Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur

Zusammenfassung

Dies ist eine Methode, um eine 3-dimensionale Zellkultur Gerüst von pulmonaler extrazellulären Matrix zu schaffen. Intact Lunge in Hydrogelen verarbeitet, die das Wachstum von Zellen in drei Dimensionen zu unterstützen.

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Verfahren zur Mehrkomponenten - Zellkultur - Hydrogele für in - vitro - Lungen - Zellkultur zu etablieren. Beginnend mit gesunden en bloc Lungengewebe von Schweinen, Ratte oder Maus wird das Gewebe durchblutet und unter Wasser in nachfolgenden chemischen Reinigungsmittel , die Zelltrümmer zu entfernen. Histologische Vergleich des Gewebes vor und nach der Verarbeitung bestätigt Entfernung von mehr als 95% der Doppelstrang-DNA und alpha-Galactosidase-Färbung schlägt die Mehrheit der Zelltrümmer entfernt wird. Nach Dezellularisierung wird das Gewebe lyophilisiert und dann in ein Pulver cryomilled. Das Matrixpulver wird 48 h in einer sauren Pepsinverdau Lösung verdaut und dann die Pregel-Lösung neutralisiert zu bilden. Gelieren der Pregel Lösung kann durch Inkubation bei 37 ° C induziert werden und kann unmittelbar nach der Neutralisation oder bei 4 ° C gelagert werden für bis zu zwei Wochen. Beschichtungen können unter Verwendung der Vorgellösung auf einer nicht behandelten Platte für c gebildet werdenell Befestigung. Zellen können in dem Vorgel vor Selbstmontage ausgesetzt werden, um eine 3D-Kultur zu erreichen, die auf der Oberfläche eines geformten Gels plattiert, aus dem die Zellen durch das Stützgerüst migrieren können oder auf den Beschichtungen überzogen. Änderungen der Strategie vorgestellt kann Gelierungstemperatur, Stärke oder Protein Fragmentgrößen auswirken. Jenseits Hydrogelbildung kann das Hydrogel Steifigkeit erhöht werden Genipin verwenden.

Einleitung

Die Übersetzung von In-vitro-Ergebnissen in die Klinik ist eine der größten Herausforderungen, mit denen biomedizinische Forscher konfrontiert sind. Die In-vitro-Forschung an Gewebekulturkunststoffen ist einfacher, bequemer und behält eine hohe Zellviabilität bei. ¹ Dieser Ansatz ist ein vernünftiger Ausgangspunkt, aber die Ergebnisse haben eine begrenzte klinische Translation. Laboratorien setzen zunehmend dreidimensionale Konstrukte ein, um die traditionellen zweidimensionalen Methoden zu ersetzen. Bewertungen sind für viele dreidimensionale Umgebungen verfügbar, von biologischen Gerüsten bis hin zu Polymergerüsten. ^2,3

kg

Biologische Gerüste können Eigenschaften von in vivo-Umgebungen nachahmen, da sie viele der Protein- und Glykosaminoglykankomponenten der nativen Matrix enthalten und vertraute Bindungsstellen bieten, an die sich Zellen anheften und die sie erkennen können. Aus der extrazellulären Matrix (ECM) gewonnene Materialien haben sich als leistungsfähige Gerüste für die Zellanhaftung und -proliferation erwiesen. ⁴ Eine Herausforderung, die den Einsatz von ECM-Hydrogel-Plattformen einschränkt, ergibt sich aus ihren inhärent schwachen mechanischen Eigenschaften nach der Gelierung. Natives Gewebe hat oft mechanische Eigenschaften, die um Größenordnungen höher sind als bei Hydrogelen. Ungiftige Vernetzungsmittel können die mechanischen Eigenschaften von Hydrogelen verbessern, um die native Gewebeumgebung besser nachzuahmen. Genipin ist ein ungiftiger, natürlicher Vernetzer, der aus Gardenienpflanzen gewonnen wird und die Fähigkeit hat, die mechanischen Eigenschaften von ECM genau an Änderungen der Genipinkonzentration anzupassen^5,6.

