Methodenartikel

Analyse wohltuende Wirkung von Nahrungsergänzungsmitteln auf Darmepithel Barrierefunktionen Während Experimental ulcerosa

DOI:

10.3791/55095

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5. Januar 2017

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1Department of Molecular Biomedicine, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, 2Department of Physiology, Biophysics and Neurosciences, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, 3Department of Infectomics and Molecular Pathogenesis, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Aktuelle Behandlungen von entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) zielen darauf ab, die Krankheitssymptome zu lindern, kann aber schwere Nebenwirkungen verursachen. Somit sind alternative Strategien in Tier Colitis-Modellen untersucht. Hier erklären wir, wie die positiven Wirkungen von Nahrungsergänzungsmitteln auf die klinische IBD Zeichen sind in einer solchen ulcerosa Modell analysiert.

Zusammenfassung

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Entzündliche Darmerkrankungen (IBD), einschließlich Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, chronische rezidivierende Erkrankungen des Darmes. Sie verursachen schwere Probleme wie Bauchkrämpfe, blutiger Durchfall und Gewichtsverlust, in den betroffenen Individuen. Leider gibt es noch keine Heilung, und Behandlungen zielen nur die Symptome zu lindern. Gegenwärtige Behandlungen schließen entzündungshemmende und immunsuppressive Medikamente, die starke Nebenwirkungen verursachen können. Dies garantiert, dass die Suche nach alternativen Behandlungsmöglichkeiten, wie zum Beispiel Nahrungsergänzungsmittel, die keine Nebenwirkungen verursachen. Vor ihrer Anwendung in klinischen Studien, müssen solche Verbindungen rigoros auf ihre Wirksamkeit und Sicherheit in Tiermodellen getestet werden. Eine verlässliche experimentelle Modell ist das Dextransulfat-Natrium (DSS) Colitis-Modell bei Mäusen, die bei Menschen viele der klinischen Symptome der Colitis ulcerosa wiedergibt. Wir wendeten dieses Modell vor kurzem die wohltuende Wirkung eines Nahrungsergänzungsmittel zu testen, enthaltendVitamine C und E, L-Arginin und ω3-mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFA). Wir untersuchten verschiedene Parameter Krankheit und festgestellt, dass diese Ergänzung konnte Ödembildung, Gewebeschädigung, Leukozyteninfiltration, oxidativer Stress, und die Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen zu verbessern, was zu einer Gesamtverbesserung in der Krankheitsaktivitätsindex. In diesem Artikel erläutern wir ausführlich in der korrekten Anwendung von Nahrungsergänzungsmitteln, die DSS Colitis-Modell in C57Bl / 6-Mäuse, sowie wie Krankheitsparameter wie Histologie, oxidativen Stress und Entzündungen werden mit bewertet. die positiven Auswirkungen der verschiedenen Nahrungsergänzungen analysieren dann schließlich neue Wege für die Entwicklung alternativer Behandlungsstrategien öffnen kann, die IBD Symptome zu lindern und / oder dass die Phasen des Stillstands, ohne dass schwere Nebenwirkungen zu verlängern.

Einleitung

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Ulcerosa ist eine entzündliche Erkrankung des Dickdarms, die Durchfall und Bauchschmerzen verursachen können. Ulcerosa kann akut sein, in Reaktion auf eine Infektion oder Stress, oder es kann als eine chronische Erkrankung, wie beispielsweise bei Colitis ulcerosa (UC) zu entwickeln, die zur Gruppe der entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) gehört. Obwohl die klinischen Symptome von UC sind gut beschrieben wurde, ist die Pathogenese noch schlecht 1 verstanden. Es wird unter den Experten angenommen , dass UC eine multifaktorielle Erkrankung, die mit genetischen Mutationen und anomale Immunreaktionen ist es, eine große Rolle spielen 2. Allerdings Umweltfaktoren, wie zum Beispiel Wohnstil und Ernährung, tragen auch zur Krankheitsentstehung und Progression 3.

