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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Methodik für die Studie des horizontalen Gentransfers in Published: March 10, 2017 doi: 10.3791/55087
Automatic Translation
*1,2, *3, 4, 5, 6,7, 6,7, 1
1Division of Biomedical Science, Faculty of Medicine, University of Tsukuba, 2Department of Basic Biomedical Science, Universidad Europea de Madrid, 3Human Biology Program, School of Integrative and Global Majors, University of Tsukuba, 4Laboratory of Nosocomial Infections, Department of Bacteriology, Centro Nacional de MicrobiologÍa, Instituto de Salud Carlos III, 5Division of Microbiology, Department of Medicine, School of Medicine, Universidad Complutense, 6Biology of Gram-Positive Pathogens, Department of Microbiology, Institut Pasteur, Paris, France, 7ERL3526, CNRS, Paris, France
* These authors contributed equally

Summary

Wir beschreiben hier drei verschiedene Protokolle für die in vitro Untersuchung der Konjugation, Transduktion, Transformation und natürliche in Staphylococcus aureus.

Abstract

Ein wichtiges Merkmal der wichtigsten opportunistischen Humanpathogen Staphylococcus aureus ist seine außerordentliche Fähigkeit, schnell eine Resistenz gegen Antibiotika zu erwerben. Genomic Studien zeigen , daß S. aureus trägt viele Virulenz und Resistenzgene in mobilen genetischen Elementen befindet, was darauf hindeutet , dass der horizontale Gentransfer (HGT) spielt eine kritische Rolle in S. aureus Evolution. Jedoch eine vollständige und detaillierte Beschreibung der Methode zu untersuchen HGT in S. aureus verwendet noch fehlt, insbesondere in Bezug auf natürliche Transformation, die in diesem Bakterium kürzlich berichtet wurde. Diese Arbeit beschreibt drei Protokolle , die für die in vitro Untersuchung der HGT in S. aureus geeignet sind , Konjugation, Phagentransduktion und natürliche Transformation. Zu diesem Zweck das cfr - Gen (Chloramphenicol / Florfenicol Widerstand), die die Phenicolen verleiht, Lincosamides, Oxazolidinone, Pleuromutilinen und Streptogramin A (PhLOPSA) -Widerstand Phänotyp, verwendet wurde. Die Mechanismen , durch die S. aureus genetischen Materialien auf andere Stämme über zu verstehen ist wesentlich , um die schnelle Erfassung des Widerstands Begreifen und hilft , die Arten der Verbreitung berichtet in Überwachungsprogrammen oder zur weiteren Vorhersage der Ausbreitung Modus in der Zukunft zu klären.

Introduction

Staphylococcus aureus ist ein symbiotischer Gram-positive Bakterien, die die Haut und Nasenhöhle von Menschen und Tieren natürlich bewohnt. Diese Bakterienarten ist die häufigste Ursache von nosokomialen Infektionen in Krankenhäusern und medizinischen Einrichtungen. Darüber hinaus seine Fähigkeit, Widerstand gegen verschiedene antimikrobielle Verbindungen zu entwickeln, hat die Verwaltung der Infektionen durch dieses Bakterium in eine globale Besorgnis hervorgerufen hat.

Zwei Hauptwege, die an der Verbreitung der Resistenz-Phänotypen sind bekannt: die klonale Verbreitung von resistenten Genotypen und die Verbreitung von genetischen Determinanten unter den bakteriellen Pool. Im Fall von S. aureus, verschiedene antibiotische Resistenzgene (sowie Virulenzdeterminanten) wurden gefunden mit mobilen genetischen Elementen (MGEs) 1 zugeordnet werden. Das Vorhandensein dieser Elemente in das Genom von S. aureus zeigt , dass die Übernahme und Übergabe von Genetic Material innerhalb der Bakterienpopulation könnte eine wichtige Rolle für S. aureus Anpassung und Entwicklung spielen.

Transformation, Konjugation und Transduktion Phage: genetisches Material kann durch drei bekannte Mechanismen der HGT in Gram-positive Bakterien ausgetauscht werden. Transformation beinhaltet die Aufnahme von freier DNA. Zum Erwerb von Fremd-DNA, müssen Bakterienzellen eine besondere physiologische Phase zu entwickeln: die Kompetenz der Bühne. Wenn dieses Stadium erreicht ist, werden kompetente Zellen, die DNA in das Cytoplasma transportieren, neue genetische Determinanten erwerben. Im Fall von S. aureus, die Existenz von natürlichen Transformation kürzlich 2 nachgewiesen wurde. Im Einklang damit hat unsere Gruppe Licht auf die Relevanz der Expression des Seufzen Faktor Schuppen (ein kryptischer Faktor sekundäre Transkription Sigma) in der Kompetenz Stufe der Entwicklung und darüber , wie seine konstitutive Expression S. aureus von reachin fähig machtg die Kompetenz Stufe, die 2 für den Erwerb von resistenten Phänotypen durch natürliche Transformation ermöglicht.

