Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Методика изучения горизонтальных генного переноса в Published: March 10, 2017 doi: 10.3791/55087
Automatic Translation
*1,2, *3, 4, 5, 6,7, 6,7, 1
1Division of Biomedical Science, Faculty of Medicine, University of Tsukuba, 2Department of Basic Biomedical Science, Universidad Europea de Madrid, 3Human Biology Program, School of Integrative and Global Majors, University of Tsukuba, 4Laboratory of Nosocomial Infections, Department of Bacteriology, Centro Nacional de MicrobiologÍa, Instituto de Salud Carlos III, 5Division of Microbiology, Department of Medicine, School of Medicine, Universidad Complutense, 6Biology of Gram-Positive Pathogens, Department of Microbiology, Institut Pasteur, Paris, France, 7ERL3526, CNRS, Paris, France
* These authors contributed equally

Summary

Мы опишем здесь три различные протоколы для исследования в пробирке конъюгации, трансдукции и естественной трансформации в золотистый стафилококк.

Abstract

Одной важной особенностью основных оппортунистических патогеном человека золотистый стафилококк является его исключительная способность быстро приобретают устойчивость к антибиотикам. Геномные исследования показывают , что S. стафилококк несет множество генов вирулентности и сопротивления , расположенные в мобильных генетических элементов, предполагая , что горизонтальный перенос генов (HGT) играет важную роль в эволюции золотистого стафилококка. Тем не менее, полное и подробное описание методологии , используемой для изучения HGT в золотистого стафилококка до сих пор отсутствует, особенно в отношении естественное преобразование, которое было недавно сообщалось в этой бактерии. Эта работа описывает три протокола, которые полезны для экстракорпоральное исследования ХГТ в золотистого стафилококка: конъюгации, трансдукции фагом и естественной трансформации. С этой целью, ген ЧФР (хлорамфеникол / сопротивления флорфеникол), которое дает Phenicols, Lincosamides, Оксазолидиноны, плевромутилины и стрептограминов А (PhLOPSА) -resistance фенотипом, был использован. Понимание механизмов , посредством которых золотистого стафилококка трансферты генетические материалы других штаммов имеет важное значение для осмысления быстрое приобретение сопротивления и помогает уточнить режимы распространения , представленные в программах наблюдения или для дальнейшего прогнозирования режима расширения в будущем.

Introduction

Золотистый стафилококк является синантропных грамположительные бактерии , которые , естественно , населяет кожу и носовую полость человека и животных. Этот бактериальный вид является основной причиной внутрибольничных инфекций в больницах и медицинских учреждениях. Кроме того, его способность к развитию устойчивости к различным антимикробным соединений сделало управление инфекций, вызванных этой бактерией в глобальную озабоченность.

Два основных пути, участвующие в распространении фенотипов сопротивления известны: клонального распространение устойчивых генотипов и распространения генетических детерминант среди бактерий бассейна. В случае золотистого стафилококка, различных генов устойчивости к антибиотикам (а также вирулентности детерминанты) , как было установлено, связаны с мобильными генетическими элементами (МГЭС) 1. Наличие этих элементов в геноме золотистого стафилококка указывает на то, что приобретение и передача генэтический материал в популяции бактерий может играть важную роль для адаптации стафилококка S. и эволюции.

Генетический материал может быть обменен через три хорошо известных механизмов ХГТ в грам-положительных бактерий: трансформации, конъюгации и трансдукции фага. Трансформация предполагает поглощение свободной ДНК. Для того, чтобы приобрести чужеродную ДНК, бактериальные клетки необходимо разработать специальную физиологическую фазу: стадия компетенции. При достижении этой стадии компетентные клетки способны транспортировать ДНК в цитоплазму, приобретая новые генетические детерминанты. В случае золотистого стафилококка, существование естественной трансформации было недавно продемонстрировано 2. В соответствии с этим, наша группа пролить свет на актуальность экспрессии фактора Вздох (зашифрованное вторичный фактор транскрипции Sigma) в стадии развития компетентности и о том , как его экспрессия гена оказывает золотистого стафилококка , способный Reachinг стадия компетентности, которая позволяет на приобретение устойчивых фенотипов путем естественной трансформации 2.

