Methodenartikel

der Anbau von Caenorhabditis elegans In drei Dimensionen im Labor

DOI:

10.3791/55048

⸱

12. Dezember 2016

 ,  , 
1Division of Biological Science and Technology, Yonsei University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir präsentieren eine einfache Methode 3D Nematode Anbausysteme NGT-3D und NGB-3D genannt zu konstruieren. Diese können verwendet werden Nematoden Fitness und Verhaltensweisen in Lebensräume zu studieren , die mehr sind ähnlich wie natürliche Caenorhabditis elegans Lebensräume als die Standard - 2D - Labor C. elegans Kulturplatten.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Verwendung genetischer Modellorganismen wie Caenorhabditis elegans hat in den letzten fünf Jahrzehnten zu bahnbrechenden Entdeckungen in der Biologie geführt. Das meiste, was wir über C. elegans wissen, beschränkt sich auf die Laborkultivierung der Nematoden, die nicht unbedingt die Umgebung widerspiegeln, in der sie normalerweise in der Natur leben. Die Kultivierung von C. elegans in einem 3D-Habitat, das der 3D-Matrix ähnelt, auf die Würmer in faulen Früchten und vegetativem Kompost in der Natur treffen, könnte neue Phänotypen und Verhaltensweisen aufdecken, die in 2D nicht beobachtet werden. Darüber hinaus können Experimente in 3D untersuchen, wie Phänotypen, die wir in 2D beobachten, für den Wurm in der Natur relevant sind. Hier wird eine neue Methode vorgestellt, bei der C. elegans normal in drei Dimensionen wächst und sich fortpflanzt. Die Kultivierung von C. elegans in Nematoden Growth Tube-3D (NGT-3D) kann es uns ermöglichen, die Fortpflanzungsfähigkeit von C. elegans-Stämmen oder verschiedene Bedingungen in einer 3D-Umgebung zu messen. Wir stellen auch eine neuartige Methode vor, die als Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D) bezeichnet wird, um C. elegans in 3D für die mikroskopische Analyse zu kultivieren. Diese Methoden ermöglichen es den Wissenschaftlern, die Biologie von C. elegans unter Bedingungen zu untersuchen, die die Umgebungen, denen sie in der Natur begegnen, besser widerspiegeln. Diese können uns helfen, die übergeordnete evolutionäre Relevanz der Physiologie und des Verhaltens von C. elegans, die wir im Labor beobachten, zu verstehen.

Einleitung

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Die Erforschung des Fadenwurms Caenorhabditis elegans im Labor hat in den letzten fünf Jahrzehnten zu bahnbrechenden Entdeckungen auf dem Gebiet der Biologie geführt1. C. elegans war der erste mehrzellige Organismus, dessen Genom 1998 sequenziert wurde2, und er war von unschätzbarem Wert für das Verständnis der Beiträge einzelner Gene zur Entwicklung, Physiologie und zum Verhalten eines ganzen Organismus. Wissenschaftler versuchen nun, besser zu verstehen, wie diese Gene zum Überleben und zur Fortpflanzungsfähigkeit von Organismen in ihrer natürlichen Umgebung beitragen können, und stellen Fragen zur Ökologie und Evolution auf genetischer Ebene3-5.

C. elegans kann wieder einmal ein hervorragendes System bieten, um diese Fragen zu beantworten. Allerdings ist nur wenig über die Biologie von C. elegans in natürlichen Nematoden-Lebensräumen bekannt, und es gibt keine aktuellen Methoden, um kontrollierte natürliche Bedingungen von C. elegans im Labor zu simulieren. Im Labor wird C. elegans auf der Oberfläche von Agarplatten kultiviert, die mit E. coli-Bakterien besiedelt sind6. In der Natur sind C. elegans und verwandte Nematoden jedoch nur spärlich in Böden auf der ganzen Welt zu finden, aber sie gedeihen speziell in verrottenden Früchten und vegetativer Substanz7,8. Diese dreidimensionalen (3D) komplexen Umgebungen unterscheiden sich deutlich von den einfachen 2D-Umgebungen, denen Würmer im Labor ausgesetzt sind.

Um Fragen zur Biologie von Nematoden in einer natürlicheren 3D-Umgebung zu beantworten, haben wir ein 3D-Habitat für die Laborkultivierung von Nematoden entworfen, das wir Nematode Growth Tube 3D oder NGT-3D kurz9 genannt haben. Ziel war es, ein 3D-Wachstumssystem zu entwerfen, das ein vergleichbares Wachstum, eine vergleichbare Entwicklung und Fruchtbarkeit mit den Standardplatten für 2D-Nematodenwachstumsmedien (NGM)10 ermöglicht. Dieses System unterstützt das Wachstum von Bakterien und Nematoden über ihren gesamten Lebenszyklus in 3D, ermöglicht es Würmern, sich dreidimensional frei zu bewegen und zu verhalten, und ist einfach und kostengünstig herzustellen und einzusetzen.