Leider ist IBD nicht heilbar, aber es gibt viele Behandlungsmöglichkeiten, die klinischen Symptome zu lindern wollen. Aktuelle Behandlungen gehören entzündungshemmende Medikamente, wie Sulfasalazin und Kortikosteroide; Immunsuppressiva, wie azathioprine; monoklonale Antikörper, die Capture-pro-inflammatorische Zytokine wie Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) oder Block Adhäsionsmoleküle, wie Integrine, übermäßige Rekrutierung von Leukozyten zu verringern; und Inhibitoren , die Kinasen angreifen , die pro-inflammatorischen Wege auslösen, wie Janus - Kinase (JAK) 4. Nicht reagieren alle Patienten auf alle Behandlungen, so therapeutische Strategien müssen 5 individualisiert werden. Darüber hinaus interferieren die meisten dieser therapeutischen Arzneimittel mit dem Stoffwechsel und Immunreaktionen, die oft schwere Nebenwirkungen zu verursachen. Aus diesem Grund wurden alternative Behandlungsmöglichkeiten untersucht.

Alternative Behandlungen umfassen Probiotika und Nahrungsergänzungsmittel, die in Tiermodellen und klinischen Studien mit unterschiedlichem Erfolg 6,7 angewendet wurden. Wir fanden vor kurzem, dass die Anwendung von verschiedenen Einzelnahrungsergänzungsmittel, wie zum Beispiel antioxidativen Vitamine oder ω3-mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFAS), ist schlechter als die Anwendung einer Kombination solcher Supplemente in 8,9 ulcerosa und kardiovaskulären Krankheitssymptome zu lindern. Diese Studien wurden in Mäusen durchgeführt, so dass klinische Studien müssen in Menschen durchgeführt werden, um festzustellen, ob diese Ergebnisse auch auf den Menschen anwendbar. Bevor klinische Studien initiiert werden, muss die Wirksamkeit und Sicherheit der neuen Behandlungsmöglichkeiten in Tiermodellen untersucht werden.

Für IBD wurde verwendet , das Dextransulfatnatrium (DSS) Modell in großem Maße die Mechanismen der Krankheitsentwicklung und die positiven Wirkungen von Medikamenten und Nahrungsergänzungsmittel 6,10 zu studieren. In den meisten Studien nur eine akute Krankheit über einen Zeitraum von sieben Tagen induziert wird; doch die klinischen Symptome bei diesen Tieren beobachtet , die denen bei CED - Patienten beobachtet ähneln (dh, blutiger Durchfall, Gewichtsverlust, epithelialen Dysfunktion und Immunzellinfiltration) 10. DSS induziert Erosionen in der Schleimhaut,was zu einer Barrierestörung und einer erhöhten Darmepithel Permeabilität 11. Der genaue Mechanismus ist unbekannt. Allerdings schlägt eine Studie , dass DSS mit mittlerer Kettenlänge Fettsäuren interagiert Nano lipocomplexes zu bilden , die fähig sind an Epithelzellen eintreten und zu induzieren Entzündungssignalisierungs 12 Wegen. In diesem Artikel beschreiben wir ausführlich, wie bei Mäusen induziert und analysiert wird, Kolitis, wie Nahrungsergänzungsmittel mit der Schlundsonde angewendet werden eine konstante Dosierung bei jedem Tier zu gewährleisten, und wie die Auswirkungen dieser Ergänzungen auf verschiedene ulcerosa Symptome untersucht.

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Protokoll

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Alle Tierversuche wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee von CINVESTAV genehmigt.

1. Herstellung von DSS Trinkwasser und die Induktion von Kolitis

  1. Bereiten Sie eine 3,5% w / v Dextransulfatnatrium (DSS) Lösung in autoklavierten Trinkwasser. DSS löst sich leicht und es ist nicht die endgültige Lösung zu filtrieren erforderlich.
    HINWEIS: 7 Tagen nach der DSS-Behandlung induziert schweren Colitis. Wenn milde Kolitis induzieren, 3 - 4 Tage der Behandlung empfohlen. Solange die DSS Trinkwasser klar bleibt, ist es nicht notwendig, das Wasser zu ändern. Wenn es jedoch trübe dreht, muß er ersetzt werden.
  2. Notieren Sie sich die Basisgewicht von männlichen Mäusen. Stellen Sie sicher, dass sie 8 bis 12 Wochen alt und in einem Bereich von 21 - 25 g Körpergewicht.
    Hinweis: Die entsprechende DSS Konzentration muss in jedem Labor optimiert werden. Die Ergebnisse können stark variieren, abhängig von den Haltungsbedingungen. Die Konzentrationen zwischen 2,5 bis 5% sind in der Regel berichtet starke c zu induzierenolitis in C57Bl / 6J WT - Mäusen 10. DSS aus verschiedenen Unternehmen und verschiedenen Chargen sollten getestet werden, da Ergebnisse auch mit anderen Quellen von DSS kann variieren.
  3. Geben Sie Wasser ad libitum und ersetzen Sie es mit frischem 3,5% DSS Wasser , wenn nötig.