Fast alle Zellen im Körper existieren in und organisieren sich auf der EZM, die sie entweder produzieren oder aufrechterhalten. Der neue Fokus auf die universelle Bedeutung von ECM für die Organisation, den Zustand und die Funktion in jedem Organ oder System hat die Produktion von matrixbasierten Plattformen für die In-vitro-Untersuchung ausgelöst. Die Submukosa des Schweinedünndarms ist das am umfangreichsten untersuchte Gerüst natürlichen Ursprungs und wird zur Regeneration von Sehnen, Bändern, Skelettmuskulatur⁴ und sogar Knochen⁷ verwendet. Matrizen aus anderen Organen und Spenderarten haben ebenfalls ein gutes Geweberegenerationspotenzial gezeigt. Die Verwendung von fremden EZM-Komponenten verursacht minimale Probleme bei der Immunmodulation. Nach Eliminierung der zellulären Substanz des Wirts wird die verbleibende EZM in Aminosäuregehalt und Organisation ähnlich wie bei allen anderen Säugetierarten^{sein 8}. Es gibt eine wachsende Denkweise, dass der beste Weg, Zell-EZM-Interaktionen in vitro zu untersuchen, die Verwendung von organspezifischen EZM-Gerüsten ist. Jedes Organ bietet eine einzigartige Zusammensetzung von Proteinen und Proteoglykanen, um zelluläre Nischen zu schaffen. Nischen bieten strukturellen, funktionellen und sogar enzymatischen Abbau der extrazellulären Matrix, die zur biophysikalischen Signalübertragung beiträgt. Um eine in vitro Mikroumgebung zu erreichen, die der in vivo Mikroumgebung am ähnlichsten ist, würde die Verwendung von gewebespezifischer EZM die zellulären Nischen für die Forschung optimieren.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Methode zur Etablierung eines Hydrogel-Gerüsts bereitzustellen, das für die Lungen-ECM einzigartig ist. Diese Methode bietet eine Plattform für die in vitro-Forschung zu Lungenzell-EZM-Interaktionen.

Protokoll

Lösung	Sterile Filter	Richtungen
DiH 2 O	ja	DiH 2 O; steril filtriert
0,1% Triton X-100-Lösung	ja	Unter Abzugshaube mit 100 & mgr; l Triton-X 100 - Lösung auf 100 ml DiH 2 O und rühren , bis sie gelöst; Sterilfilter.
2% Desoxycholat-Lösung	ja	Unter Laborabzug 2 g Natriumdesoxycholat-Lösung pro 100 ml DiH 2 O und rühren , bis sie gelöst; Sterilfilter
1 M NaCl	ja	Hinzufügen , 58,44 g NaCl zu 1 L DiH 2 O; agitieren, bis sie gelöst; Sterilfilter
DNase-Lösung	ja	In 12.000Einheiten DNase auf 1 L DiH 2 O; In 0.156 g MgSO 4 (Wasserfrei) und 0,222 g CaCl 2; agitieren, bis sie gelöst; Sterilfilter
PBS	ja	Kombinieren 27,2 g Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (dibasisches Heptahydrat), 80 g NaCl, 2 g KCl und mit 10 L DiH 2 O; agitieren, bis sie gelöst; pH-Wert auf 7,4; Sterilfilter

Tabelle 1: Lösungen für Tissue Dezellularisierung Erforderlich. Nehmen Sie die oben genannten Lösungen für die Dezellularisierung Prozess. Lagerung bei 4 ° C. Etwa 2,5 L für eine Schweine Lunge benötigt werden.