Сопряжение представляет собой процесс, включающий передачу ДНК из одной живой клетки (донора) к другому (получателю). Обе клетки должны находиться в непосредственном контакте, позволяя ДНК, подлежащей обмену в то время как защищен специальными составами, такими как трубы или поры. Перенос ДНК с помощью этого метода требует конъюгативная машины. В золотистого стафилококка, плазмиды прототип конъюгативная является PGO1, который таит в себе конъюгативных оперона Traa 3.

Фаг трансдукция включает в себя перенос ДНК от клетки к клетке через бактериофага инфекции и подразумевает упаковку бактериальной ДНК, вместо вирусной ДНК, в фага капсида. Большинство из золотистого стафилококка изолятов lysogenized бактериофагами 1. При стрессовых условиях, профаги может быть вырезан из бактериального геномае и сдвиг в сторону литического цикла.

Это три хорошо известные механизмы передачи ДНК в золотистого стафилококка. Есть некоторые дополнительные механизмы передачи, такие как "псевдо-трансформация» 2 и фаг-подобных систем в передаче патогенности островов 4. Недавно одна группа сообщила , что "Нанотрубки" участвуют в передаче клеточных материалов ( в том числе плазмидной ДНК) между соседними клетками 5, 6, но последующие исследования не появился из других групп до сих пор.

Эта работа обеспечивает необходимую методологию для изучения HGT в золотистого стафилококка путем решения трех основных путей передачи: конъюгация, трансдукция, и естественное преобразование. Результаты , полученные с помощью этих методик были использованы для изучения передачи СМО гена (хлорамфеникол / сопротивления флорфеникол) средиЗолотистого стафилококка штаммы 7. Эти три метода являются универсальными инструментами исследования передачи MGE в золотистого стафилококка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: штаммы и материалы , используемые в этой работе, приведены в таблице 1 и таблице материалов, соответственно. В экспериментах по передаче, N315 и COL ЧФР -позитивных производные были использованы в качестве доноров СМО гена (N315-45 и Col-45). Эти штаммы были ранее получены путем конъюгации, с использованием в качестве донора клинической -положительным Staphyloccocus CFR эпидермидис штамм (ST2), в соответствии со стандартным протоколом сопряжению (см ниже). Этот штамм таил СМО ген на pSCFS7-подобной плазмиды 7.

1. Сопряжение Использование метода Filter-ответная

Примечание: штамм золотистого стафилококка N315 , несущий ген (КФП) N315-45 7 (Cm R) использовали в качестве донора. COL 8 или Mu50 9 штаммов (TET R, S) Cm использовались в качестве реципиентов. ДвойнымКолонии , устойчивые к (Tet R, Cm R) , способны расти в присутствии 32 мг / л хлорамфеникола плюс 8 мг / л тетрациклина рассматривались в качестве предполагаемых трансконъюгантов и анализировали для определения наличия СМО с помощью ПЦР колоний и для определения получатель восприимчивость профиль.

  1. Выполните сопряжение после описанного выше протокола 10 с некоторыми изменениями:
    1. Подготовка 5 мл ночной культуры донора и реципиента в трипсиновый соевый бульон (ТСБ) в среде (с и без 32 мг / л хлорамфеникола, соответственно), при встряхивании при 37 ° C.
    2. Регулировка оптической плотности (OD 600) из ночных культур до 1 (OD 600 = 1,0) с использованием свежей TSB среды. Смешать 0,5 мл культуры-донора (N315-45) с 0,5 мл культуры-реципиента (COL или Mu50). Добавьте 1 мл PBS к смеси.
    3. Перенести смесь бактерий на 0,45 мкм мембранный фильтр USI внг систему вакуумного насоса.
    4. Положите фильтр мембраны на овца кровяным агаром. Инкубируют при 37 ° С в течение 1 дня.
      Примечание: На этом этапе, обогащенная среда необходима для обеспечения роста двойных резистентных клеток.
    5. Вынуть мембрану фильтра из пластины и приостановить в 10 мл фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). Vortex хорошо, чтобы собрать все бактерии, прикрепленные на мембране.
    6. Сделать серийные 10-кратное разведение бактериальной суспензии с использованием свежей TSB. Пластина 100 мкл воды 0-10 -4 разведенных образцов на TSB агар (TSA) пластины , дополненной 32 мг / л хлорамфеникола и 8 мг / л тетрациклина для выбора трансконъюгатов. Пластина 100 мкл разведенной суспензии (10 -5 -10 -6) на TSA пластинах с использованием только 8 мг / л тетрациклина , чтобы подсчитать общее число получателей. Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение 18-24 ч.
    7. Анализ двойных устойчивые колонии (мнимые трансконъюгантов) на наличие КФген г путем ПЦР колоний 7 и их профили восприимчивости (антибиограммой).
    8. Определить Antibiogram путем измерения минимальной подавляющей концентрации (МИКО) соответствующих антибиотиков в соответствии со стандартным методом микроразведений или диффузионного диска методом 11. Профиль восприимчивость трансконъюгантов должна быть идентична получателю, за хлорамфеникол (и других соединений , пострадавших от гена КФП) за исключением того . Это определение имеет важное значение, чтобы исключить устойчивость к тетрациклину, разработанной штамма-донора.

