auf die scatt zu erfassenEring Muster. Positionieren der Webcam hinter dem Kapillarröhrchen in einem Winkel von 25-35 ° gegenüber der Sondenstrahlrichtung. Stellen Sie sicher , dass die Winkel periodisches Muster durch das Kapillarrohr erzeugt wird, kann mit dem Detektor (Figur 1) gemessen werden. Beobachten der Winkel periodisches Muster in der Mitte des Bildsensors, wenn der Bildsensor richtig positioniert ist.
4. Positionieren Sie einen 532-nm-PT Anregungslichtquelle das Kapillarrohr zu beleuchten. Positionieren der PT-Lichtquelle in einem beliebigen Winkel, solange die PT Anregungslicht überlappt Sondenstrahl auf der Kapillarröhre und erreicht nicht den Detektor direkt. PT Anregung von Blutproben mit hoher optischer Leistung verbessert typischerweise die PT-AS Empfindlichkeit, da sie auf eine größere Änderung in der RI führt.
   1. Verwenden Sie die höchste optische Leistung des PT Anregungslichtquelle verwendet wird. Darüber hinaus sicherstellen, dass die PT Anregungslicht die Sonde Licht auf die Kapillare überlappt. Verwenden Sie eine Strahlgröße des PT-Anregungslichtmindestens zweimal der des Sondenlichts das gesamte Probenvolumen zu erhitzen.
5. Legen Sie ein Langpassfilter vor dem Detektor die 532-nm-Licht zu blockieren und nur die 650-nm-Sonde Licht messen.
6. Installieren Sie einen optischen Chopper in dem Pfad des PT Anregungslicht vor der Kapillare zu beleuchten. Der optische Chopper verwendet, um die PT Anregungslichtintensität zu modulieren.

2. Blut Probenvorbereitung

1. Zeichnen Sie 6 ml frisches Vollblut bei anämischen Zustand in Äthylendiamintetraessigsäure Blutprobenröhrchen, und die Proben gut mischen. Keine andere Verarbeitung erforderlich ist.
2. Messen Sie die Blutproben mit dem PT-AS Sensor innerhalb von 24 Stunden der Extraktion Koagulation zu verhindern.

3. PT-AS Messprotokolle

1. Laden einer Mikro Kapillarrohr mit einer Blutprobe zu messen. Füllen Sie das Kapillarrohr mit dem Blut durch Kapillarwirkung durch den Schlauch in das Blut s platzierenreichlich. Die minimale Probenmenge erforderlich für die Messung wird durch den Innendurchmesser des Kapillarrohrs und der Sondenstrahlgröße bestimmt.
   1. Verwenden ein Rohr mit einem Innendurchmesser von 200 um. Die Sondenstrahlgröße betrug 2 mm in den repräsentativen Ergebnissen, was darauf hindeutet, dass die Messung kann mit einem Probenvolumen von> 63 nl durchgeführt werden.
2. Montieren Sie das Kapillarröhrchen an der vorgesehenen Position in der Halterung.
3. Schalten Sie die 650 nm Sonde Laser die Blut geladen Mikro Kapillare zu beleuchten. Die Winkel periodische Muster sollte mit der Webcam beobachtet werden.
4. Schalten Sie den 532-nm PT Anregungslaser das Rohr zu beleuchten.
5. Führen des optischen Zerhackers die Intensität des PT Anregungslicht bei 2 Hz zu modulieren.
   HINWEIS: Die Gründe für die Auswahl dieser Betriebszustand ist in Diskussion und Kim et al. ^12.
   1. Montieren Sie einen Chopperrads in der Motorkopfanordnung der optischen ChopperSystem.
   2. Schalten Sie die Chopper-Steuerung ein, und verwenden Sie den Drehknopf in der Konsole die Modulationsfrequenz einzustellen.
   3. Führen Sie den Chopper mit dem Regler.
6. Notieren Sie sich die schwankende Streumuster über die Webcam für 5 Sekunden in MPEG-4 (mp4) Format.

4. Signalverarbeitung

HINWEIS: PT-AS Signalverarbeitung wurde unter Verwendung eines Labor-entwickelten MATLAB-Code ausgeführt.