2. Anwendung von Nahrungsergänzungsmitteln mit der Schlundsonde

  1. Bereiten Sie eine "zustellbaren" Lösung der gewünschten Nahrungsergänzungsmittel in einem geeigneten Lösungsmittel. Für diese Studie verwendeten wir eine Mischung, die 200 mg / kg L-Arginin, 83 mg / kg Vitamin C, 46 mg / kg Vitamin E, 77 mg / kg Eicosapentaensäure (EPA) und 115 mg / kg Docosahexaensäure (DHA ) in einem 1: 1-Lösung von Wasser und Safloröl.
  2. Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit einer Schlundsonde Nadel (15 G x 50 mm) mit dem Nahrungsergänzungsmittel-Gemisch. Wischen Sie die Außenseite der Sondennadel jede Verbindung außerhalb der Nadel zu entfernen und zu der richtigen Dosis Anwendung gewährleisten.
  3. Begrenze die Maus durch die Basis des Schwanzes Greifen miteinerseits und durch fest mit dem Daumen und Zeigefinger der anderen Hand eine Hautfalte an der Rückseite des Halses greift. Setzen Sie den Schwanz zwischen dem dritten Finger und der Basis des Daumen derselben Hand, die den Hals hält.
  4. Während die Maus in einer aufrechten Position zu halten, legen Sie die Nadel in die linke Seite des Mundes des Tieres und vorsichtig das Dach des Mundes folgen der Speiseröhre zu lokalisieren. Wenn kein Widerstand zu spüren ist, vorab die Nadel in Richtung Magen.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Tier atmet richtig, bevor Sie fortfahren.
  5. Verabreichen Sie die Mischung langsam, entfernen Sie das Rohr durch langsam die Spritze herausziehen, und die Maustaste loslassen. Nahrungsergänzungsmittel gelten einmal täglich per Schlundsonde während des Verlaufs des Experiments ulcerosa.

3. Bestimmung des Disease Activity Index

HINWEIS: Der Krankheitsaktivitätsindex ist die Kombination der Punkte für die Gewichtsabnahme, perianale Blutungen und Stuhlkonsistenz, die OBenthaltenen täglich 13.

  1. Messen Sie den Körpergewicht täglich und weisen einen Wert von 0 bis 4 nach dem Gewichtsverlust Prozentsatz (0: 0%, 1: 1 - 5%, 2: 5 - 10%, 3: 10 - 20% und 4:> 20 %).
    HINWEIS: Gewichtsverlust wird durch Berechnung der Differenz in Prozent zwischen dem Basisgewicht vor der Induktion von DSS-Colitis und dem tatsächlichen Gewicht bestimmt.
  2. Um das Niveau der perianale Blutung zu bestimmen, eine frische Stuhlprobe zu sammeln und die mitgelieferten Applikatoren verwenden, um eine dünne Schicht auf einer Folie aus einem Guajak-Test auf okkultes Blut-Kit anzuwenden. Verwenden Sie einen neuen Applikator für jede Probe.
    1. Schließen Sie die Abdeckung auf der Vorderseite und öffnen Sie das Fenster auf der Rückseite der Folie. Zwei Tropfen der Entwicklerlösung am Probenort auf der Rückseite.
    2. Lesen Sie die Ergebnisse nach 30 s. Jede Spur von blauer Farbe ist positiv für okkultes Blut. Weisen Sie eine Punktzahl von 0 bis 4 (0: keine, 0,5 - 2,5: positive Guajak Test auf okkultes Blut (in Abhängigkeit von der Signalstärke) und 3 - 4: gross Blutungen).
      HINWEIS: Wenn Blut im Stuhl zu sehen ist, wird der Guajak-Test auf okkultes Blut nicht durchgeführt werden müssen, und eine Punktzahl von 3, 3,5 oder 4 zugeordnet ist, in Abhängigkeit von der Menge an sichtbarem Blut.
  3. Bestimmen Sie die Stuhlkonsistenz durch eine frische Stuhlprobe zu beobachten. Weisen Sie eine Punktzahl von 0 bis 4 (0: normal / Feststoff, 0,5 - 2,5: pastös Stuhl und 3 - 4: Durchfall).