2. Фаг Трансдукция

ПРИМЕЧАНИЕ: бактериофаг MR83a , принадлежащий к семейству Siphoviridae (лабораторный запас) был использован в экспериментах трансдукции. N315-45 был использован в качестве донора для КФП фаговой инфекции. N315, COL, или Mu50 штаммы были использованы в качестве реципиентов. Приобретение СМО была определена абility штамма-реципиента расти в присутствии 32 мг / л хлорамфеникола. Колонии , растущие в этих условиях были проанализированы , чтобы определить наличие СМО (по ПЦР колоний) и для определения профиля чувствительности , чтобы исключить возможность загрязнения.

  1. Фаг усиление на донора
    1. Подготовка ночной культуры N315-45 в 5 мл питательного бульона с добавлением 3,6 мМ Ca 2+ (NBCaCl 2) при 37 ° C при встряхивании (180 оборотов в минуту).
      Примечание: Кальций необходим для фаговой инфекции. См Материалы табл. Питательный бульон из других компаний могут возникнуть проблемы, такие как осаждение кальция.
    2. Готовят субкультуры путем разбавления в течение ночи культуры в соотношении 1: 1000 в конечном объеме 10 мл NBCaCl 2 в 50 мл стеклянных флаконах или стеклянных флаконах. Grow бактерии в течение 1 часа при 37 ° C при встряхивании (180 оборотов в минуту).
    3. Приготовьте серию разбавленных фага MR83a в NBCaCl 2 лечебгм (10 -2, 10 -3, 10 -4, 10 -5 и 10 -6). Добавьте 20 мкл разведенных фага в бактериальную культуру. Также приготовьте культуру управления без фаговой инфекции, которая служит в качестве положительного контроля роста бактериальных клеток и может быть использован для определения титра фага на следующий день.
    4. Grow культур при температуре 37 ° С при осторожном встряхивании (100 оборотов в минуту) в течение ночи.
      Примечание: Клетки будут расти в некоторой степени, когда вдувания фага не превышает; то, что они войдут в фазу лизиса за счет усиления фага через цикл литической. Культура без фага покажет полный рост, в то время как культуры с фага покажет различные показатели прозрачности.
    5. Выберите один или два освобоженные ампул культуры с наибольшим разведением добавленного фага.
    6. Передача культуры в 15 мл центрифужные пробирки. Добавить 250 мкл хлороформа и тщательно перемешать переворачиванием пробирки.
    7. Центрифуга труб в 5000
    8. Передача супернатанты в свежие пробирки и хранить их при температуре 4 ° С до использования.
      Примечание: Фаг стабилен в течение по крайней мере несколько месяцев, но хранить препарат фага слишком долго снижает эффективность титра и трансдукции.
  2. Измерение титра фага (анализ бляшек фага)
    1. Приготовьте питательный бульон, агар (1,5% агар) среды; держать его в тепле в водяной бане при температуре 55 ° C. Добавить автоклавированы 0,5 2 М раствора CaCl к среде до конечной концентрации 3,6 мМ. Налейте его в 90 мм чашки Петри (NBCaCl 2 пластин).
    2. Подготовка ночной культуры N315 в 5 мл NBCaCl 2 при 37 ° C при встряхивании; это может быть замещена культурой управления, описанной выше (этап 2.1.3).
    3. Добавьте 10 мкл в течение ночи культуры в 200 мкл NBCaCl 2 и равномерно распределены на тарелку NBCaCl 2. Остановить распространение, когда поверхностьпластина покрыта жидкостью. Пусть пластины в сухом состоянии.