1. Laden Sie die Videodatei die Bilder zu extrahieren. Für jedes Bild [Figur 2 (a) für einen repräsentativen Bild sehen], erhalten , um den gemittelten Streumuster , das durch den Mittelwert der Pixelwerte entlang der vertikalen Richtung Berechnung [Figur 2 (b, c)].
2. Auswerten der Fourier des gemittelten Streumuster transformieren, und berechnet die Phase bei der Spitzenortsfrequenz. Diese Vorgänge sind für alle Rahmen aller aufgenommenen Bilder.
3. die Phasenwerte unter Verwendung von allen Bildern erhalten, zeichnen die zeitliche PhaseFluktuation [2 (d)]. Beachten Sie, dass die Phase an der PT Modulationsfrequenz schwankt. Nehmen der Fourier-Transformation der Phasenschwankung in der Zeitdomäne zu transformieren und zu erhalten, die Größe bei der Modulationsfrequenz. Dieses Signal wird als die PT-AS - Signal [Bild 2 (e)].
4. Messung der [Hb] von einer Blutprobe durch die PT-AS Signals in das Umwandlungs entsprechenden [Hb], um die Kalibrierungskurve unter Verwendung von in Protokoll 5 erhalten wird.

5. PT-AS Kalibrierungs

1. Bereiten Sie Blutproben, mit [Hb] Werte , die gleichmäßig in dem Erfassungsbereich des PT-AS Sensor verteilt sind (zB 0 - 18 g / dl).
2. Vor der Kalibrierung quantifizieren die [Hb] -Werte der Proben eines Referenz Hämatologie-Analysators. Messen Sie die PT-AS Signale der Proben.
3. Leiten Sie eine Eichkurve betreffend [Hb] zu dem PT-AS-Signal durch eine lineare Durchführen der kleinsten Quadrate, [Hb] = A [PT-AS Signal] + B, der experimental Ergebnisse. Für die Betriebsbedingungen in Tabelle 1 angegebenen, ist die Beziehung zwischen [Hb] und der PT-AS - Signal wurde zu sein [Hb] = 5,13 [PT-AS - Signal] gefunden - 0,09. Verwenden Sie MATLAB-Code die lineare Anpassung auszuführen.

Ergebnisse

Ein Hämoglobin-Assay wurde unter Verwendung des PT-Sensors AS durchgeführt und seine Messungen wurden mit denen von einem Hämatologie-Analysator verglichen. Das Experiment wurde mit einer PT Anregungslichtintensität von 1,4 W / cm ^2, PT Modulationsfrequenz von 2 Hz und Messzeit von 5 sec durchgeführt. Tabelle 1 faßt die experimentellen Bedingungen. Die Strahlgrößen der Sonde und PT Anregungslicht waren 5,5 und 2 mm. Die Webcam aufgezeichnet, die Bilder mit ein...

Diskussion

Der PT-Sensor AS stellt eine rein optische Methode, die für direktes [Hb] Messung von nicht verarbeiteten Blutproben. Das Verfahren quantifiziert [Hb] im Blut die intrinsische PT Reaktion von Hämoglobin-Moleküle in den Erythrozyten verwendet wird. Unter Beleuchtung mit 532-nm-Licht absorbieren Hb-Moleküle die Lichtenergie und Wärme erzeugen. Die sich ergebende Temperaturanstieg ändert den RI der Blutprobe. Die hohe Empfindlichkeit von RI BSI wurde nutzten diese RI Veränderung im Blut zu messen. Zuvor haben wir gezeigt, ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
650 nm Laserpointer	LASMAC	LED-1	Sondenlicht
Hohle runde Glaskapillaren	VitroCom	CV2033	Blutprobenbehälter
Webcam	Logitech	C525	CMOS optischer Sensor
Optisches Chopper-System	Thorlabs	MC2000-EC	Optischer Chopper
Kunststoff-Langpassfilter	Edmund Optics	#43-942	Zur Abweisung von 532-nm-PT-Anregungslicht
Faserklemme	Thorlabs	SM1F1-250	Kapillarröhrchenhalterung
Blutentnahmeröhrchen	Greiner Bio-One	VACUETTE 454217	Blutentnahme- und Antikoagulations-Hämatologie-Analysator
	Siemens AG	ADVIA 2120i	Referenz-Hämatologie-Analysator

EDTA-beschichtetes