Konjugation ist ein Prozess, der die Übertragung von DNA aus einer lebenden Zelle (Spender) zu einem anderen (Empfänger). Beide Zellen müssen in direktem Kontakt sein, so dass die DNA ausgetauscht werden, während sie durch spezielle Strukturen geschützt werden, wie beispielsweise Rohre oder Poren. Der Transfer von DNA durch dieses Verfahren erfordert die konjugativen Maschinen. In S. aureus, ist der Prototyp konjugativen Plasmids PGO1, die den konjugativen Operon TraA 3 beherbergt.

Phagentransduktion beinhaltet den Transfer von DNA von Zelle zu Zelle durch Bakteriophageninfektion und impliziert die Verpackung von bakterieller DNA, viraler DNA statt, in die Phagen-Capsid. Die meisten von S. aureus - Isolate werden von Bakteriophagen 1 lysogeniert. Bei Stressbedingungen kann Prophagen aus dem bakteriellen Genom herausgeschnitten werdene und Schalten in den lytischen Zyklus.

Dies sind die drei bekannten Mechanismen für die DNA Übertragung in S. aureus. Es gibt einige zusätzliche Transfermechanismen, beispielsweise "pseudo-Transformation" 2 und Phagen-ähnlichen Systemen in der Übertragung von Pathogenitätsinseln 4. Vor kurzem berichteten eine Gruppe , dass "Nanoröhren" bei der Übertragung von zellulären Materialien beteiligt sind (einschließlich Plasmid - DNA) zwischen benachbarten Zellen 5, 6, aber ein Follow-up - Studie wurde von anderen Gruppen bisher nicht erschienen.

Diese Arbeit stellt die notwendige Methodik HGT in S. aureus zu studieren , indem sie die drei wichtigsten Übertragungswege Adressierung Konjugation, Transduktion und natürliche Transformation. Die Ergebnisse mit diesen Methoden gewonnen wurden verwendet , um die Übertragung des cfr - Gen (Chloramphenicol / Florfenicol Widerstand) zu studieren , unterS. aureus - Stämme 7. Diese drei Techniken sind vielseitige Werkzeuge für die Untersuchung von MGE Übertragung in S. aureus.

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Protocol

HINWEIS: Die Stämme und Materialien , die in dieser Arbeit sind in Tabelle 1 und die Tabelle der Materialien aufgeführt sind. In den Übertragungsversuchen, N315 und COL cfr -positiver Derivate wurden als Spender des GRR - Gens (N315-45 und COL-45) verwendet. Diese Stämme wurden zuvor durch Konjugation erhalten, wobei als Spender einer klinischen cfr -positiver Staphylococcus epidermidis - Stamm (ST2), im Anschluss an die Standard - Konjugation Protokoll (siehe unten). Dieser Stamm beherbergte das cfr - Gen auf einem pSCFS7 artigen Plasmid 7.

1. Konjugation Verwendung der Filter-Mating-Methode

HINWEIS: Ein S. aureus - Stamm N315 Durchführung des cfr - Gen (N315-45) 7 (Cm R) wurde als Spender verwendet. COL 8 oder 9 MU50 - Stämme (Tet R, Cm S) wurden als Empfänger verwendet. Doppelt-Lage - resistente Kolonien (Tet R, Cm R) in Gegenwart von 32 mg / l Chloramphenicol plus 8 mg / l Tetracyclin wachsen wurden als putative Transkonjuganten angesehen und die Anwesenheit von cfr durch Kolonie - PCR zu bestimmen , analysiert , und das zu bestimmen Empfänger Anfälligkeit Profil.