    4. Сделать серийный разведение 1:10 (от 10 -5 -10 -10) из предварительно полученного фага (этап 2.1.8) с использованием NBCaCl 2 среды.
    5. Точечный 3 мкл каждого фагового разбавления на пластину, покрытую бактериями.
    6. Инкубируйте планшет в течение ночи при температуре 30 ° C.
    7. Подсчитайте число бляшек и расчета титра фага , используя следующее уравнение: бляшкообразующих единицы (КОЕ) / мл = число бляшек х фактор Разбавление / пятнистый объем (3 × 10 -3 мл)
  3. Фаг трансдукции
    ПРИМЕЧАНИЕ: фаг пула , полученного на предыдущей стадии (2.1.8) используется для проверки трансдукцию СМО гена в штаммы золотистого стафилококка. В этом эксперименте штаммы N315, COL, или Mu50 используются в качестве получателей.
    1. Подготовка ночной культуры N315, COL или Mu50 в 5 мл NBCaCl 2 при 37 ° С при встряхивании (180 оборотов в минуту).
    2. Развести тон фаговых в NBCaCl 2 до ~ 10 9 БОЕ / мл.
    3. В стеклянную пробирку емкостью 50 мл, смешивают 500 мкл ночной культуры, 500 мкл свежей NBCaCl 2, и 1 мл фага (~ 10 9 БОЕ / мл); ожидаемая множественность инфекции (MOI) не должна превышать 1. Выдержите смесь при температуре 37 ° С при осторожном встряхивании (100 оборотов в минуту) в течение 30 мин.
      Примечание: Термическая обработка клеток - реципиентов непосредственно перед добавлением фага (52 & deg ; С в течение 2 мин , чтобы инактивировать эндогенной рестриктаз) может увеличить эффективность 12.
    4. Добавляют 50 мкл 20% Na 3 -Citrate. Продолжайте осторожном встряхивании в течение 30 мин при 37 ° С.
      Примечание: На 3 -Citrate действует как умеренное хелатор кальция.
    5. Приготовьте расплавленное сердечно-мозговой инфузии (BHI) агар (1,5% агар) среду и держать его на водяной бане при температуре 55 ° C.
    6. Перенести бактерия-фага смесь в колбу емкостью 100 мл, добавляют 50 мл теплой BHI агаром, дополненной 32 мг / л chloramphenicol, и хорошо перемешать. Вылейте смесь в чашки Петри 90 мм.
      Примечание: Этот метод позволяет обнаруживать небольшое число растущих колоний (мнимые трансдуктанты).
    7. Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение 24-48 ч.
    8. Дальнейшее тестирование сгенерированные колонии (трансдуктанты) для сопротивления путем переноса колоний на новые BHI чашки с агаром, дополненной 32 мг / л хлорамфеникола. Подтвердить наличие СМО гена с помощью ПЦР колонии 7.

3. Природные трансформации

Примечание: Естественный анализ трансформации в S.aureus , проводилась в соответствии с методом , описанным в предыдущем исследовании 2. Производная N315, N2-2.1 2, 7, был использован в качестве получателя. В этом штамме Вздох локус продублированы таким образом , чтобы конститутивно экспрессируют вздыхать 2. Для йеболело процедуры о том , как изолировать вздыхать экспрессирующие варианты компетентности, пожалуйста , см предыдущее описание 2. Если сопротивление маркер для передачи не хлорамфеникол, Прит-SIGH (Cm R) , могут быть использованы для экспрессии вздыхать, как описано выше 2. Плазмидной или весь экстракт ДНК из СМО -acquired золотистого стафилококка COL-45 7 используется в качестве донорной ДНК для трансформации.

