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Testen des Vascular Invasive Fähigkeit von Krebszellen in Zebrabärbling (

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⸱

DOI:

10.3791/55007

⸱

3. November 2016

 ,  ,  , 
1Department of Oncology, Lombardi Comprehensive Cancer Center, Georgetown University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Verfahren nutzt Zebrabärblingembryonen effizient die Gefäß invasive Fähigkeit von Krebszellen zu testen. Fluoreszierende Krebszellen werden in den precardiac Sinus oder Dottersack von sich entwickelnden Embryonen injiziert. Krebszelle Gefäßinvasion und Extravasation wird über Fluoreszenzmikroskopie des Heckbereich 24 bis 96 Stunden später bewertet.

Zusammenfassung

Die vaskuläre Invasion und Extravasation von Krebszellen ist ein Kennzeichen der metastasierenden Progression. Traditionellen In-vitro-Modellen der Invasion von Krebszellen in Endothelien fehlt in der Regel die Flüssigkeitsdynamik, der eindringende Zellen sonst in vivo ausgesetzt sind. In-vivo-Systeme wie Mausmodelle sind zwar physiologisch relevanter, erfordern jedoch längere experimentelle Zeiträume und stellen einzigartige Herausforderungen im Zusammenhang mit der Überwachung und Datenanalyse dar. Hier beschreiben wir einen Zebrafisch-Assay, der versucht, diese technische Lücke zu schließen, indem er eine schnelle Beurteilung der vaskulären Invasion und Extravasation von Krebszellen ermöglicht. Bei diesem Ansatz werden fluoreszierende Krebszellen in die präkardiale Nasennebenhöhle von transparenten 2 Tage alten Zebrafischembryonen injiziert, deren Gefäßsystem durch einen kontrastierenden fluoreszierenden Reporter markiert ist. Nach der Injektion müssen die Krebszellen im Kreislauf überleben und anschließend aus den Gefäßen in das Gewebe im kaudalen Bereich des Embryos extravasieren. Extravasierte Krebszellen werden in lebenden Embryonen mittels Fluoreszenzbildgebung zu einem festgelegten Zeitpunkt effizient identifiziert und bewertet. Diese Technik kann modifiziert werden, um die Intravasation und/oder Konkurrenz zwischen einer heterogenen Mischung von Krebszellen zu untersuchen, indem die Injektionsstelle in den Dottersack verlagert wird. Zusammen können diese Methoden ein charakteristisches Verhalten von Krebszellen bewerten und dabei helfen, Mechanismen aufzudecken, die auf ein malignes Fortschreiten des metastasierten Phänotyps hinweisen.

Einleitung

Metastatische Erkrankung ist eine Hauptursache der Krebssterblichkeit und viele Mechanismen, die Krebszelle ermöglichen Verbreitung bleiben bis 1 entdeckt werden. Um für eine Krebszelle, um erfolgreich zu metastasieren, muss er zunächst durch das Stroma eindringen, die eine primäre Tumor umgibt, geben Sie (intravasate) in das Kreislaufsystem, überleben auf der Durchreise, Ausfahrt (extravasate) aus dem Kreislauf und schließlich eine tragfähige Kolonie gründen am entfernten Organstelle 2. Intravasation und Extravasation sind somit entscheidende Schritte in der metastatischen Kaskade, doch jeder Krebszelle ist nicht von Natur geschickt darin zu stören und die Migration durch endotheliale Kreuzungen 3. In der Tat gibt es eine Reihe von einzigartigen Selektionsdruck , die Krebszellen vaskuläre Invasion und der Prozess umgeben kann weiterhin durch eine Vielzahl von endogenen und exogenen Faktoren 4 beeinflusst werden. Aus diesen Gründen Techniken, die das aggressive Verhalten von fortgeschrittenen Stadium Krebs Sonde konzentrieren sich häufig auf vascular invasive Fähigkeit als Mittel Metastasierung zu prognostizieren.