4. Bestimmung Darmepithel Permeability in vivo durch Evans Blue Assay

  1. Anästhesieren die Tiere durch sie intraperitoneal mit einer Mischung aus Ketamin (100 mg / kg Körpergewicht) und Xylazin (13 mg / kg Körpergewicht), verdünnt in Kochsalzlösung (0,9% NaCl), und zu beurteilen, um die Tiefe der Anästhesie Injektion durch die Klemmüberwachungs Rückzug Reflex.
  2. Legen Sie die narkotisierten Tiere in Rückenlage und eine Laparotomie durchführen, um den Darm aus.
  3. Suchen Sie den Blinddarm und machen einen kleinen Schnitt im proximalen Segment des Dickdarms einscendens ( im Idealfall sofort auf den Blinddarm benachbarte).
  4. Legen Sie eine Zuführungsnadel (G22) und sichern Sie sie mit einer Ligatur ein gemeinsames Seidenfaden verwenden. Sorgfältig spülen reichlich PBS durch das Rohr aus dem Darm alle Kot auszuspülen. Instill Evans-Blau-Lösung (1,5% w / v in PBS) in den Dickdarm, bis er den Anus erreicht hat.
  5. Inkubieren Sie die Evans-Blau für 15 min. Waschen Sie den Farbstoff aus durch das Rohr mit reichlich PBS gespült, bis die perianale Auswaschen klar.
  6. Euthanize die Tiere durch Genickbruch.
  7. Excise den Darm und spülen Sie es wieder mit reichlich PBS. Spülen einmal mit 1 ml 6 mM N -acetylcysteine in PBS Jeder beliebige Farbstoff zu beseitigen zur colonic Schleim haftet.
  8. Schneiden Sie den Doppelpunkt in Längsrichtung und spülen Sie es noch einmal mit PBS und 1 ml 6 mM N -acetylcysteine.
  9. Das Gewicht und Länge. Zur Extraktion des Evans blauen Farbstoff, legen Sie den Doppelpunkt in 2 ml N, N - Dimethylformamid über Nacht bei Raumtemperatur unter leichtem Agitation. Messen der Farbstoffkonzentration spektrophotometrisch bei 610 nm.

5. Gewebeentnahme

  1. Anästhesieren die Tiere durch sie intraperitoneal mit einer Mischung aus Ketamin (100 mg / kg Körpergewicht) und Xylazin (13 mg / kg Körpergewicht), verdünnt in Kochsalzlösung (0,9% NaCl), und zu beurteilen, um die Tiefe der Anästhesie Injektion durch die Klemmüberwachungs Rückzug Reflex.
  2. Euthanize die Tiere durch Genickbruch.
  3. Legen Sie die Tiere in Rückenlage und eine Laparotomie durchführen, um die Bauchhöhle aus.
  4. Mit einer Schere zerschneiden den gesamten Dickdarm und notieren Sie die Länge.
  5. Spülen Sie den Doppelpunkt mehrmals vorsichtig mit gekühltem PBS den Kot zu entfernen. Notieren Sie sich die Gewebegewicht und die Vorbereitungen für die folgenden Versuche, wie in den Schritten von 5,6 bis 5,8.
  6. Für die RNA-Isolierung und Myeloperoxidase (MPO) Assays, geschnitten, um eine ausreichend große Gewebeprobe ab (100 mg ist in der Regel ausreichend), legen Sie sie in einem Rohr und snap-gefrieren sie in flüssigem Stickstoff. Lagern Sie die Gewebe bei -80 ° C für die zukünftige Verwendung.
  7. Für Immunfluoreszenzanfärbung und oxidativer Stress Bestimmung (siehe unten), schneiden Sie ein kleines Doppelpunkt Probe (0,5-1 cm) und es in kleinen Aluminiumbecher submerse mit optimalen Schnitttemperatur (OCT) Masse gefüllt. Legen Sie die Tassen auf Trockeneis und ließ sie langsam einfrieren, um eine Blasenbildung zu vermeiden. Gefrorenen Gewebeproben kann bei -80 ° C für die zukünftige Verwendung gespeichert werden.
  8. Für Swiss 14 rollt, öffnen Sie das in Längsrichtung Kolon und sorgfältig Kot mit einer Pinzette entfernen. Roll it up, mit der Schleimhaut nach innen gerichtet, mit feinen bestückte Zange oder einen dünnen, runden Holzstab. legen Sie sie vorsichtig innerhalb einer Einbettungskassette und fahren Sie mit Schritt 6.1.
    HINWEIS: DSS induziert Schäden im Dickdarm. Jedoch variiert Schadensverteilung von dem proximalen zu dem distalen Kolon, wobei die meisten Schäden meist im distalen Kolon und Rektum gesehen. Daher empfehlen wir die Analyse der Histologie entweder im distalen colauf oder in Schweizer Rollen des gesamten Dickdarms.