In der aktuellen Studie stellen wir eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Herstellung von NGT-3D zur Verfügung und bewerten die Entwicklung und Fruchtbarkeit von Würmern. Neben der Beurteilung der Wurmfitness in 3D haben wir versucht, das Verhalten und die Physiologie von Würmern in der 3D-Kultivierung abzubilden, zu filmen und zu bewerten. Daher stellen wir hier neben NGT-3D eine alternative Methode namens Nematode Growth Bottle 3D oder NGB-3D für die mikroskopische Abbildung von C. elegans während der 3D-Kultivierung vor. Dies wird besonders wichtig für die Untersuchung bekannter Verhaltensweisen sein, die in 2D identifiziert wurden, und die Identifizierung neuer Verhaltensweisen, die für die 3D-Kultivierung einzigartig sind.

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Protokoll

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1. Bereiten Sie Lösungen für NGT-3D und NGB-3D

  1. Bereiten Sie die folgenden sterilen Lösungen: 1 L von 0,1454 M NaCl - Lösung, 1 l 1 M CaCl 2, 1 l 1 M MgSO 4, LB-Medium (LB), 1 L 1 M KPO & sub4 ; -Puffer (108,3 g KH & sub2 ; PO 4 und 35,6 g K 2 HPO 4 und füllen H 2 O auf 1 L). Die Produktion von NGM den Einsatz dieser Lösungen können in einem früheren Protokoll 10.
  2. Autoklaven-Lösungen bei 121 ° C, 15 min.
  3. Vorbereitung 50 ml einer sterilen 5 mg / ml Cholesterinlösung. In einem 50 ml konischen Röhrchen, mischen 0,25 g Cholesterin und 50 ml 99,99% Ethanol und gut mischen. Sterilisieren nicht. Sterilisieren des Cholesterinlösung mit einer 50 ml-Spritze mit einer 0,45 um-Spritzenfilter. Dies wird auch jegliche ungelösten Cholesterol entfernen.
  4. (Optional) Bereiten Sie 10 ml einer 150 mM von 2'-Desoxy-5-fluoruridin (FUdR) Lager. In einem 15 ml konischen Röhrchen, mischen 0,3693 gvon FUdR und 10 ml destilliertem Wasser. Gut schütteln.

2. Bereiten Sie Bakterienkultur für NGT-3D und NGB-3D

  1. Impfen 10 ml LB-Brühe mit Bakterien. Die Standard - Bakterien für C. elegans verwendet Fütterung ist E. coli - Stamm OP50.
  2. Kultur der Bakterieninokulation bei 37 ° C in einem Schüttelinkubator über Nacht.
  3. In Vorbereitung für eine serielle Verdünnung Aliquot 9 ml der NaCl-Lösung in sterile 15 ml konischen Röhrchen. Zum Beispiel aliquoten 9 ml in insgesamt 7 Röhren 10 -7 Verdünnung von OP50 Stamm E. coli zu machen.
  4. Mit einem sterilen 1000 ul Pipette Pipette 1 ml der Bakterienkultur oder verdünnte Bakterienkultur in das sterile neues Röhrchen mit 9 ml NaCl-Lösung und Vortex gut die 10 ml Mischung. Wiederholen, bis die gewünschte Bakterien Verdünnung erreicht ist.
    HINWEIS: Die gewünschte Bakterien Verdünnung hängt von der Art und den Zustand der Bakterien sowie die genauen experimentellen Bedingungen.Zum Beispiel kann eine 10 -6 - 10 -8 Verdünnung von OP50 Stamm E. coli war ausreichend von 1 zu produzieren - 200 Bakterienkolonien pro 6,5 ml NGT-3D - Röhre. Worms zuverlässig entwickelt und reproduziert werden normalerweise , wenn die Anzahl der Kolonien über 60 war, das bei einer Verdünnung von 10 -6 aufgetreten - 10 -7. Für NGB-3D, eine Verdünnung von 10 -8 verwenden.