Verschiedene Modellsysteme existieren , um die Untersuchung von Krebszellen Gefäßinvasion in vitro zu erleichtern. Die am häufigsten verwendete in vitro Assays beinhalten entweder Transwell - Systemen Krebszellmigration durch eine endotheliale Schranke 5 oder Elektro Zell-Substrat - Impedance Sensing (ECIS) Technologie zur Überwachung des Echtzeit - Unterbrechung einer intakten endothelialen Monoschicht durch Krebszellen 6 zu bewerten. Diese Tests fehlt typischerweise die Fluiddynamik und Stroma-Faktoren, die sonst Krebszellbindung an eine Endothelwand auswirken würde. Dieses Problem wird etwas von perfundierbaren Gefäßnetze umgangen , die aus dem 3D - Kultur von Endothel entstehen mit Stromazellen zu unterstützen und diese 3D - Mikrofluidik - Systeme nun die Spitze der aktuellen In - vitro - Optionen 7,8 darstellen. Dennoch auslassen diese Ansätze die robuste Mikro eines funktionellen Kreislaufsystemund daher nur teilweise Ersatz für die in vivo - Modellen.

Die am häufigsten in - vivo - Modell von Gefäßinvasion verwendet wird , ist die Maus, bei der experimentellen Metastasierung Assays häufig durchgeführt werden , weil sie auf relativ kurze Zeiträume und sind in der Regel bezeichnend für Metastasierungsfähigkeit 9 auftreten. Diese Tests umfassen die direkte Injektion von Krebszellen in den Verkehr und damit die Endstadien der Metastasierung zu modellieren, nämlich Extravasation und Krebszellbesiedelung von Organen. Die experimentellen Metastasierung Assays unterscheiden sich an der Stelle der Krebszellinjektion basiert und die Organe schließlich analysiert. Im ersten Assay - Typ, Krebszellen in die Schwanzvene von Mäusen und Krebszellaussaat in der Lunge injiziert werden , wird 10,11 überwacht. Der zweite Test beinhaltet die Durchführung intrakardiale Injektionen metastatic seeding in Richtung auf die Knochenmikro 12-14, sondern auch das Gehirn 15 zu lenken. In dem dritten Test, Krebs cells werden in die Milz injiziert , um Besiedlung der Leber 16 zu ermöglichen , während die vierte Lieferroute in die Arteria carotis Krebszellen zum Gehirn 17,18 trägt. Unabhängig von der Krebszelle Liefermethode, Organ Kolonisation ist die akzeptierte experimentellen Endpunkt und wird in der Regel über Lumineszenz, Histologie bestimmt, oder PCR-basierte Techniken. Trotz der physiologischen Vorteile von innerhalb eines murinen Wirt experimentellen Metastasierung Assays Durchführung dieser Experimente erfordern noch Wochen bis Monate abzuschließen und zu analysieren.

Der Zebrafisch (Danio rerio) -Modell hat sich kürzlich als neuer Systemkrebsprogression 19,20, zu untersuchen und ermöglicht die Beurteilung von Krebszellen vaskuläre Invasion innerhalb eines Funktionskreislauf über einen viel kürzeren Zeitskala als bei Mäusen im Vergleich 21-24. Das Verfahren nutzt einen transparenten Zebrabärbling-Stamm, der seine Endothel mit einem grünen Riffkoralle Fluo markiertrescent Protein Reporter durch die kdrl Promotor, der Zebrabärbling Rezeptor für den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor 25 angetrieben. In dem Test werden die Krebszellen mit einem roten fluoreszierenden Marker markiert und in den precardiac Sinus von 2 Tage alten Embryonen injiziert. Irgendwo zwischen 48 bis 96 Stunden nach der Injektion von Krebszellen, die aus dem Gefäßsystem und in die Schwanzvene Region von Embryonen eingedrungen sind effizient auf einem Fluoreszenzmikroskop erzielt. Hier wir die Technik zu einer Gruppe von üblicherweise verwendeten humanen Brustkrebszelllinien gelten für stark Unterschiede in ihrer Gefäß invasive Fähigkeit demonstrieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass für den Embryo yolk sac die Injektionsstelle zu ändern für die Untersuchung der heterogenen Zell-Interaktionen ermöglicht, als Krebszellpopulationen differentiell mit Fluoreszenzfarbstoffen und injiziert in Zebrabärbling-Embryonen fehlt Fluoreszenz Vaskulatur markiert werden. In diesem letzteren Test, Krebszellen, die das Eigelb eingedrungen sind und intravasated in die vasculature werden im kaudalen Bereich von 24 bis 48 Stunden nach der Injektion erzielt. Aufgrund der Effektivität und Komfort dieses Modells sind Zebrabärbling zunehmend die Gefäß invasive Fähigkeit von Krebszellen unter einer physiologischen Umgebung, um schnell zu testen eingesetzt.