6. Analyse der Colon Histologie von Hämatoxylin-Eosin-Färbung

  1. Gewebepräparation
    1. Für die histologische Analyse, unterzutauchen entweder die Rouladen oder die kleinen Gewebestücke aus bestimmten Kolon Regionen der Kontrolle und der behandelten Mäuse in 5 ml 10% Formaldehyd für 48 Stunden bei Raumtemperatur (RT) korrekte Fixierung zu erreichen.
      HINWEIS: Alle weiteren Schritte in Schritt 6 werden bei RT durchgeführt, wenn nicht anders angegeben.
    2. Waschen Sie sie mit Leitungswasser für 18 Stunden.
    3. Dehydratisieren sie mit 15 ml 70% Ethanol für 1 h, 96% für 1 h und absolutem Ethanol für 1 h. Wiederholen Sie jeden Schritt mit frischem Alkohol, bevor zum nächsten Konzentration fortfahren.
    4. Weiterhin die Dehydratisierung in einem Gemisch von 7,5 ml absolutem Ethanol und 7,5 ml absolutem Xylol für 1 h. Einmal wiederholen, bevor die Proben zu 15 ml absolutem Xylol für 1 h übergeben. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal mit frischem Xylol.
  2. Einbetten von Colon Gewebeproben in Paraffin
    1. Eintauchen der Proben in 50 ml flüssigem Paraffin für 17 h. Wiederholen Sie diesen Schritt nur einmal, sondern nur für 3 h.
    2. Tauchen Sie die Proben in Würfel (Kunststoff, quadratische Form, Größe: 22 x 22 x 22 mm) in 810 ml flüssigem Paraffin.
    3. Ermöglichen das Paraffin mit den Doppelpunkt Gewebeproben für 24 h bei RT zu verfestigen.
  3. Schneiden von Gewebe Querschnitte mit einem Mikrotom
    1. Schneiden Kolonproben ein Mikrotom verwendet, gemäß den Anweisungen des Herstellers bei einer Dicke von 5 um.
    2. Sammeln Sie die Schnitte in einem Wasserbad (1 l), die 0,3% Gelatine. Dies verhindert, dass die Faltung von Gewebequerschnitte. Gewinnen Sie die Gewebeschnitte und montieren sie auf Glasobjektträger.
  4. Hämatoxylin und Eosin - Färbung von Gewebequerschnitte
    1. Entparaffinieren die Proben für 18 h bei 60 ° C in einem Inkubator. Zu diesem Zweck verwenden, um ein Glas slide mit einem Griff Rack.
    2. Nach Entparaffinierung, für 5 min die Folien in 70 ml absolutem Xylol tauchen. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal mit frischem Xylol.
    3. Übertragen Sie die Proben in 70 ml absolutem Alkohol für 1 min. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal mit frischem Alkohol.
    4. Inkubieren der Kolon Gewebeproben in 70 ml Ethanol 96% für 1 min. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal mit frischem Alkohol.
    5. Waschen Sie die Proben in Leitungswasser zweimal für 2 s.
    6. Inkubieren Sie die Gewebe in Harris Hämatoxylin für 7 min.
    7. Waschen Sie die Proben in Leitungswasser zweimal für 2 s.
    8. Inkubieren der Proben in saurem Alkohol (70 ml Ethanol 70% und 700 & mgr; l von 1 M Chlorwasserstoffsäure) für 7 s.
    9. Waschen Sie die Proben in Leitungswasser zweimal für 2 s.
    10. Inkubieren der Gewebeproben in 70 ml Lithiumcarbonat (1 g Lithiumcarbonat in 100 ml destilliertem Wasser) für 7 s.
    11. Waschen Sie die Proben in Leitungswasser zweimal für 2 s.
    12. Inkubieren der Proben in 70 ml Ethanol 80% Für 1 min.
    13. Übertragen Sie die Proben in 70 ml Eosin-Y für 15 s.
    14. Inkubieren sie in 70 ml 96% Ethanol für 1 min. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal mit frischem Alkohol.
    15. Inkubieren Sie die Gewebeproben in 70 ml absolutem Ethanol (Ethylalkohol absolut wasserfrei) für 1 min. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal mit frischem Alkohol.
    16. Inkubieren der Proben in 70 ml einer Mischung aus 35 ml absolutem Alkohol und 35 ml absolutem Xylol für 1 min.
    17. Übertragen Sie die Proben in 70 ml absolutem Xylol für 1 min. Wiederholen Sie diesen Schritt für 5 min in 70 ml frischem Xylol abs.
    18. In 80 & mgr; l aus Kunstharz auf die Kolon Gewebeproben, bedecken sie mit Deckgläsern, und lassen Sie sie für 24 h bei RT trocknen. Schließlich analysieren die Proben unter Verwendung von Hellfeldmikroskopie 8.