  1. Führen Konjugation nach einem zuvor beschriebenen Protokoll 10 mit einigen Änderungen:
    1. Bereiten Sie 5 ml über Nacht Kultur des Spenders und des Empfängers in CASO-Bouillon (TSB) Medium (mit und ohne 32 mg / l Chloramphenicol, jeweils) mit bei 37 ° C schüttelnd.
    2. Stellen Sie die optische Dichte (OD 600) der Übernachtkulturen bis 1 (OD 600 = 1,0) durch frische TSB Medium. Mischungs 0,5 ml der Spenderkultur (N315-45) mit 0,5 ml des Empfängerkultur (COL oder MU50). 1 ml PBS zu dem Gemisch.
    3. Übertragen Sie die Mischung von Bakterien auf einen 0,45 & mgr; m Filtermembran using ein Vakuumpumpsystem.
    4. Setzen Sie die Filtermembranen auf einem Schafsblutagarplatte. 1 Tag bei 37 ° C inkubieren.
      HINWEIS: In diesem Schritt angereicherten Medium notwendig ist, das Wachstum von doppelt-resistenten Zellen zu ermöglichen.
    5. Mit der Filtermembran von der Platte und in 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) suspendieren. Vortex gut alle angeschlossenen Bakterien auf der Membran zu sammeln.
    6. Machen Sie eine serielle 10-fache Verdünnung der Bakteriensuspension durch frische TSB verwendet wird. Platte 100 ul der verdünnten Proben 0-10 -4 auf TSB - Agar (TSA) Platten mit 32 mg / l Chloramphenicol und 8 mg / L Tetracyclin zur Selektion von Transkonjuganten ergänzt. Platte 100 ul der verdünnten Suspension (10 -5 -10 -6) auf TSA - Platten mit 8 mg / l Tetracyclin allein die Gesamtzahl der Empfänger zu zählen. Inkubiere die Platten bei 37 ° C für 18-24 Std.
    7. Analysieren doppelt resistenten Kolonien (putative Transkonjuganten) für die Anwesenheit des cfr - Gens durch Kolonie - PCR 7 und ihre Anfälligkeit Profile (Antibiogramm).
    8. Bestimmen Sie die Antibiogramm durch die minimalen Hemm - Konzentrationen (MHK) von geeigneten Antibiotika nach dem Standard Mikrodilutionsverfahren oder Plattendiffusionsverfahren 11. Die Anfälligkeit Profil der Transkonjuganten muss dem Empfänger identisch sein, mit Ausnahme von Chloramphenicol (und andere Verbindungen , die durch die cfr Gen betroffen). Diese Bestimmung ist wichtig, Tetrazyklin-Resistenz durch die Spenderstamm entwickelt, um auszuschließen.

2. Phagentransduktion

HINWEIS: Der Bakteriophage MR83a Zugehörigkeit zur Siphoviridae Familie (Labor stock) wurde in den Transduktionsexperimente verwendet. N315-45 wurde als cfr Spender für Phagen - Infektion eingesetzt. N315, COL oder MU50-Stämme wurden als Empfänger verwendet. Der Erwerb von cfr wurde durch die ab bestimmtility des Empfängerstamm in Gegenwart von 32 mg / l Chloramphenicol zu wachsen. Kolonien unter diesen Bedingungen wuchsen , wurden analysiert , um die Anwesenheit von cfr (durch Kolonie - PCR) zu bestimmen und die Suszeptibilität Profil zu bestimmen potentielle Kontamination auszuschließen.