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Protokoll

Ethik-Statement: Zebrabärbling-Embryonen erzeugt wurden nach einer genehmigten IACUC Protokoll. Diese Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Georgetown University Animal Care und Use Committee durchgeführt.

1. Organisieren Embryonen für Injection und erstellen Stammlösungen

  1. Generieren erforderlichen Zebrabärblingembryonen zur Krebszelle Gefäßinvasion beurteilen.
    1. Richten Sie paarweise oder Gruppe in Cross Paarung mit Tg (kdrl: grcfp) zn1; mitfa b692; ednrb1 b140 Fisch.
      HINWEIS: Wir erzeugten Tg (kdrl: grcfp) zn1; mitfa b692; ednrb1 b140 Zebrabärbling, durch Tg Kreuzung (kdrl: grcfp) zn1 25, die in Endothelzellen grün Riffkoralle fluoreszierende Protein exprimieren, mit einer Linie , die Pigmentzellen fehlt, mitfa b692; ednrb1 b140 am Zebrabärbling international Resource - Center entwickelt.
    2. Collect Eier, sauber und entfernen unfertilized oder deformierte Embryonen am nächsten Tag 22.
    3. Inkubieren Embryonen bei 28,5 ° C, bis sie bereit zur Injektion mit Krebszellen, zu kommen, wenn die Genaktivität 2-Tage nach der Befruchtung (2 dpf) sind.
  2. Machen Injektion Platten.
    1. Melt 25 ml 1,5% Agarose in dH 2 O für jede Platte.
    2. Gießen Sie 12 ml der Agarose in eine 100 mm x 15 mm Petrischale und lassen Sie es aushärten.
    3. Re-Schmelze dann gießen Sie die verbleibenden Agarose in der Platte.
    4. Position unmittelbar einen Schnitt Glasform (3 mm x 7,2 cm breit x 7,5 cm lang), so dass es in einem 30 Grad Winkel zur Agarose und positioniert in der Mitte der Platte ist.
      Hinweis: das wird eine steile 60 ° Wand und eine 30 ° geneigte Rampe erstellen.
    5. Kleben Sie die Glasform an Ort und Stelle und lassen Sie die Agarose hart werden.
    6. Sie vorsichtig die Glasform entfernen und darauf achten, nicht die Agarose zu reißen.
      HINWEIS: Formen können in dH 2 O bei 4 ° C gelagert werden.
  3. Äquilibrieren Injektionsplatte mit Fischwasser (0,3 g / l Meersalz).
    1. Rinse Platte zweimal mit destilliertem Wasser.
    2. Äquilibrieren Platte durch Zugabe von 10 ml Fischwasser an der Platte und auf Schüttler für 10 min.
    3. Äquilibrieren Platte ein zweites Mal mit Fischwasser.
  4. Split 2-Tage nach der Befruchtung (dpf) Embryonen in Injektionsgruppen , indem sie in Gerichte zu übertragen Fischwasser enthält 22.
  5. Bereiten Sie Erholung Gerichte für jede Gruppe nach der Injektion zu verwenden. Stellen Sie sicher, dass die Erholung Schale enthält 10 ml Fischwasser plus Penicillin (25 ug / ml) und Streptomycin (50 ug / ml).
  6. Bereiten 2x Tricaine Lösung durch Zugabe von 4 ml der gepufferten Tricaine Lager (4 mg / ml, 10 mM Tris, pH 7) und 50 ml Fisch Wasser plus Penicillin und Streptomycin.
  7. Man löst 15 mg mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose in 10 ml 2x Tricaine Lösung eine Montage Anästhetikum Medium zu erzeugen, die Live-Embryonen für die imagin immobilisieren wirdG.
    HINWEIS: Montagemedium besteht aus 1,5% Agarose.
  8. Ziehen Mikroinjektionsnadeln.
    1. Legen Sie Glaskapillarröhren in einer vertikalen Pipette Puller. Ziehen Sie lange verjüngte Pipetten mit 20 mA Strom und eine 2-Spule Heizelement.