1. Hydrogelierung

1. Porcine Lung Dezellularisierung (angepasst von Referenzen ^9,10)
   1. Erhalten, ein en bloc normalen Schweine Lunge, aus einem Schlachthof, mit Herz und vasculature intakt.
   2. Verwenden Gewebe Schere oder einem Skalpell, das Herz zu sezieren entfernt Vaskulatur so nahe wie möglich an das Herz schneiden, werden verbleibende Vaskulatur in späteren Schritten für die Perfusion verwendet werden.
   3. sezieren vorsichtig das Bindegewebe rund um die Luftröhre, Bronchien und Gefäßen mit einem Skalpell oder einer Schere entfernt.
      HINWEIS: Ermitteln Sie die beste Lunge für den Rest des Verfahrens zu verwenden, indem eine Lunge ohne große Schnitte oder Einstiche durch die Pleura und große Mengen an Atelektase oder Gefäßverschluss wählen, die die Wirksamkeit des Dezellularisierung Prozess behindern können.
   4. Schneiden Sie das suboptimal Lunge verlässt, so viel Bronchus zur Trachea wie möglich angebracht entfernt (Herz, Bindegewebe und den Lappen der Lunge entfernt entsorgt werden kann). Es sollte eine Lunge zur Trachea und Vaskulatur befestigt bleibt sein.
      HINWEIS: Bewahren Sie Abschnitte für die Histologie, falls gewünscht. ⁹
   5. Schließen Sie nicht angeschlossen Bronchien mit Klammern oder Naht prevent Überschuss Rückstau.
   6. Bereiten Sie die Dezellularisierung Lösungen und im Kühlschrank lagern bei 4 ° C , bis sie benötigt (Tabelle 1).
   7. Mit Hilfe einer Handpumpe eine Kanüle eingeführt, die Lungenarterie zu passen, perfuse sowohl das Lungengewebe 3-mal mit DI-Wasser durch Lungenarterie und der Trachea. Perfuse Gefäß erste jedes Mal. Beginnen Sie mit ca. 1 L in Gefäßen und 1,5 l in der Trachea für jede Perfusion, aber als Zelltrümmer mehr Flüssigkeit entfernt wird, kann durch das System durchblutet werden.
   8. Perfundieren sowohl Vaskulatur und der Trachea mit Triton X-100-Lösung.
   9. Unterzutauchen Lungengewebe in Triton X-100-Lösung für 24 h bei 4 ° C.
   10. Perfuse Gefäßsystem und der Trachea 3 mal mit VE-Wasser zu spülen.
   11. Perfuse beide Gefäße und der Trachea mit Desoxycholat-Lösung.
   12. Tauchen Sie die Gewebeschnitte in Desoxycholat für 24 h bei 4 ° C.
   13. Perfuse Gefäßsystem und der Trachea 3 mal mit VE-Wasser zu spülen.
   14. Perfuse beide Gefäße und der Trachea mit NaCl-Lösung.
   15. Unterzutauchen Gewebe in filtriert NaCl-Lösung für 1 h bei 4 ° C.
   16. Perfuse Gefäßsystem und der Trachea 3 mal mit VE-Wasser zu spülen.
   17. Perfuse beide Gefäße und der Trachea mit DNase-Lösung.
   18. Unterzutauchen Gewebe in filtriert DNase-Lösung für 1 Stunde bei 4 ° C.
   19. Perfuse beide Gefäße und der Trachea 5-mal mit PBS.
   20. Sezieren weg bemerkbar Knorpelgewebe, Luftröhre und alle Tubuli 2 mm oder größer im Durchmesser (in erster Linie um den Hilus und medialen Abschnitte der Lunge) aus Atemwege leitet, so dass nur Atmungszonen (in erster Linie die Randbereiche).