  1. Phagenamplifikation auf dem Donator
    1. Bereiten Sie eine Nacht - Kultur von N315-45 in 5 ml Nährlösung , ergänzt mit 3,6 mM Ca 2+ (NBCaCl 2) bei 37 ° C unter Schütteln (180 rpm).
      HINWEIS: Kalzium wird für Phageninfektion erforderlich. Sehen Sie sich die Werkstoff - Tabelle. Nährlösung von anderen Unternehmen könnten Probleme haben, wie Calciumniederschlag.
    2. Bereiten Subkulturen durch die Übernachtkultur verdünnt 1: 1.000 in einem Endvolumen von 10 ml NBCaCl 2 in 50 ml Glasflaschen oder Glasampullen. Wachsen die Bakterien für 1 Stunde bei 37 ° C unter Schütteln (180 rpm).
    3. Bereiten Sie eine Reihe von verdünnten Phagen MR83a in NBCaCl 2 medium (10 -2, 10 -3, 10 -4, 10 -5 und 10 -6). Geben Sie 20 & mgr; l des verdünnten Phagen in die Bakterienkultur. ferner einen Kontrollkultur ohne Phageninfektion, die für das Bakterienzellwachstum als positive Kontrolle dient und verwendet werden kann, die Phagentiter am nächsten Tag zu bestimmen.
    4. Wachsen die Kulturen bei 37 ° C unter leichtem Schütteln (100 rpm) über Nacht.
      HINWEIS: Die Zellen in einem gewissen Ausmaß wachsen, wenn das infizierende Phage nicht im Überschuss vorhanden ist; Dann werden sie in Lyse Phase eintreten aufgrund der Phagenamplifikation durch den lytischen Zyklus. Die Kultur ohne Phagen wird die volle Wachstum zeigen, während Kulturen mit Phagen unterschiedliche Raten der Transparenz zeigen.
    5. Wählen Sie eine oder zwei gelöscht Kulturfläschchen mit der höchsten Verdünnung des zugegebenen Phagen.
    6. Übertragen Sie die Kulturen in 15 ml Zentrifugenröhrchen. In 250 ul Chloroform und gründlich mischen durch die Rohre zu invertieren.
    7. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 5000
    8. Die Überstände in frische Röhrchen und lagern Sie sie bei 4 ° C bis zur Verwendung.
      HINWEIS: Die Phagen für mindestens ein paar Monate stabil ist, aber zu lange die Phagenpräparation Speicherung reduziert die Titer und Transduktionseffizienz.
  2. Die Messung des Phagen - Titer (Phagen - Plaque - Test)
    1. Bereiten Sie Nährlösung Agar (1,5% Agar) Medium; halten Sie es bei 55 ° C in einem Wasserbad warm. Hinzufügen autoklavierten 0,5 M CaCl & sub2 ; -Lösung zu dem Medium bis zu einer Endkonzentration von 3,6 mM. Gießen Sie es in 90 mm Petrischalen (NBCaCl 2 Platten).
    2. Bereiten Sie eine Nacht - Kultur von N315 in 5 ml NBCaCl 2 bei 37 ° C unter Schütteln; dies kann mit der Kontrollkultur ersetzt werden oben beschrieben (Schritt 2.1.3).
    3. In 10 ul der Übernachtkultur in 200 ul NBCaCl 2 und gleichmäßig verteilt auf die NBCaCl 2 - Platte. Stoppen Sie die Verbreitung, wenn die Oberflächedie Platte wird mit Flüssigkeit bedeckt. Lassen Sie die Platte trocken.
    4. Machen Sie eine serielle Verdünnung von 1:10 (von 10 -5 -10 -10) von zuvor hergestellten Phagen (Schritt 2.1.8) unter Verwendung von NBCaCl 2 Medium.
    5. Spot 3 ul jeder Phagen-Verdünnung auf die Platte mit Bakterien bedeckt.
    6. Die Platte über Nacht bei 30 ° C.
    7. Zählen Sie die Plaque - Zahlen und berechnen die Phagen - Titer unter Verwendung der folgenden Gleichung: Plaque bildende Einheit (PFU) / ml = Anzahl der Plaques x Verdünnungsfaktor / getupft Volumen (3 x 10 -3 ml)
  3. Phagentransduktion
    HINWEIS: Der Pool Phagen im vorherigen Schritt (2.1.8) wird verwendet , um die Weiterleitung des cfr - Gens in die S. aureus - Stämme zu testen. In diesem Experiment wurden die Stämme N315, COL oder MU50 als Empfänger verwendet werden.
    1. Bereiten Sie die Nacht - Kultur von N315, COL oder MU50 in 5 ml NBCaCl 2 bei 37 ° C unter Schütteln (180 rpm).
    2. verdünnen ter Phagen in NBCaCl 2 bis ~ 10 9 PBE / ml.
    3. In einem 50 ml - Glasfläschchen, mischen 500 ul Nacht - Kultur, 500 ml frisches NBCaCl 2 und 1 ml Phagen (~ 10 9 pfu / ml); die erwartete Multiplizität der Infektion (MOI) muss 1. Inkubieren der Mischung bei 37 ° C nicht überschreiten, wobei sanft (100 UpM) für 30 min schütteln.
      HINWEIS: Die Wärmebehandlung von Empfängerzellen unmittelbar vor der Zugabe von Phagen (52 ° C für 2 min , um die endogene Restriktionsenzyme zu inaktivieren) können die Effizienz 12 erhöhen.
    4. In 50 ul 20% Na 3 -citrat. Weiter sanft bei 37 ° C für 30 min schütteln.
      HINWEIS: Na 3 -Citrat wirkt als moderate Chelator von Calcium.
    5. Bereiten Sie geschmolzen Hirn-Herz-Infusion (BHI) Agar (1,5% Agar), Medium und halten sie bei 55 ° C in einem Wasserbad.
    6. Übertragen des Bakteriums-Phage Mischung in einen 100 ml Kolben, der 50 ml warmem BHI-Agar, supplementiert mit 32 mg / L chloramphenicol und gut mischen. Gießen Sie die Mischung in die 90 mm Petrischalen.
      HINWEIS: Dieses Verfahren ermöglicht den Nachweis einer geringen Anzahl von wachsenden Kolonien (vermeintlichen Transduktanten).
    7. Die Platte bei 37 ° C für 24 bis 48 Stunden.
    8. Test Weitere die erzeugten Kolonien (Transduktanten) zum Widerstand durch die Kolonien auf neue BHI-Agarplatten mit 32 mg / l Chloramphenicol ergänzt übertragen. Bestätigen Sie die Anwesenheit des cfr - Gens durch Kolonie - PCR 7.