2. Markierung Krebszellen mit lipophilen Fluoreszenzfarbstoff

  1. Pflegen Krebszellen in ihrer empfohlenen Kulturbedingungen.
    ANMERKUNG: Diese Linien wurden in DMEM gehalten + 10% FBS: BT-474, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468 und SK-BR-3. Diese Linien wurden in RPMI + 10% FBS: HCC 1806 und T-47D. Alle Zelllinien wurden bei 37 o C und 5% CO 2 während der Inkubation gehalten.
  2. Generieren Sie eine Einzelzellsuspension durch eine haftende Kultur von Krebszellen distanziert.
    1. Waschen Sie die Zellen zuerst mit PBS und dann mit 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung zu behandeln.
      HINWEIS: Trypsin Belichtungszeit auf der Zelllinie ab.
    2. Neutralisieren Sie die Trypsin-Lösung mit sichRum-haltigen Zellkulturmedien, nachdem die Zellen zu lösen.
  3. Zentrifugieren Sie die Trypsin-neutralisierten Zellsuspension für 5 Minuten bei 200 · g, dann Zellpellet in frischem Kulturmedien für die Zellzählung.
  4. Zählen der Zellsuspension unter Verwendung eines automatischen Zählers und bereiten 1 Million Zellen in 200 ul Zellkulturmedien.
    1. Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen mit Trypanblau-Ausschluss vor der Injektion in Zebrafischembryonen.
      ANMERKUNG: Nur tragfähige sollten die Zellpopulationen in Zebrafischembryonen, als Injektion von toten Zellen reflektieren nicht wahr Gefäßinvasion injiziert werden.
  5. In 2 ul roten lipophilen Farbstoffs an die Krebszellsuspension für eine 1: 100 Verdünnung, gut mischen und brüten dann die Mischung bei 37 ° C für 20 min.
    HINWEIS: Die Konzentration des Farbstoffes und Kennzeichnungszeit benötigen für jede Zelllinie optimiert werden.
  6. Nach der Inkubation mit 1 ml frischem Medium mit dem Rohr und dann 5 min zentrifugieren200 x g.
  7. Waschen Restfluoreszenzfarbstoff aus den Krebszellen entfernt.
    1. Aspirat der Überstand vom Zellpellet, das Pellet in 1 ml frischem Kulturmedium und Zentrifuge für 5 Minuten bei 200 x g.
    2. Wiederholen der Waschschritt ein zweites Mal: ​​absaugen Überstand, Zellpellet in 1 ml frischem Medium und dann wieder Zentrifuge für 5 Minuten bei 200 x g.
    3. Wiederholen Sie den Waschschritt dritten Mal: ​​den Überstand aspirieren, Zellpellet in 1 ml frischem Medium und dann wieder Zentrifuge für 5 Minuten bei 200 x g.
  8. Den Überstand aspirieren und Zellpellet enthält 1 Million markierten Krebszellen in 500 & mgr; l frisches Medium.
    HINWEIS: 0,5 mM EDTA können in den Medien zugesetzt werden, um Zell Verklumpung zu verhindern.