  1. Получение ДНК - донора
    1. Выращивают COL-45 в течение ночи при встряхивании при 37 ° С в 300 мл колбу, содержащую 50 мл TSB, дополненной 32 мг / л хлорамфеникола. Культура кишечной палочки HST04 проведения pHY300 плазмида (Tet R) , для извлечения плазмиды для контрольного эксперимента.
      Примечание: HST04 (дамба - / ДХМ -) не хватает ДНК метилазы генов 13. Другие традиционные штаммы с метилаз ДНК также могут быть использованыd подготовить Донор ДНК, так как состояние метилирование ДНК не влияет на эффективность трансформации. В качестве альтернативы, pT181 плазмида очищенный из штамма золотистого стафилококка COL также может быть использован в качестве положительного контроля для анализа трансформации 2.
    2. Собирают клетки центрифугированием (8000 х г в течение 10 мин при 4 ° С).
    3. Извлечение плазмид с использованием набора для экстракции плазмидной ДНК или обычный способ очистки ДНК, чтобы очистить всю ДНК.
    4. Количественная очищенной ДНК с помощью спектрометра и держать его при температуре 4 ° С до использования.
      Примечание: Используйте свежий препарат ДНК для анализа трансформации, обычно менее одной недели старой. Препараты ДНК Старый снижают эффективность трансформации.
  2. Трансформация анализа
    1. Культура клетке реципиента (N2-2.1) в течение ночи в 5 мл TSB при 37 ° C при встряхивании.
    2. Перенести 0,5 мл ночной культуры в 1,5 мл пробирку. PrecipiTate клетки центрифугированием (10000 х г в течение 1 мин при 4 ° С).
    3. Суспендирования клеток с 10 мл CS2 среды в 50 мл пробирку.
      Примечание: CS2 среда представляет собой полное синтетическая среда , которая вызывает компетентность для естественной трансформации золотистого стафилококка 2 (см состав среды в материале таблице). Другие стандартные лабораторные носители, такие как TSB или BHI, не подходят для трансформации 2, 13.
    4. Grow бактерий при температуре 37 ° C при встряхивании (180 оборотов в минуту) до поздней экспоненциальной фазы (около 8 часов).
    5. Сбора клеток центрифугированием (5000 х г в течение 5 мин при 4 ° С).
    6. Ресуспендируют клеток в 10 мл свежей среды CS2.
    7. Добавляют 10 мкг очищенной плазмиды или геномной ДНК (этап 3.1.4) к клеточной суспензии. Взболтать при температуре 37 ° C и 180 оборотов в минуту в течение 2,5 ч.
      Примечание: Более короткое время инкубации с ДНК (<2,5 ч) приводит к снижению элеменЧастоты ormation.
    8. Собирают клетки центрифугированием (5000 мкг в течение 5 мин при 4 ° С).
    9. Ресуспендируют клеток в 10 мл BHI среды. Смешайте клеточной суспензии с 90 мл расплавленного BHI агаром (55 ° C), добавка с 32 мг / л хлорамфеникола (или 5 мг / л тетрациклина в контрольном опыте). Вылейте смесь в чашки Петри 90 мм. Стремительно круто и агар затвердеть.
    10. Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение 2-х дней.
    11. Репликация сгенерированные колонии (трансформантов) путем переноса колоний (с помощью зубочистки) новым BHI агаром, содержащих соответствующие антибиотики, чтобы подтвердить свои характеристики сопротивления. Подтвердите приобретенный ген устойчивости (летальность или tetM) по колонии PCR 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Результаты , представленные здесь , были опубликованы ранее (адаптировано из ссылки 7 с разрешения издателя). Мы изучили возможные пути передачи гена ЧФР, что приводит к низкоуровневой линезолид сопротивление и экспрессию PhLOPSA сопротивления фенотипа 14, 15 штаммов золотистого стафилококка, исследуя три механизма ХГТ.

На рисунке 1 представлены результаты , полученные в конъюгативных анализах. Протокол конъюгация полезен для передачи межвидовой (А), а также передачи внутривидовая (B), что дает такие же результаты, используя один и тот же вектор конъюгативная в различных конъюгативных доноров. Эффективность сопряжения рассчитывается как Nº трансконъюгантов (колониеобразующих единиц или КОЕ / мл) / Nº клеток-реципиентов (КОЕ / мл), Полученные частоты в диапазоне от 1 × 10 -6 до 1 × 10 -5, с аналогичными значениями , используя S. эпидермальный или золотистого стафилококка в качестве донора.