3. Herstellung NGT-3D und NGB-3D (200 ml)

  1. Nachdem die Bakterienkultur vorbereitet, in einem 500 ml Kolben 0,6 g NaCl, 1 g granulierter Agar und 0,5 g Pepton mischen. Legen Sie eine Rührfisch in den Kolben.
  2. In 195 ml destilliertem Wasser und bedecken Mund des Kolbens mit Aluminiumfolie.
  3. Autoklaven 121 ° C für 15 min.
  4. Setzen Sie den heißen autoklaviert Kolben auf einer Rührplatte, und rühren Sie mit mäßiger Geschwindigkeit für mindestens 2 Stunden. Kühlen des Kolbens auf 40 ° C. Achten Sie darauf, ausreichend zu kühlen, wie hier bei hohen Temperaturen weiter zu Trübungen des fertigen Agar führen kann.Jedoch niedrigere Temperaturen zu einer vorzeitigen Aushärtung des Agar führen kann.
    1. (Optional) Um den Kühlprozess, der Kolben wird in einem 40 ° C Wasserbad 15 Minuten vor dem Aufsetzen auf einer Rührplatte beschleunigen.
  5. Wenn die Temperatur des Agarmedien 40 ° C erreicht, wird mit 200 & mgr; l 1 M CaCl 2, 200 & mgr; l von 5 mg / ml Cholesterin - Lösung, 200 & mgr; l 1 M MgSO 4 und 5 ml 1 M KPO 4 Puffer , wenn die Lösung zu rühren weiterhin bis zu Endkonzentrationen von 1 mM CaCl 2, 5 & mgr; g / ml Cholesterin, 1 mM MgSO 4, 1 mM KPO 4.
    1. (Optional) für NGT-3D - Lebensdauer - Test hinzuzufügen 80 ul 150 mM FUdR bis zu einer Endkonzentration von 120 uM 12.
  6. In 6 ml der 10 ml verdünnt Bakterienkultur aus Schritt 2.4 in den Kolben direkt.
    1. (Optional) Für NGT-3D, entfernen Sie 6 ml Agar-Medien vor dem Schritt 3.6 und halten Sie sie separat warm. Diese Medien werden für die verwendet werden, bakterienfreioberste Schicht.
  7. Mit einer sterilen Verfahren verzichtet werden die Medien in eine sterile Kulturkammer. Stellen Sie sicher, dass die Abdeckung der Kammer dicht schließt.
    1. (Optional), um Bakterienkolonien zu verhindern an der oberen Oberfläche des Agars aus, Ausbilden einer Schicht aus bakterienfreien Agarmedium aus Schritt 3.6.1 auf der Oberseite, bevor die Medien aus Schritt 3.7 vollständig aushärtet. Dies wird eine bakterienfreien Zone an der Oberseite der NGT-3D erstellen.
    2. Für NGT-3D, gießen Sie 6,5 ml Medium in die 8 ml durchsichtigen Kunststoff-Teströhrchen eine Bakterien-Agar-Schicht zu machen, und vorsichtig 200 ul der bakterienfreien Medien auf der Oberseite der halbgehärteten 3D-Medien verzichtet werden, um eine dünne bakterien- machen freie Schicht an der Spitze.
    3. Für NGB-3D, gießen 65 ml Medium in die 25 cm 2 durchsichtigen Kunststoff - Zellkulturflasche. Dieser Betrag sollte den Körper der 25 cm 2 Zellkulturflasche füllen.
  8. Verlassen Kammern vertikal bei Raumtemperatur für eine Woche Bakterienkolonien wachsen zu lassenzu einer erheblichen Größe von mindestens 1 mm Durchmesser.
    1. (Optional) für Lebensdauer-Test in NGT-3D, Abdeckung Kammern mit Aluminiumfolie Licht Abbau von FUdR zu verhindern.

4. Messen Fitness von Wurmpopulation auf NGT-3D (Relative Brood Größe Assay)

  1. Wählen Sie eine L4-Stadium Wurm einen Platindraht auswählen und Transfer auf eine bakterienfreie NGM Platte verwenden. Lassen Sie Wurm, sich frei für ein paar Minuten bewegen Bakterien zu entfernen, um seinen Körper befestigt.
  2. Wiederholen Sie Schritt 4.1 und stellen Sie sicher, dass der Wurm frei von Bakterien ist. Im Allgemeinen zwei Wiederholungen von 4.1 sind genug.
  3. Legen Sie das saubere Wurm auf der Oberfläche des 3D-Medien mit einem Platindraht-Pick. Der Wurm sollte letztlich auch den Agar in die Agarmatrix 3D eingeben.
  4. Schließen Sie die Abdeckung etwas Luft lose damit in das Rohr zu bekommen, aber der Agar-Medien zu verhindern Trocknen.
  5. bei 20 ° C für 96 Stunden inkubieren.
  6. Nach 4 Tagen schließen die Deckel verschließen und dieNGT-3D Kulturkammer in ein 88 ° C Wasserbad das Agar zu schmelzen. Die Hitze tötet Würmer aber ihre Körper intakt bleiben.
    HINWEIS: Bei Verwendung von 8 ml-Röhrchen für NGT-3D, 20 - 30 min Inkubation ist in der Regel ausreichend.
  7. Unter Verwendung einer Glaspipette, übertragen Sie die geschmolzene Medien auf eine 9 cm Petrischale aus Kunststoff. Plastikpipetten werden nicht empfohlen, da Würmer oft bei ihnen bleiben kann.
  8. Mit Hilfe eines Übertragungs Stereo Binokular, zählen die Anzahl der Würmer an der L3, L4 und adulten Stadien. Zählen Sie nicht Würmer, die L2-Stadium sind und jünger, als die F1 und F2 Generationen hier verwechselt werden kann. Somit ist dieser Test eine relative Brutgröße Assay anstatt insgesamt Brutgröße Assay.