3. Injecting Krebszellen in die Pre-Herz-Sinus von Zebrafischembryonen

  1. Bringen Mikroinjektionsabgabesystem mit einer Druckluftquelle und schalten Sie the Mikroinjektionsquelle Abgabesystem Leistung.
    1. Prüfdruck durch das Fußpedal drücken. Ein kurzer Impuls der Luft sollte aus dem Nadelhalter emittieren.
  2. Äquilibrieren der Injektions Platten zweimal mit 2x Tricaine Lösung.
    1. Für jeden Equilibrierungsschritt, fügen Sie 20 ml 2x Tricaine Lösung für die Einspritzplatte und auf Schüttler für 10 min.
  3. Verwenden Sie Plastikpipette eine Gruppe von Embryonen in eine kleine Schüssel zu übertragen, die 2x Tricaine Lösung enthält.
  4. Verfüllen die Mikroinjektion Injektionsnadel mit Krebszellen unter Verwendung eines Gel-Ladepipettenspitze.
    1. Legen Sie die Nadel in einem Elektrodenvorratsglas mit dem spitzen Ende nach unten, so Zellen in der Nähe der Spitze absetzen.
  5. Transfer 20 - 30 narkotisierten Embryonen mit einer Injektionsplatte durch die Embryonen mit viel 2x Tricaine in einer Plastikpipette zu sammeln.
    1. Lassen Embryonen in der Spitze der Pipette zu begleichen.
    2. Gently Embryonen in den Trog der Injektionsplatte zu vertreiben, um die Embryonen entlang der Länge der Rinne zu verbreiten.
    3. Richten Embryonen mit Köpfen nach oben und Bäuche der steilen Wand des Troges gegenüber.
      HINWEIS: Tricaine Lösung sollte sowohl die Troglänge und die flache Agarose Oberfläche bedecken, mit Embryonen nur in der Mulde befinden. Die Embryonen sind jetzt bereit für die Injektion.
  6. Injizieren von 50 bis 100 Krebszellen (2 bis 5 nl) in den precardiac Sinus der Genaktivität das Mikroinjektionsabgabesystem.
    1. Bringen Sie die Nadel in den Nadelhalter eines Mikromanipulators.
    2. Positionieren Sie die Injektionsplatte unter dem Stereoskop mit der 60-Grad-Wand auf der linken Seite und konzentrieren sich auf die Top-Embryo bei 25x Vergrößerung.
    3. Positionieren Sie den Mikromanipulator, so dass, wenn verlängert, wird die Nadel auf den Embryo durchdringen.
    4. Ziehen Sie die Nadel durch das Auge, bis es fast ist der Embryo zu berühren.
    5. Ein Blick unter dem Mikroskop, richten die Nadel so tHut wird es den Embryo auf weitere Verlängerung durchdringen.
    6. Pierce der Embryo durch den Dottersack Plazieren der Spitze nur an, aber nicht in die vorgeHerzHöhle.
    7. Injizieren Sie die Zellen durch das Fußpedal drücken. Die Kraft des Injektions ausstößt, die Zellen in das Herzhöhle. Ziehen Sie die Nadel.
    8. Mit der rechten Hand, zu erweitern und die Injektionsnadel zurückzuziehen. Mit der linken Hand, Feineinstellungen nächsten Embryo zu positionieren.
    9. Bringen Sie die Nadel in das Gefäß Elektrode Lagerung beim Einrichten auf eine andere Platte zu injizieren.
  7. Übertragen Sie die Embryonen in die Recovery-Schale einmal die gesamte Platte eingespritzt wird.
    1. Kippen Sie die Einspritzplatte, die Embryonen am Boden zu bündeln, Waschen alle verbleibenden Embryonen aus dem Trog, und sie mit der Plastikpipette zu sammeln.
    2. Lassen Sie die Embryonen in den Boden der Pipette zu begleichen.
    3. Transfer der Embryonen auf das Rückgewinnungsschale in einem minimalen Volumen von Tricaine.
  8. Incubate Erholung Schale bei 28 ° C für 1 Stunde.
    1. Separate tragfähige Genaktivität von toten Embryonen und andere Verunreinigungen.
  9. Inkubieren Schale bei 33 ° C, bis sie bereit für die Wertung, in der Regel 24 bis 96 Stunden.
    ANMERKUNG: Diese Temperatur als Kompromiß zwischen 37 ° C die ideale Temperatur für Krebszellen bestimmt wird, und 28,5 ° C, die ideale Temperatur für Zebrabärbling.