3. Natürliche Transformation

HINWEIS: Die natürliche Transformation Test in S. aureus wurde nach dem Verfahren in unserer früheren Studie 2 beschrieben durchgeführt. Das Derivat N315, N2-2.1 2, 7, wurde als Empfänger verwendet. In diesem Stamm wurde die sigH Locus dupliziert, um konstitutiv exprimieren Seufzen 2. Für detailed Verfahren, wie Seufzen-exprimierenden Kompetenz Varianten zu isolieren, finden Sie eine frühere Beschreibung 2. Wenn der Resistenzmarker übertragen werden Chloramphenicol nicht, pRIT-sigH (Cm R) verwendet werden SIGH auszudrücken, wie zuvor 2 beschrieben. Gereinigte Plasmid - DNA oder ganzen Extrakt aus cfr Erworben S. aureus COL-45 7 wird als Donor - DNA für die Transformation verwendet.

  1. Herstellung von Donor - DNA
    1. Kultivieren COL-45 über Nacht mit in einem 300 ml-Kolben bei 37 ° C schüttelnd enthaltend 50 ml TSB, ergänzt mit 32 mg / l Chloramphenicol. Kultur E. coli HST04 trägt pHY300 Plasmid (Tet R) , der das Plasmid für das Kontrollexperiment zu extrahieren.
      HINWEIS: HST04 (dam - / dcm -) fehlt die DNA Gene Methylase 13. Andere herkömmliche Stämme mit DNA Methylasen können auch nützlich seind, um die DNA-Donor herzustellen, weil die DNA-Methylierungsstatus nicht die Transformationseffizienz beeinflussen. Alternativ pT181 Plasmid aus dem S. aureus - Stamm gereinigt COL können auch 2 als positive Kontrolle für den Transformationsassay verwendet werden.
    2. Sammle die Zellen durch Zentrifugation (8000 xg für 10 min bei 4 ° C).
    3. Extrahieren Sie die Plasmide, die ein Plasmid-DNA-Extraktions-Kits oder einer herkömmlichen DNA-Reinigungsverfahren unter Verwendung der gesamten DNA zu reinigen.
    4. Quantifizieren die gereinigte DNA von Spektrometer und halten sie bei 4 ° C bis zur Verwendung.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine neue DNA-Präparation für die Transformation Assay, in der Regel weniger als eine Woche alt. Alte DNA-Präparate zu reduzieren, die Effizienz der Transformation.
  2. Transformation Test
    1. Kultur der Empfängerzelle (N2-2.1) über Nacht in 5 ml TSB bei 37 ° C unter Schütteln.
    2. Übertragen 0,5 ml Übernachtkultur in ein 1,5-ml-Röhrchen. Precipitate , die Zellen durch Zentrifugation (10.000 × g für 1 min bei 4 ° C).
    3. Suspend die Zellen mit 10 ml CS2 Medium in einem 50-ml-Tube.
      HINWEIS: CS2 Medium ist ein komplettes synthetisches Medium , das 2 in S. aureus Kompetenz für natürliche Transformation induziert (siehe die Zusammensetzung des Mediums in der Materialtabelle). Andere Standard - Labormedien, wie TSB oder BHI, sind nicht geeignet für die Transformation 2, 13.
    4. Wachsen die Bakterien bei 37 ° C mit (180 Umdrehungen pro Minute), bis zur späten exponentiellen Phase Schütteln (ca. 8 h).
    5. Ernte der Zellen durch Zentrifugation (5000 × g für 5 min bei 4 ° C).
    6. Resuspendieren der Zellen in 10 ml frischem Medium CS2.
    7. Zugabe von 10 & mgr; g gereinigter Plasmid oder Genom-DNA (Schritt 3.1.4) zu der Zellsuspension. Schütteln bei 37 ° C und 180 Upm für 2,5 Stunden.
      HINWEIS: Kürzere Inkubationszeiten mit DNA (<2,5 h) führen zu geringeren transformationen Frequenzen.
    8. Sammle die Zellen durch Zentrifugation (5000 × g für 5 min bei 4 ° C).
    9. Resuspendieren der Zellen in 10 ml BHI-Medium. Mischen der Zellsuspension mit 90 ml geschmolzenem BHI-Agar (55 ° C) Nahrungsergänzungsmittel mit 32 mg / l Chloramphenicol (oder 5 mg / L Tetracyclin in dem Kontrollexperiment). Gießen Sie die Mischung in die 90 mm Petrischalen. Geschwind kühl und lassen Sie die Agar verfestigt.
    10. Inkubiere die Platten bei 37 ° C für 2 Tage.
    11. Replizieren erzeugten Kolonien (Trans) durch die Kolonien übertragen (unter Verwendung von Zahnstochern) auf neue BHI-Agar-Platten, die entsprechenden Antibiotika enthalten, ihre Widerstandseigenschaften zu bestätigen. Bestätigen Sie die erworbene Resistenz - Gen (cfr oder tetM) durch Kolonie - PCR - 7.