Результаты приведены в таблице 2. СМО -acquired золотистого стафилококка были в состоянии далее передавать СФНА ген на другие штаммы золотистого стафилококка путем конъюгации, а также с помощью фага трансдукции. Тем не менее, полученные результаты указывают на отсутствие естественного преобразования для передачи СМО, хотя он был обнаружен для другого маркер устойчивости (tetM гена на плазмиде pHY300).

Рисунок 1
Рисунок 1: Представление получателей и transconjugant КОЕ , полученных в конъюгативных анализах. Четкие столбики представляют общие штаммы, выделенные после того, как получателей18-24 ч культуры в селективной среде для штаммов-реципиентов. Заполненные столбики представляют полные дважды устойчивые штаммы, полученные после 18-24 ч культуры в селективной среде для штаммов transconjugant. (A) межвидовой конъюгативная анализа. Стафилококк эпидермальный (SE45) был использован в качестве донора ЧФР, и штамм золотистого стафилококка N315 была использована в качестве получателя. Transconjugant штамм N315-45 таил СМО ген , вставленный в pSCFS7-подобной плазмиды. Этот штамм был использован в качестве источника СМО в анализах передачи МРСА-к-MRSA. (B) MRSA-к-MRSA конъюгативных эксперименты. Полученный ранее N315-45 был использован в качестве донора, и COL или Mu50 штаммы были использованы в качестве реципиентов. Средние значения двух независимых экспериментов показаны со стандартным отклонением (SD). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличеннуюверсия этой фигуры.

имя Штамм Описание Справочные материалы
Бактериальные штаммы
SE45 Клинические isolatated S. эпидермальный 7
N315 предварительно MRSA, KmR, ErmR 9
COL MRSA, несущий ген устойчивости к тетрациклину на pT181 плазмиды 8
Mu50 MRSA, VISA 9
N315-45 производное N315, несущий ген ЧФР на pSCFS7-подобной плазмиды , полученной из S. эпидермальный сопряжением 7
COL-45 derivative из COL, несущий ген ЧФР на pSCFS7-подобной плазмиды , полученной из S. эпидермальный сопряжением 7
RN4220-45 производное RN4220, несущий ген ЧФР на pSCFS7-подобной плазмиды , полученной из S. эпидермальный сопряжением 7
N2-2.1 Вздох активную ячейку, полученную из N315, что позволяет клеток естественной компетентности для трансформации 7
Кишечная палочка HST04 УБЫТКОВ / dcm- pHY300 Кишечная палочка HST04 УБЫТКОВ / dcm- (Takara) перенос устойчивости к тетрациклину pHY300 плазмиду 11
Бактериофаги
MR83a семья Siphoviridae Лабораторный запас
MR83-45 фага MR83a упаковки pSCFS7-подобной плазмиды , несущей ген ЧФР после того, как Infectиона в N315-45 Эта учеба

Таблица 1: Список штаммов , используемых в данной работе.

HTG донор Получатель частота
конъюгация N315-45 COL 1,00 × 10 -6
N315-45 MU50 1,29 × 10 -5
трансдукция N315-45 COL 1,00 х 10 -11
N315-45 MU50 3,68 х 10 -10
N315-45 N315 6,88 × 10 -10
трансформация Плазмиды (COL-45) N2-2.1 ULD
Вся ДНК (COL-45) N2-2.1 ULD
pHY300 (контроль) N2-2.1 6,52 х 10 -10

Таблица 2: HTG частоты ЧФР передачи генов , полученных в экспериментах MRSA-к-MRSA. Конъюгативных передачи оценивали с использованием N315 ЧФР -положительным производного (N315-45) в качестве донора. Частота передачи в этих экспериментах, выражается как Nº трансконъюгантов клеток / получателя. Трансдукции оценивали с помощью трансдукции фагом MR83a, амплифицированный из штамма N315-45. Частота трансдукции была рассчитана как Nº из трансдуктанты / БОЕ. Transforмационные анализы проводили с использованием очищенной ДНК (плазмиды или всю клеточную ДНК) в качестве доноров. Частота преобразования была рассчитана как число клеток трансформантов / реципиент. ULD: при обнаружении предела.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эта работа описывает три основных метода для изучения HGT генетических детерминант в золотистого стафилококка. Хотя трансдукции и конъюгации были изучены в течение многих десятилетий, существование естественной трансформации лишь недавно был признан 2. Таким образом, золотистого стафилококка оснащен всеми тремя основными режимами ХГТ, и тестирование всех из них требуется уточнить возможные пути распространения генетических детерминант. Целью данной работы является составление полных протоколов и предоставлять практическую информацию о методологиях , используемых в ранее опубликованной работе 7. Хотя конъюгации и трансдукции протоколы доступны, это первая работа , в которой описывается подробный протокол преобразования.