4. Wertung Extravasation

  1. Anesthetize die Charge von Embryonen, indem sie in eine Schüssel mit Tricaine Lösung erzielt werden.
  2. Legen Sie eine narkotisiert Larven auf eine Depression Mikroskopie Folie in einem Tropfen Tricaine.
    1. Orient Larven seitlich für eine optimale Abbildung der Schwanzregion.
  3. Zähle die Anzahl der Krebszellen, die aus dem Gefäßsystem erfolgreich eingedrungen sind von oben und unten durch den Heckbereich konzentriert klar intakten Zellen erkennen.
    HINWEIS: Es ist am besten mindestens zwei Personen in t beteiligt zu haben,seinen Prozess, in dem die einzelnen Fische Scoring auf der experimentellen Bedingung ist blind geprüft.
    1. Score Larven auf einer Verbindung Fluoreszenzmikroskop mit dem 10x-Objektiv. Verwenden Sie das 20x-Objektiv für alle schwierig Anrufe.

5. Montage Embryonen auf Folien und anschließende Fluorescence Imaging

  1. Schmelze 1,5% Agarose / Tricaine Lösung und bringen auf 37 ° C.
  2. Anesthetize den Embryo, indem Sie es in Tricaine Lösung abgebildet werden.
  3. Transfer des Embryos in einem Tropfen Tricaine Lösung auf die Abbildungsfläche. verwenden Sie wahlweise eine Glasbodenschale oder Mikroskop-Objektträger.
  4. Verwenden einer Glaspipette das überschüssige Tricaine Lösung, Halten der Embryo auf der Abbildungsfläche zu entfernen.
  5. Overlay ein Tropfen geschmolzenen Agarose-Lösung über den Embryo.
  6. Schnell, bevor die Agarose polymerisieren, verwenden Sie ein empfindliches Werkzeug, wie ein Wimpernbürste, um den Embryo seitlich zur Bildgebung zu orientieren, besonders vorsichtig zu gebenden Embryo zu gewährleisten ist entlang der Abbildungsfläche abgeflacht.
  7. Tauchen Sie die jetzt polymerisiert Agarose Tropfen unter Tricaine Lösung.
  8. Thema der Live-Zebrafischembryo auf mikroskopische Bildgebung.

6. Änderung: Die Einspeisung von Krebszellen in den Dottersack von Zebrafischembryonen

  1. Herstellung der Mikroinjektionsabgabesystem und die Einspritzplatten, wie zuvor in Abschnitt (3) dieses Protokolls.
  2. Etikett zwei Zellpopulationen mit kontrasFluoreszenzFarbstoffen, wie vorstehend in Abschnitt (2) dieses Protokolls.
  3. Injizieren von 5 bis 10 nl von 2 x 10 ^ 7 Zellen / ml in den Dottersack. Halten Sie das Injektionsvolumen konstant gleiche Zellzahlen zu injizieren (100-200 Krebszellen) aus jeder Zellpopulation
    HINWEIS: Eine transparente Genaktivität verwenden können fluoreszierende Gefäße für diesen Test fehlt. Passive Eindringen von Partikeln in das Gefäßsystem kann für Perlen durch Injizieren fluoreszierendes gesteuert werden (<10 um) oder verändernnativ, eine Zelllinie, die nicht intravsate.
  4. Recover die injizierten Embryonen, wie zuvor in Abschnitt (3) dieses Protokolls und dann Screening für eine erfolgreiche Injektionen.
    1. Verwenden Sie ein Stereoskop zu screenen und tragfähige Embryonen übertragen, die erfolgreich auf eine neue Schale injiziert wurden.
      HINWEIS: Alle Embryonen eine gleich bleibend bemessen Masse von Zellen in dem Eigelb entfernt haben sollte. Die Embryonen werden verworfen, wenn die Masse Größe unterscheidet, oder wenn alle Zellen außerhalb des Eigelbs befinden.
    2. Übertragen Sie die tragfähige Embryonen auf ein neues Gericht, wenn Krebszellen in den Dottersack deutlich zu erkennen.
  5. Inkubieren Schale bei 33 ° C, bis sie bereit für die Wertung, in der Regel 24 bis 48 Stunden.
    ANMERKUNG: Diese Temperatur als Kompromiß zwischen 37 ° C die ideale Temperatur für Krebszellen bestimmt wird, und 28,5 ° C, die ideale Temperatur für Zebrabärbling.
  6. Um zu punkten intravasation, befolgen Sie die im Abschnitt Richtlinien (4) dieses Protokoll, sondern die Anzahl der c zählenancer Zellen, die in das Gefäßsystem des kaudalen Region erfolgreich eingedrungen sind.