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Representative Results

Die hier dargestellten Ergebnisse wurden bereits veröffentlicht (aus Referenz 7 mit Zustimmung des Herausgebers angepasst). Wir untersuchten die möglichen Übertragungswege des GRR - Gen, das Linezolid Widerstand mit niedrigem Pegel bewirkt , und die Expression des PhLOPSA-Resistenz - Phänotyp 14, 15 in S. aureus - Stämme, durch drei Mechanismen der HGT zu untersuchen.

Figur 1 zeigt die Ergebnisse in konjugativen Assays erhalten. Die Konjugation Protokoll ist nützlich für die Interspezies-Übertragung (A) sowie innerhalb derselben Art Übertragung (B), zu ähnlichen Ergebnissen führen den gleichen konjugativer Vektor in verschiedenen konjugativer Spendern. Der Wirkungsgrad der Konjugation ist als die Anzahl der Transkonjuganten (koloniebildende Einheiten oder CFU / ml) / Anzahl der Empfängerzellen (CFU / ml) berechnet,. Die erhaltenen Frequenzen lagen im Bereich von 1 x 10 -6 bis 1 x 10 -5, mit ähnlichen Werten unter Verwendung von S. epidermidis oder S. aureus als Donator.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst cfr Erworben S. aureus konnten die cfr Gen auf andere S. aureus - Stämme durch Konjugation sowie durch Phagentransduktion weiter zu übertragen. Allerdings deuten die Ergebnisse die Abwesenheit von natürlichen Transformation für cfr Übertragung, obwohl es für einen anderen Resistenzmarker (tetM - Gen auf dem Plasmid pHY300) erkannt wurde.

Abbildung 1
Abbildung 1: Darstellung des Empfängers und Transkonjuganten KBE in konjugativer Assays erhalten. Die klaren Balken stellen die Gesamtempfängerstämme isoliert nach18-24 h Kultur in selektiven Medien für Empfängerstämme. Die ausgefüllten Balken repräsentieren die Gesamtdoppelresistente nach 18-24 Stunden der Kultur in selektiven Medien erhaltenen Stämme für Transkonjuganten Stämme. (A) Inter-Spezies konjugativer Test. Staphylococcus epidermidis (SE45) wurde als cfr Spender und der Staphylococcus aureus N315 Stamm wurde als Empfänger verwendet. Der N315-45 Transkonjuganten Stamm beherbergte das cfr - Gen in einem pSCFS7 artigen Plasmid inseriert. Dieser Stamm wurde als die Quelle der cfr in den MRSA-to-MRSA Übertragungs Assays verwendet. (B) MRSA-to-MRSA konjugativer Experimente. Die zuvor erhaltene N315-45 wurde als Spender verwendet, und die COL oder MU50-Stämme wurden als Empfänger verwendet. Die Durchschnittswerte von zwei unabhängigen Experimenten mit der Standardabweichung (SD) angegeben. Bitte klicken Sie hier ein , um zu vergrößernVersion dieser Figur.