5. Bild und Wurm Verhalten Record auf NGB-3D

  1. Wählen Sie eine L4-Stadium Wurm mit einem Platindraht wählen, und entfernen Sie alle an der Oberfläche stecken Bakterien auf eine bakterienfreie NGM Platte übertragen und ermöglicht es, sich frei für ein paar Minuten zu bewegen.
  2. Wiederholen Sie Schritt 5.1 sicherstellen, dass die WOrm ist frei von Bakterien.
  3. Legen Sie das saubere Wurm auf die Mitte der Agar-Oberfläche des NGB-3D in der Nähe des Halses der Flasche mit einem Pick Platindraht. Der Wurm sollte letztlich auch den Agar in die Agarmatrix 3D eingeben.
  4. Schließen Sie die Abdeckung etwas Luft lose damit in das Rohr zu bekommen, während das Trocknen der Agar-Medien zu verhindern.
  5. Bild oder notieren Sie die Schnecke unter einem Transmissions-Stereo Binokular. Stellen Sie den Fokus wie der Wurm der 3D-Matrix bewegt sich durch.

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Ergebnisse

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Die Konstruktion von NGT-3D ist eine einfache und unkomplizierte Protokoll , das mit kleinen Bakterienkolonien in einem Agar gefüllte Reagenzglas führt ganzen agar (1A) angeordnet sind . Würmer können frei durch die Agarmatrix bewegen, zu finden und den Verzehr der Bakterienkolonien. Um zu bestätigen , ob C. elegans reproduzieren kann und wachsen normalerweise in NGT-3D, verglichen wir die Fruchtbarkeit und Larvenentwicklung in 3D mit Standardplatten 2D NGM. In ...

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Diskussion

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Das Labor Anbau von C. elegans die klassischen Nematoden Nährmedien Platten mit entscheidend für die Hunderte von wichtigen Entdeckungen , die in C. elegans Forschung hat zur Verfügung gestellt. Hier präsentieren wir neue Methoden C. elegans in einer Umgebung zu pflegen , die genauer ihre natürliche dreidimensionale Lebensräume widerspiegelt. Obwohl auch andere Methoden verwendet wurden , 13 C. elegans in 3D zu beobachten, ist dies das erste Protokoll , das den Anbau von Wü...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch eine neue Investigator Grant [2014R1A1A1005553] von der National Research Foundation of Korea (NRF) zu JIL; und eine Yonsei University Zukunft Leader-Challenge Grant [2015-22-0133] zu JIL

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
LB Brühe, Miller (Luria-Bertani)Difco224620
NatriumchloridDAEJUNG7548-440058,44 MW
Agar, granuliertDifco214530
PeptonBacto211677
Calciumchlorid, DihydratBio BasicCD00502*H2O; 147,02 MW
CholesterinBio BasicCD0122386,67 MW
EthylalkoholB& JRP090-199,99 %; 46,07 MW
Magnesiumsulfat, wasserfreiBio BasicMN1988120,37 MW
Kaliumphosphat, monobasisch, wasserfreiBio BasicPB0445136,09 MW
2'-Desoxy-5-fluorouridinTokyo Chemical IndustryD2235246,19 MW
Kaliumphosphat, zweibasisch, wasserfreiBio BasicPB0447174,18 MW
Mehrzweck-ReagenzgläserStockwell ScientificST.85708 ml
ReagenzglasverschlüsseStockwell ScientificST.8575
ZellkulturflascheSPL Lifescience7012525 cm2
Research StereomikroskopNikonSMZ18
High-Definition FarbkamerakopfNikonDS-Fi2
PC-based Control UnitNikonDS-U3
NIS-Elements Grundlagenforschung, Mikroskop Imaging SoftwareNikonMQS32000

Referenzen

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Schlagwörter

C elegans Kultivierung3D NematodenwachstumNGT 3D MethodeNGB 3D MethodeNematodenwachstumsrohrNematodenwachstumsflaschesterile Cholesterinl sungProtokoll zur Verd nnungsreiheBakterienkoloniewachstumrelative Gelegegr e

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