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Ergebnisse

Hier testeten wir die vaskuläre invasive Fähigkeit von häufig verwendeten Brustkrebszelllinien in einem Zebrafischembryo - Modell (Abbildung 1). Rigorose Kriterien wurden in Scoring-Extravasation für diese verschiedenen Zelllinien eingesetzt werden, wo positive Ereignisse nur dann, wenn die Krebszellen gezählt wurden deutlich extravasierten hatte, dieses Wesen hauptsächlich getan keine Falsch-Positiven zu begrenzen, die von Scoring Zelltrümmer entstehen könnten.

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Diskussion

Diese Technik nutzt die Zebrabärbling Modell zur effizienten Steuerung des Gefäß invasive Fähigkeit von Krebszellen zu testen (siehe Abbildung 1). Hier verwendeten wir die Technik zu einer Gruppe von Brustkrebszelllinien , um eine Basislinie zu schaffen , auf die andere Forscher können dann ihre eigenen Studien bauen (siehe Tabelle 1; Figuren 2 - 3). Die Beobachtung, dass MDA-MB-231-Zellen leicht in die Schwanzregion Genaktivität fallen würde diese Zelllinie ideal mache...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Peter Johnson vom Georgetown University Microscopy Core für die Unterstützung bei der Bildgebung der Zebrafischembryonen. Die Microscopy & Imaging Shared Resource und die Zebrafish Shared Resource werden teilweise durch das NIH/NCI-Stipendium P30-CA051008 unterstützt. Diese Arbeit wurde auch von NIH/NCI CA71508 (AW) und CA177466 (AW) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,05 % Trypsin-EDTALife Technologies25300-054
100 mm SchalenCorning Incorporated3160-100
5 3/4" Einweg-Pastorpipetten, BorosilikatglasMarke Fisher13-678-20B
60 mm SchaleCorning Incorporated3160-60
Agarose, niedrigschmelzendFisherBP165-25
Agarose,BiolineBIO-41026
, Standard, 1,2 mm x 0,68 mm, 4"A-M Systems, Inc627000
David Kopf 700C Vertikaler PipettenabzieherHofstra Group3600
DMEMLife Technologies11995-065
Elektroden-Vorratsbehälter, 1,0 mmWorld Precision Instruments, IncE210
Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonatsalz (Tricain, MS-222)FlukaA5040
WimpernbürsteTed Pella, Inc113
Fötales Rinderserum, hitzeinaktiviertesOmegaScientific FB-12
Fisherbrand TransferpipettenThermoFisher Scientific13-711-7M
Gellade-PipettenspitzenFisher Brand02-707-181
Glasbodenschalen (12,0 mm)ThermoFisher Scientific150680
Glas-DepressionsobjektträgerVWR470005-634
Instant Ocean Salt, MeersalzPentairIS50
Latex-Gummibirnen, 2 ml, Packung mit 72Heathrow ScientificHS20622B
SP8 KonfokalmikroskopLeica
MikromanipulatorNarishige
Eclipse E600Nikon
PBSLife Technologies10010-023
Penicillin-G KaliumFisher BiotechBP914-100
Petriplatten, 100 mm x 15 mmFisher Marke 
Picospritzer IIGeneral Valve Corporation
RPMI 1640 Medium Life Technologies11875-093
StreptomycinsulfatFisher BiotechBP910-50
Vybrant DiIThermoFisher ScientificV22885
VybrantDiO ThermoFisherScientific V22886
ZebrafischGeorgetown Zebrafish wurden
in DMEM + 10 % FBS gehalten, wobei BT-474- und HCC18-6-Zellen erwartet wurden, die in RPMI + 10 % FBS gehalten wurden.
Kapillarglas in molekularer QualitätFB0875713Die Zelllinien der

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