Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur

Zusammenfassung

Dies ist eine Methode, um eine 3-dimensionale Zellkultur Gerüst von pulmonaler extrazellulären Matrix zu schaffen. Intact Lunge in Hydrogelen verarbeitet, die das Wachstum von Zellen in drei Dimensionen zu unterstützen.

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Verfahren zur Mehrkomponenten - Zellkultur - Hydrogele für in - vitro - Lungen - Zellkultur zu etablieren. Beginnend mit gesunden en bloc Lungengewebe von Schweinen, Ratte oder Maus wird das Gewebe durchblutet und unter Wasser in nachfolgenden chemischen Reinigungsmittel , die Zelltrümmer zu entfernen. Histologische Vergleich des Gewebes vor und nach der Verarbeitung bestätigt Entfernung von mehr als 95% der Doppelstrang-DNA und alpha-Galactosidase-Färbung schlägt die Mehrheit der Zelltrümmer entfernt wird. Nach Dezellularisierung wird das Gewebe lyophilisiert und dann in ein Pulver cryomilled. Das Matrixpulver wird 48 h in einer sauren Pepsinverdau Lösung verdaut und dann die Pregel-Lösung neutralisiert zu bilden. Gelieren der Pregel Lösung kann durch Inkubation bei 37 ° C induziert werden und kann unmittelbar nach der Neutralisation oder bei 4 ° C gelagert werden für bis zu zwei Wochen. Beschichtungen können unter Verwendung der Vorgellösung auf einer nicht behandelten Platte für c gebildet werdenell Befestigung. Zellen können in dem Vorgel vor Selbstmontage ausgesetzt werden, um eine 3D-Kultur zu erreichen, die auf der Oberfläche eines geformten Gels plattiert, aus dem die Zellen durch das Stützgerüst migrieren können oder auf den Beschichtungen überzogen. Änderungen der Strategie vorgestellt kann Gelierungstemperatur, Stärke oder Protein Fragmentgrößen auswirken. Jenseits Hydrogelbildung kann das Hydrogel Steifigkeit erhöht werden Genipin verwenden.

Einleitung

Die Übersetzung von In-vitro-Ergebnissen in die Klinik ist eine der größten Herausforderungen, mit denen biomedizinische Forscher konfrontiert sind. Die In-vitro-Forschung an Gewebekulturkunststoffen ist einfacher, bequemer und behält eine hohe Zellviabilität bei. ¹ Dieser Ansatz ist ein vernünftiger Ausgangspunkt, aber die Ergebnisse haben eine begrenzte klinische Translation. Laboratorien setzen zunehmend dreidimensionale Konstrukte ein, um die traditionellen zweidimensionalen Methoden zu ersetzen. Bewertungen sind für viele dreidimensionale Umgebungen verfügbar, von biologischen Gerüsten bis hin zu Polymergerüsten. ^2,3

kg....

Protokoll

Lösung	Sterile Filter	Richtungen
DiH 2 O	ja	DiH 2 O; steril filtriert
0,1% Triton X-100-Lösung	ja	Unter Abzugshaube mit 100 & mgr; l Triton-X 100 - Lösung auf 100 ml DiH 2 O und rühren , bis sie gelöst; Sterilfilter.
2% Desoxycholat-Lösung	ja	Unter Laborabzug 2 g Natriumdesoxycholat-Lösung pro 100 ml DiH 2 O und rühren , bis sie gelöst; Sterilfil....

Ergebnisse

Unter Verwendung dieses Verfahrens haben wir Hydrogele aus normalen Schwein, Ratte produziert und Mauslungen (Abbildung 1). Verarbeitet Lungen liefern schätzungsweise 5 mg, 40 mg und 10 g ECM-Pulver sind. Ein Überblick über das Verfahren ist in Abbildung 2 dargestellt. Key-Visualisierungen während des Prozesses sind: weißes Aussehen der Lunge nach deoxycholate Spülen; nach der Bildung Pregel sollte die Lösung opak sein, und die Lösung sollte für Monate h.......

Diskussion

Einer der integralen Aspekte der Biologie ist die Selbstorganisation der Moleküle in hierarchischer Strukturen, die eine bestimmte Aufgabe auszuführen. ¹³ Im Labor Selbstorganisation hängt von zahlreichen Faktoren wie Salzkonzentration, pH, und die Verdauung Dauer. Wie gezeigt ist, selbstorganisierend Hydrogel bildet sich, wenn solubilisiert Proteine ​​Rückkehr zu einer physiologischen Temperatur. Das Hydrogel gebildet ist in der Lage zur Förderung der Zellanhaftung und Proliferation in vitro.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	Verwendung im Abzug mit Augenschutz und Handschuhen.
Natriumdesoxycholat	Sigma-Aldrich	D6750-100g	Verwendung in der Haube mit Augenschutz und Handschuhen.
Magnesiumsulfat	Sigma-Aldrich	M7506-500g	Keine
Calciumchlorid	Sigma-Aldrich	C1016-500g	Keine
DNase	Sigma-Aldrich	D5025-150KU	Keine
HCl	Sigma-Aldrich	258148-500ML	Mit Augenschutz und Handschuhen verwenden.
Pepsin	Sigma-Aldrich	P6887-5G	Im Abzug mit Augenschutz und Handschuhen verwenden.
Natriumhydroxid	Fisher Scientific	BP359-500	Mit Augenschutz und Handschuhen verwenden.
Genipin	Wako Chemicals	078-03021	Im Abzug mit Augenschutz und Handschuhen verwenden.
PBS 10x	Qualität Biologisch	119-069-151	Keine
PBS	VWR	45000-448	Keine
Filterpapier	Whatman	8519	N/A
Handpumpe	Fisher Scientific	10-239-1	N/A
Graduiertenbecher	VitLab	445941	N/A
Cryomill	SPEX	6700	Kryohandschuhe und Öse verwenden Schutz.
Lyophilisator	FTS FlexiDry		Handschuhe verwenden.
Rheometer	Discovery	HR-2	Verwenden Sie Handschuhe und Augenschutz.