   21. Präparieren Gewebe in 1-Zoll-Abschnitte oder kleiner. Ausrichtung des Gewebes keine Rolle spielt für diesen Schritt.
   22. überschüssige Flüssigkeit und Stelle Gewebe in 50 ml konischen Röhrchen abgießen. Frieren Sie das Gewebe bei -80 ° C.
       HINWEIS: Bewahren Abschnitte für die Histologie Entfernung von Zellen und Zell debri zu gewährleistens, wenn gewünscht. Wir verwenden H & E, α-Galactosidase, PicoGreen, Hydroxyprolin, Ninhydrin, Alcianblau, SDS-PAGE und Massenspektrometrie charakterisiert werden. ⁹
2. Lung Verarbeitung
   1. Entfernen Sie Deckel aus gefrorenen Röhrchen dezellularisierter Lungengewebe enthält.
   2. Legen Sie Filterpapier über die Rohröffnung einsetzen und mit Gummiband.
      HINWEIS: Rohr und der Inhalt sollte noch sonst in -80 ° C platzieren eingefroren werden, bis gefroren.
   3. Lyophilisieren das Gewebe, bis das gesamte überschüssige Flüssigkeit weg ist, einen Gefriertrockner mit nach Hersteller Richtungen. Bei -80 ° C bis zum fertig zu fräsen.
   4. Vor flüssigem Stickstoff zu Gefrierschrank Mühle beginnt hinzufügen Isolierung zu kühlen und interne Komponenten auf die Arbeitsbedingungen.
   5. Entfernen Sie magnetische Mühle bar aus Mühle Rohr und fügen Gewebe Boden zu bedecken.
   6. Ersetzen Mühle bar und fügen Sie locker gepackten Gewebe. Die Mühle Bar sollte noch frei bewegen.
   7. Schließen Sie die Mühle Rohr und place in Gefrierschrank Mühle.
   8. Füllen von flüssigem Stickstoff bis max Fülllinie.
   9. Gefrierschrank Mühle alle Gewebe in ein feines Pulver (ca. 5 min, Impaktion Rate von ~ 600 min ^-1), in einem Polycarbonat - Zylinder mit einem Edelstahl - Impaktor sowie Edelstahl Endstopfen mit der Gefriermühle nach den Herstelleranweisungen. Bei -80 ° C bis zur Verwendung.
3. Mikroporöse Gelbildung (8 mg / ml) ( in Anlehnung an Referenzen ^9,11)
   1. 1% (w / v) des dezellularisierten Pulver und 0,1% (w / v) des Pepsins auf 0,01 M HCl, unter konstantem Rühren (sollte in der Lage sein Strömung auf der obersten Ebene der Flüssigkeit zu sehen), bei Raumtemperatur, 48 Std.
      HINWEIS: Das Pulver statisch aufgeladen ist, so das HCl-Zugabe, nachdem das Pulver die Möglichkeit bietet den Überschuss aus den Rohrwänden zu waschen.
   2. Nach der Verdauung 48 h, legen Sie die Lösung und Reagenzien auf Eis für 5 min.
   3. Verwendung gekühlter 10% (v / v) 0,1 M NaOH, eind 11.11% (v / v) 10 x PBS (die gesamte Lösung zu bringen Konzentration 1x), bringen die verdauten Proteinlösung auf physiologischen pH von 7,4.
      HINWEIS: Die Lösung kann jetzt bis zu einer Woche bei 4 ° C gelagert werden. Führen Sie Gelieren Kinetik mit rheometry ⁹ , falls gewünscht.