Der Stamm Name Beschreibung Referenzquelle
Bakterienstämme
SE45 Klinische isolatated S. epidermidis 7
N315 Pre-MRSA, KMR ErmR 9
COL MRSA, Trage Tetracyclinresistenz-Gen auf dem Plasmid pT181 8
MU50 MRSA, VISA 9
N315-45 Derivat von N315, cfr - Gen auf einem von S. epidermidis durch Konjugation erhalten pSCFS7 artigen Plasmid tragen 7
COL-45 derivative von COL, cfr - Gen auf einem pSCFS7 artigen Plasmid von S. epidermidis durch Konjugation erhalten tragen 7
RN4220-45 Derivat von RN4220, cfr - Gen auf einem von S. epidermidis durch Konjugation erhalten pSCFS7 artigen Plasmid tragen 7
N2-2.1 Seufz aktive Zelle von N315 abgeleitet, für die Transformation Zelle natürliche Kompetenz ermöglicht 7
E. coli HST04 Schaden / DCM- pHY300 E. coli HST04 Schaden / DCM (Takara) tragenden Tetracyclinresistenz pHY300 Plasmid 11
Bakteriophagen
MR83a Siphoviridae Familie Labor Lager
MR83-45 Phagen MR83a eine pSCFS7 artige Plasmid Verpackung cfr Gen nach Infekt tragenIon in N315-45 Diese Studie

Tabelle 1: Liste der in dieser Arbeit verwendeten Stämme.

HTG Spender Empfänger Frequenz
Konjugation N315-45 COL 1,00 x 10 -6
N315-45 MU50 1,29 x 10 -5
transduction N315-45 COL 1,00 x 10 -11
N315-45 MU50 3,68 x 10 -10
N315-45 N315 6,88 x 10 -10
Transformation Plasmide (COL-45) N2-2.1 ULD
Whole DNA (COL-45) N2-2.1 ULD
pHY300 (Kontrolle) N2-2.1 6,52 x 10 -10

Tabelle 2: HTG Frequenzen von cfr Genübertragung in MRSA-to-MRSA Experimenten erhalten. Konjugative Übertragung wurde mit der cfr -positiver Derivat (N315-45) als Donor N315 ausgewertet. Die Häufigkeit der Übertragung in diesen Experimenten wird als die Anzahl der Transkonjuganten / Empfänger-Zellen exprimiert wird. Transduction wurde mit der transduzierenden Phagen MR83a ausgewertet, aus dem N315-45 Stamm verstärkt. Die Übertragungsfrequenz wurde als die Anzahl der Transduktanten / PBE berechnet. Transformation Assays wurden unter Verwendung von gereinigten DNA (Plasmid oder ganze zelluläre DNA) als Spender durchgeführt. Die Transformationshäufigkeit wurde als die Anzahl von Transformanten / Empfängerzellen berechnet. ULD: unter Grenzstanddetektion.

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Discussion

Diese Arbeit beschreibt die drei wichtigsten Methoden , um die HGT genetischen Determinanten im S. aureus zu studieren. Obwohl Transduktion und Konjugation seit Jahrzehnten untersucht wurde, wurde die Existenz der natürlichen Transformation erst vor kurzem 2 anerkannt. Somit ist S. aureus mit allen drei großen ausgestattet Modi von HGT und Testen alle von ihnen benötigt wird , um die mögliche Verbreitung Wege von genetischen Determinanten zu klären. Das Ziel dieser Arbeit ist abgeschlossen Protokolle zu kompilieren und praktische Informationen über die Methoden in einer zuvor veröffentlichten Arbeiten 7 verwendet zur Verfügung zu stellen. Obwohl Konjugation und Transduktion Protokolle verfügbar sind, ist dies das erste Papier , in dem eine detaillierte Transformationsprotokoll beschrieben.

Konjugation des Filter-mating-Methode ist eine einfache Technik und kann auf die Untersuchung von konjugativen Transfer in verschiedenen Bakterienarten angewendet werden,= "xref"> 7, 10. Durch die Verwendung des standardisierten Inokula zählt Empfänger nach 18-24 h einen Wert von ~ 10 9 KBE / ml erreichen. Transkonjuganten zählt , sind variabel und Werte zeigen eine starke Belastung zu Stamm Abhängigkeit, aber in der Regel eine Transkonjuganten Bereich von 10. Februar - 10. MAI wurde erhalten , wenn die Konjugation Ergebnisse positiv waren. Unter Verwendung des Protokolls hier vorgesehen war die Nachweisgrenze erreicht <10 Transkonjuganten / mL. Diese Grenze kann durch Konzentrieren der Filter Suspension optimiert werden.

Die natürliche Transformation hier beschriebene Protokoll wurde in S. aureus N315-derivate Stämme etabliert. Die Verwendung von CS2 Medium ist kritisch für die Umwandlung, da die Umwandlung in anderen Standard - Labormedien wie TSB und BHI 13 nicht nachweisbar ist.