Сопряжение с использованием метода фильтра-спаривание простой метод и может быть применен к изучению конъюгативного переноса в различных бактериальных видов= "Xref"> 7, 10. При использовании стандартизированного инокулята, получатель рассчитывает через 18-24 ч достигает величины ~ 10 9 КОЕ / мл. Transconjugant счетчики являются переменными, а значения показывают сильную зависимость деформации к деформации, но , как правило, диапазон transconjugant от 10 2 до 10 5 было получено , когда результаты конъюгации были положительными. Используя протокол, представленную здесь, предел обнаружения достигнут был <10 трансконъюганты / мл. Этот предел может быть оптимизирована путем концентрирования фильтра подвески.

Естественный протокол трансформации , описанный здесь был создан в золотистого стафилококка N315-образовавших- штаммов. Использование CS2 среды имеет решающее значение для трансформации, так как преобразование не обнаруживается в других стандартных лабораторных средах, таких как TSB и BHI 13.

Использование долгосрочных сохраненных плазмид (например, pT181 и pHY300) в качестве донора привело около 10- до 50-кратного снижение частоты (данные не показаны), предполагая, что качество ДНК может влиять на частоту трансформации. Известно , что порезал плазмид не пригодны для естественной трансформации в B. Сенная 16.

ДНК , полученную из обоих золотистого стафилококка и кишечной палочки могут быть использованы в качестве донора в естественных анализах трансформации, предполагая , что барьер ограничение не препятствует естественное преобразование. Мы также наблюдали ту же частоту преобразования между ДНК , полученной из E.coli HST04 (дамба - / ДХМ -) отсутствие ДНК метилазы генов и от JM109, поддерживая идею , что статус метилирования не влияет на частоту преобразования.

Следует отметить , что частота преобразования детектируется с использованием этого протокола был низким (~ 10 -9 -10 -10), а трансформируемых штаммы ограничены N315 дериватовкласс = "Xref"> 2. Вполне вероятно , что эффективность трансформации в S.aureus , может быть штаммоспецифический, а также сообщалось в других трансформируемых бактерий 15, 16, 17. Дальнейшие исследования ведутся с целью повышения эффективности преобразования; это будет описано в другом месте.

Фаг трансдукции , как представляется, наиболее распространенным механизмом Тушка в золотистого стафилококка , потому что большинство золотистого стафилококка изолятов lysogenized бактериофагами 18. Заражение способность преобразовательного фага зависит от восприимчивости хозяина и должна быть проверена с помощью анализа бл шек. Другим ограничением фагом трансдукции является размер ДНК. Малый ДНК может быть эффективно передана, но фрагментов ДНК больше , чем 45 кб не могут быть упакованы в стафилококковой головке фага 19. Тем не менее, роман гигантский стафилококковый фаг недавно бееп изолированы от окружающей среды, и itcould предположительно иметь возможность передавать большие фрагменты ДНК 20.

Метод анализа бляшек описанный в данной работе легче, чем обычный протокол, в котором используется топ-агар. Тем не менее, данный способ требует, чтобы бактериальные клетки распределены равномерно, чтобы обнаружить крошечные бляшек, образующихся на поверхности. Для достижения полного равномерного растекания, мы рекомендуем распределить достаточный объем бактериальной суспензии на поверхность агара, останавливается, когда жидкость равномерно покрывает поверхность агара. Затем высушить пластины в воздушном потоке в чистом столе. Если необходимо, чтобы избежать лизогенизации преобразовательного фага, низкая множественность инфекции рекомендуется (МВД не должно превышать 1). Lysogenized клетки можно отличить по их пониженной восприимчивости к фага в анализе бляшек.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic Soy Broth (TSB)  Becton Dickinson  211825
Brain Heart Infusion (BHI) Becton Dickinson  211059
Nutrient Broth No. 2 Oxoid CM0067
Sheep blood agar Eiken Chemical Co.,Ltd. E-MR96 Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer. 
Agar powder Wako Pure Chemical Industries 010-08725
Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate) Wako Pure Chemical Industries 191-01785
Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter Merck Milipore HAWG 02500
QIAfilter Plasmid Midi kit QIAGEN 12243