2. Vernetzungs Hydrogele mechanische Festigkeit zu verbessern

1. Lösungen von 1%, 0,1% und 0,01% w / v Genipin Vernetzungslösung wurden durch Lösen der erforderlichen Menge Genipin Pulver in 10% DMSO hergestellt.
2. Vortex, um die Lösung alle 15 min für 1 Stunde.
3. In Genipin Lösung ECM Hydrogele zu decken (100 & mgr; l für jede Vertiefung einer 96-Well-Platte), die zuvor in Teil 1.3.4 zusammengestellt.
4. Verlassen jedes ECM Hydrogel für 24 h bei 37 ° C zu vernetzen.
5. Spülen Sie das ECM-Hydrogel 3-mal mit PBS, bis die Waschlösung nicht mehr blau. Die vernetzten Hydrogele werden dann bereit sein, für die weitere Charakterisierung und cell Kulturstudien.

3. Zellkultur mit mikroporöser Gel

1. Zweidimensionale Beschichtungs
   1. Verwendung der Lösung aus 1.3.3 werden 20 ul Pregel-Lösung in jede Vertiefung einer 96-well nicht behandelten Gewebekulturplatte.
   2. Kühlen Sie über Nacht bei 4 ° C Proteinadsorption an der Platte zu ermöglichen.
   3. Absaugen Vorgelats Lösung und Spülen mit PBS.
   4. Passage Zellen ^9.
   5. In 10.000 Zellen / cm ² in die Vertiefungen.
   6. Erhöhen Medien zu 100 ul pro Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C.
2. Dreidimensionale Zellkultur ⁹
   1. Verwendung Lösung aus 1.3.3 resuspendieren pelletierten Zellen auf eine Konzentration von 1 Million Zellen / ml Vorgellösung.
   2. Schnell 16 ul Pregel-Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte verzichtet werden kann, ein ~ 500 & mgr; m dicke Hydrogel für 3D-Zellkultur zu bilden.
   3. bei 37 ° C inkubieren 30min für Gel zu bilden.
   4. 100 l Medien an die Spitze der gebildeten Hydrogele und bei 37 ° C inkubiert.
3. Dreidimensionale Zellkultur auf variabler Steifigkeit Gele
   1. Mit Lösung von 1.3.3, Pipette 100 ul Pregel-Lösung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte.
   2. bei 37 ° C 30 Minuten inkubieren für Gel zu bilden.
      Hinweis: Die Vernetzung Schritte von Teil 2 kann hier verwendet werden.
   3. Passage Zellen ^9.
   4. In 10.000 Zellen / cm ² in die Vertiefungen.
   5. Erhöhen Medien zu 100 ul pro Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C.

Ergebnisse

Unter Verwendung dieses Verfahrens haben wir Hydrogele aus normalen Schwein, Ratte produziert und Mauslungen (Abbildung 1). Verarbeitet Lungen liefern schätzungsweise 5 mg, 40 mg und 10 g ECM-Pulver sind. Ein Überblick über das Verfahren ist in Abbildung 2 dargestellt. Key-Visualisierungen während des Prozesses sind: weißes Aussehen der Lunge nach deoxycholate Spülen; nach der Bildung Pregel sollte die Lösung opak sein, und die Lösung sollte für Monate h...

Diskussion

Einer der integralen Aspekte der Biologie ist die Selbstorganisation der Moleküle in hierarchischer Strukturen, die eine bestimmte Aufgabe auszuführen. ¹³ Im Labor Selbstorganisation hängt von zahlreichen Faktoren wie Salzkonzentration, pH, und die Verdauung Dauer. Wie gezeigt ist, selbstorganisierend Hydrogel bildet sich, wenn solubilisiert Proteine ​​Rückkehr zu einer physiologischen Temperatur. Das Hydrogel gebildet ist in der Lage zur Förderung der Zellanhaftung und Proliferation in vitro.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	Verwendung im Abzug mit Augenschutz und Handschuhen.
Natriumdesoxycholat	Sigma-Aldrich	D6750-100g	Verwendung in der Haube mit Augenschutz und Handschuhen.
Magnesiumsulfat	Sigma-Aldrich	M7506-500g	Keine
Calciumchlorid	Sigma-Aldrich	C1016-500g	Keine
DNase	Sigma-Aldrich	D5025-150KU	Keine
HCl	Sigma-Aldrich	258148-500ML	Mit Augenschutz und Handschuhen verwenden.
Pepsin	Sigma-Aldrich	P6887-5G	Im Abzug mit Augenschutz und Handschuhen verwenden.
Natriumhydroxid	Fisher Scientific	BP359-500	Mit Augenschutz und Handschuhen verwenden.
Genipin	Wako Chemicals	078-03021	Im Abzug mit Augenschutz und Handschuhen verwenden.
PBS 10x	Qualität Biologisch	119-069-151	Keine
PBS	VWR	45000-448	Keine
Filterpapier	Whatman	8519	N/A
Handpumpe	Fisher Scientific	10-239-1	N/A
Graduiertenbecher	VitLab	445941	N/A
Cryomill	SPEX	6700	Kryohandschuhe und Öse verwenden Schutz.
Lyophilisator	FTS FlexiDry		Handschuhe verwenden.
Rheometer	Discovery	HR-2	Verwenden Sie Handschuhe und Augenschutz.