Die Verwendung von Langzeit gespeichert Plasmiden (zB pT181 und pHY300) als Donor ergab etwa eine 10- bis 50-fach reduzierter Frequenz (Daten nicht gezeigt), könnte diese DNA-Qualität was darauf hindeutet, beeinflussen die Transformationsfrequenz. Es ist bekannt , daß Plasmide eingekerbt 16 in B. subtilis natürliche Transformation geeignet sind.

DNA erhalten sowohl von S. aureus und E. coli können als Spender in natürlichen Transformationstests verwendet werden, was darauf hindeutet , dass eine Beschränkung Barriere nicht die natürliche Transformation nicht hemmt. Wir beobachteten auch die gleiche Transformationsfrequenz zwischen der DNA , hergestellt aus E. coli HST04 (dam - / dcm -) fehlt die DNA - Gene Methylase und von JM109, die Idee unterstützen , dass Methylierungsstatus nicht die Transformationsfrequenz nicht beeinflusst.

Es sollte beachtet werden , dass die Transformationshäufigkeit unter Verwendung dieses Protokolls erkannt war gering (~ 10 -9 -10 -10) und die transformierbare Stämme werden auf N315 Derivate beschränktclass = "xref"> 2. Es ist wahrscheinlich , dass die Transformationseffizienz in S. aureus - Stamm-spezifisch sein könnte, wie dies auch in anderen transformierbaren Bakterien berichtet wurde 15, 16, 17. Weitere Studien sind im Gange die Transformationseffizienz zu verbessern; Dies wird an anderer Stelle beschrieben werden.

Phagentransduktion scheint die am weitesten verbreitete HGT Mechanismus in S. aureus zu sein , weil die meisten S. aureus - Isolaten von Bakteriophagen 18 lysogeniert werden. Die Infektionsfähigkeit des transduzierenden Phagen hängt von Wirts Suszeptibilität und muss durch Plaque-Assay überprüft werden. Eine weitere Einschränkung der Phagentransduktion ist die Größe der DNA. Kleine DNA effizient übertragen werden können, aber DNA - Fragmente größer als 45 kb nicht in der Staphylokokken - -Phagenkopf 19 verpackt werden. Allerdings hat eine neue Riesen-Staphylokokken-Phagen kürzlich been isoliert von der Umgebung, und itcould denkbar Lage sein , zu übertragen , größere DNA - Fragmente 20.

Die Plaque-Assay-Verfahren in dieser Arbeit beschrieben ist einfacher als das herkömmliche Protokoll, in dem Top-Agar verwendet wird. Jedoch erfordert das vorliegende Verfahren, dass die Bakterienzellen gleichmäßig verteilt, um winzige Plaques zu erkennen, die auf der Oberfläche erzeugt. Um das zu erreichen Verbreitung der vollständig selbst, empfehlen wir die Verbreitung genügend Volumen der Bakteriensuspension auf der Agar-Oberfläche, zu stoppen, wenn die Flüssigkeit gleichmäßig die Agar-Oberfläche bedeckt. Dann trocknen die Platten in Luftstrom in einem sauberen Bank. Wenn es notwendig ist, die Lysogenisierung des transduzierenden Phagen, ein niedriger Multiplizität der Infektion zu vermeiden, wird empfohlen, (das MOI sollte nicht überschreiten 1). Lysogenisiert Zellen können durch ihre verminderte Anfälligkeit gegenüber Phagen in dem Plaque-Assay zu unterscheiden.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic Soy Broth (TSB)  Becton Dickinson  211825
Brain Heart Infusion (BHI) Becton Dickinson  211059
Nutrient Broth No. 2 Oxoid CM0067
Sheep blood agar Eiken Chemical Co.,Ltd. E-MR96 Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer. 
Agar powder Wako Pure Chemical Industries 010-08725
Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate) Wako Pure Chemical Industries 191-01785
Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter Merck Milipore HAWG 02500
QIAfilter Plasmid Midi kit QIAGEN 12243

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Immunologie Ausgabe 121, Horizontaler Gentransfer Konjugation Transduktion Transformation Antibiotika-Resistenz.
Methodik für die Studie des horizontalen Gentransfers in<em&gt; Staphylococcus aureus</em
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Cafini, F., Thi Le Thuy, N.,… More

Cafini, F., Thi Le Thuy, N., Román, F., Prieto, J., Dubrac, S., Msadek, T., Morikawa, K. Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (121), e55087, doi:10.3791/55087 (2017).

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