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lindsay, J. A. Genomic variation and evolution of Staphylococcus aureus. IJMM. 300, 98-103 (2010).
  2. Morikawa, K., et al. Expression of a cryptic secondary sigma factor gene unveils natural competence for DNA transformation in Staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 8, e1003003 (2012).
  3. Caryl, J. A., O'Neill, A. J. Complete nucleotide sequence of pGO1, the prototype conjugative plasmid from the Staphylococci. Plasmid. 62, 35-38 (2009).
  4. Novick, R. P., Christie, G. E., Penades, J. R. The phage-related chromosomal islands of Gram-positive bacteria. Nat. Rev. Microbiol. 8, 541-551 (2010).
  5. Dubey, G. P., Ben-Yehuda, S. Intercellular nanotubes mediate bacterial communication. Cell. 144, 590-600 (2011).
  6. Dubey, G. P., et al. Architecture and Characteristics of Bacterial Nanotubes. Dev cell. 36, 453-461 (2016).
  7. Cafini, F., et al. Horizontal gene transmission of the cfr gene to MRSA and Enterococcus: role of Staphylococcus epidermidis as a reservoir and alternative pathway for the spread of linezolid resistance. J. Antimicrob. Chemother. 71, 587-592 (2016).
  8. Dyke, K. G., Jevons, M. P., Parker, M. T. Penicillinase production and intrinsic resistance to penicillins in Staphylococcus aures. Lancet. 1, 835-838 (1966).
  9. Kuroda, M., et al. Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 357, 1225-1240 (2001).
  10. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322, 1843-1845 (2008).
  11. Clinical Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Growth Aerobically - Seventh Edition: Approved Standard M7-A7. , CLSI. Wayne, PA, USA. (2006).
  12. Edwards, R. A., Helm, R. A., Maloy, S. R. Increasing DNA transfer efficiency by temporary inactivation of host restriction. BioTechniques. 26, 892-894 (1999).
  13. Thi, L. T., Romero, V. M., Morikawa, K. Cell wall-affecting antibiotics modulate natural transformation in SigH-expressing Staphylococcus aureus. J. Antibiot. , (2015).
  14. Long, K. S., Poehlsgaard, J., Kehrenberg, C., Schwarz, S., Vester, B. The Cfr rRNA methyltransferase confers resistance to Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A antibiotics. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 2500-2505 (2006).
  15. Ando, T., et al. Restriction-modification system differences in Helicobacter pylori are a barrier to interstrain plasmid transfer. Mol microbiol. 37, 1052-1065 (2000).
  16. Evans, B. A., Rozen, D. E. Significant variation in transformation frequency in Streptococcus pneumoniae. ISME J. 7, 791-799 (2013).
  17. Wilson, D. L., et al. Variation of the natural transformation frequency of Campylobacter jejuni in liquid shake culture. Microbiology. 149, 3603-3615 (2003).
  18. McCarthy, A. J., Witney, A. A., Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus temperate bacteriophage: carriage and horizontal gene transfer is lineage associated. Front Cell Infect Microbiol. 2, 6 (2012).
  19. Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus genomics and the impact of horizontal gene transfer. IJMM. 304, 103-109 (2014).
  20. Uchiyama, J., et al. Intragenus generalized transduction in Staphylococcus spp. by a novel giant phage. ISME J. 8, 1949-1952 (2014).

Tags

Immunology выпуск 121, Горизонтальный перенос генов конъюгация трансдукция трансформация устойчивость к антибиотикам.
Методика изучения горизонтальных генного переноса в<em&gt; Стафилококк</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cafini, F., Thi Le Thuy, N.,… More

Cafini, F., Thi Le Thuy, N., Román, F., Prieto, J., Dubrac, S., Msadek, T., Morikawa, K. Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (121), e55087, doi:10.3791/55087 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter