Ein Verfahren zur Messung des Metabolismus in sortierter Subpopulationen von komplexen Zell Gemeinschaften Verwendung stabiler Isotopen-Tracing

Summary

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Untersuchung des zellulären Stoffwechsels in komplexen Gemeinschaften mehrerer Zelltypen, wobei eine Kombination aus stabiler Isotopenverfolgung, Zellsortierung zur Isolierung spezifischer Zelltypen und Massenspektrometrie verwendet wird.

Abstract

Säugetierzelltypen weisen einen spezialisierten Stoffwechsel auf, und es gibt zahlreiche Beweise dafür, dass verschiedene nebeneinander existierende Zelltypen in metabolischer Kooperation stehen. Darüber hinaus können selbst Kulturen eines einzigen Zelltyps Zellen in unterschiedlichen Stoffwechselzuständen enthalten, wie z. B. ruhende oder zyklische Zellen. Methoden zur Messung der metabolischen Aktivitäten solcher Subpopulationen sind wertvolle Werkzeuge zum Verständnis des zellulären Stoffwechsels. Komplexe Zellpopulationen werden am häufigsten mit einem Zellsortierer getrennt, und Subpopulationen, die mit dieser Methode isoliert wurden, können mit Metabolomik-Methoden analysiert werden. Ein Problem bei diesem Ansatz ist jedoch, dass das Zellsortierverfahren die Zellen Belastungen aussetzt, die ihren Stoffwechsel verzerren können.

Um diese Probleme zu überwinden, haben wir argumentiert, dass die Massenisotopomerverteilungen (MIDs) von Metaboliten aus Zellen, die mit stabilen isotopenmarkierten Nährstoffen kultiviert wurden, wahrscheinlich stabiler sind als absolute Metabolitenkonzentrationen, da MIDs über längere Zeiträume gebildet werden und weniger durch kurzfristige Exposition gegenüber Zellsortierbedingungen beeinflusst werden sollten. Hier beschreiben wir eine Methode, die auf diesem Prinzip basiert und die Zellsortierung mit Flüssigchromatographie-hochauflösender Massenspektrometrie (LC-HRMS) kombiniert. Das Verfahren umfasst die Analyse von drei Arten von Proben: (1) Metabolitenextrakte, die direkt aus der komplexen Population gewonnen werden; (2) Extrakte von "mock sortierten" Zellen, die durch das Zellsortierinstrument geleitet wurden, ohne eine bestimmte Population zu bestimmen; und (3) Auszüge aus den tatsächlich sortierten Populationen. Die simuliert sortierten Zellen werden mit der direkten Extraktion verglichen, um sicherzustellen, dass die MIDs tatsächlich nicht durch den Zellsortiervorgang selbst verändert werden, bevor die tatsächlich sortierten Populationen analysiert werden. Wir zeigen beispielhafte Ergebnisse von HeLa-Zellen, sortiert nach Zellzyklusphasen, die Veränderungen im Nukleotidstoffwechsel aufzeigen.

Introduction

Höhere Organismen enthalten komplexe Gemeinschaften von verschiedenen Zelltypen, die über komplexere Funktionen zu bringen, zusammenzuarbeiten. Zum Beispiel enthalten Tumoren nicht nur Krebszellen, sondern auch Fibroblasten, Zellen , die Blutgefäße darstellen, und oft Immunzellen infiltriert ^1; Blut enthält eine komplexe Mischung von Dutzenden von Immunzellsubtypen ^2; und auch kultivierte Zelllinien können aus mehreren Subpopulationen bestehen, wie beispielsweise der luminalen und basalen Subtypen von Brustkrebszellen ^3. Darüber hinaus verschiedene Zelltypen, die metabolische "Zusammenarbeit" zei....

Protocol

1. Metabolit Extraction

1. Extraktion aus Gericht
   1. Kultur-Zellen in einer 6-Well-Platte in dreifacher Ausführung in einem stabilen Isotop Kulturmedien + dialysiert Ergänzungen (Serum oder anderen Wachstums Ergänzungen), bis die Zellen werden 75% konfluent.
      HINWEIS: Hier Kultur HeLa - Zellen für 48 h in RPMI mit 40% U- ¹³ C-Glucose und 70% U- ¹³ C, ¹⁵ N2-Glutamin und 5% dialysiertem FBS (Fetal Bovine Serum). Dialysierter FBS wird verwendet, der mit geringem Molekulargewicht Metaboliten, um loszuwerden, die den markierten Medien kontaminieren könnten. Kultivieren von Zellen in dialysiert Ergänzung v....

Results

Als Beispiel beschreiben wir ein Experiment den Metabolismus von HeLa-Zellen Untersuchung der Zellzyklus-Phase, sortiert nach. Um eine breite Palette von zentralen Metaboliten auf beiden Kohlenstoffe und Stickstoffe beschriften, kultiviert wir Zellen für 48 Stunden unter Verwendung von U- ¹³ C-Glucose und U- ¹³ C, ¹⁵ N-Glutamin als Tracer. Um reich MIDs für die Validierung Experiment zu erhalten, haben wir hier eine Mischung aus 40% U- ¹³ C-Glu.......

Discussion

Unsere Methode basiert auf dem Prinzip, dass MIDs in zellulären Metaboliten, die die "Geschichte" des metabolischen Aktivitäten einer Zelle widerspiegeln. Dies macht es möglich, Stoffwechselaktivitäten in Subpopulation von Zellen zu untersuchen, wie sie in der komplexen Gemeinschaft der Zellen erfolgte vor der Zellsortierung Verfahren. Im Gegensatz dazu unterscheiden sich die Peakflächen von Metaboliten deutlich zwischen Extrakten von sortierten Zellen und direkte Extraktion aus der Kulturschale

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Sigma	H6648
INFLUX (inFlux v7 Sorter)	BD Biosciences
U-13C-Glukose	Cambridge Isotope	40762-22-9 / GLC-018
U-13C,15N2-Glutamin	Cambridge Isotope	CNLM-1275-H-0.1
Methanol (JT Baker), HPLC-Qualität	VWR	BAKR8402.2500
Ultrafree - MC - VV Zentrifugalfilter. Durapore PVDF 0.1 & Mikro; m	Millipore	UFC30VV00
Ultimate 3.000 UHPLC	Thermo Fisher scientific
Q-Exactive Orbitrap Massenspektrometer	Thermo Fisher scientific
Merk-Sequant ZIC HILIC Säule (150 mm x 4,6  mm, 5 & Mikro; m)	Merck KGaA	1.50444.0001
Merk-Sequant ZIC HILIC Vorsäule (20 mm x 2,1 mm)	Merck KGaA
Acetonitril Optima LC-MS, Braunglas	Fisher Scientific	A955-212
Milli-Q Wasser	Millipore		Hergestellt mit einem Milli-Q Gradientensystem
Myrsyra 99,5% Optima (Ameisensäure)		Fisher Scientific 11423423
X100 Schraubfläschchen 1,5 ml, 8-425 32x11,6 mm, braun, 100	Stück Thermo Fisher scientific	10560053
X100 Lock Skruv Vitt PTFE Packung 8-425 (Schraubverschlüsse)	Thermo Fisher scientific	12458636
ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix	Sigma-Aldrich	MSCAL5	Kalibrierkit
SNAKESKIN 10K MWCO	Thermo Fisher scientific	88245
Mathematica v.10	Wolfram Forschung