7. Analyzing Junction Zusammensetzung von Immunofluoreszenz

  1. Bereiten Sie das Gewebe als 5,7 in Schritt beschrieben und geschnitten 8 um dicke Querschnitteunter Verwendung eines Kryostaten.
  2. Fix und Kolon Querschnitte mit 96% Ethanol bei -20 ° C für 20 min permeabilisiert.
    Hinweis: Alle nachfolgenden Inkubationen bei RT durchgeführt werden soll, wenn nicht anders in einer feuchten dunklen Kasten angegeben, Trocknen und Fluorochrom Verblassen zu verhindern.
  3. Air-trockene Proben und spülen Sie sie dann 3 mal für jeweils 5 min mit 1x PBS
  4. Inkubieren der Proben mit Blockierungslösung für 2 h (PBS 0,01% Tween und 2% BSA enthielt).
  5. Entfernen Sie die Blockierungslösung und spülen Sie ihn mit PBS-0,01% Tween 10 min.
  6. Während dieser Zeit, verdünne die primären Antikörper auf die gewünschten Konzentrationen in PBS-0,01% Tween.
  7. Entfernen Sie die Waschlösung, gelten die Antikörperlösung aus dem vorherigen Schritt, und Inkubation über Nacht bei 4 ° C in einem befeuchteten Box.
  8. Entfernen der Antikörperlösung und wäscht 3 mal mit PBS-0,01% Tween für jeweils 5 Minuten und einmal mit deionisiertem Wasser für 10 min, bei sehr vorsichtigem Rühren.
  9. Beim Waschen, Zentrifuge fluorochromeconjugated, artspezifischen Sekundärantikörper bei 14.000 xg für 20 min bei 4 ° C.
  10. Verdünnen Sie die sekundären Antikörper ohne Niederschläge, die vom Provider in PBS-0,01% Tween angegeben, gelten sie, und Inkubation für 1 h bei RT.
  11. Wiederholen Sie Schritt 7.8 und die Waschlösung zu entfernen so vollständig wie möglich.
  12. Pipette 4 ul Antiausbleichmittel über jede Probe auf der Folie.
  13. Decken Sie die Proben mit einem Deckglas.
  14. Luft trocknen lassen für 1 Stunde.
  15. Seal Schlitten mit Nagellack. Objektträger können bei -20 ° C bis zur weiteren Analyse gespeichert werden.
  16. Analysieren auf einem konfokalen Lasermikroskop 8.

8. Bestimmung von oxidativem Stress durch Oxidation von Ethidium

  1. Nach 7 Tagen colitis DSS, bereiten Gewebe, wie in Schritt 5.7 und geschnitten colon Abschnitte in einem Kryostat in einer Dicke von 5 & mgr; m beschrieben. Berg Querschnitte auf Glasobjektträger mit Poly-L-Lysin-Lösung behandelt und die Proben unter with 5 uM Dihydroethidium (DHE) in Wasser bei 37 ° C für 30 min im Dunkeln.
  2. Waschen Sie die Proben mit PBS (pH 7,6), dreimal für jeweils 15 min unter leichtem Schütteln bei RT. Air die Proben trocknen und einen Tropfen Eindeckmedium hinzufügen, um die Fluoreszenz zu schützen. Beachten Sie die Fluoreszenz von oxidiertem Ethidium- auf einem Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop (40-facher Vergrößerung, 568 nm Wellenlänge).

9. Analyse von Leukozytenrekrutierung von MPO-Assay

  1. Nach 7 Tagen DSS Kolitis, Kolongewebe sammeln und die Proben homogenisieren (200-400 mg) mit 1 ml Hexadecyltrimethylammoniumbromid (HTAB) Puffer (0,5% HTAB in 50 mM Phosphatpuffer, pH 6,0) unter Verwendung eines Homogenisators auf Eis.
  2. Spülen Sie die Spitze des Homogenisator zweimal mit 1 ml HTAB Puffer alle Gewebe im Lysat enthalten und beschallen sie fünfmal bei 40% Amplitude für 10 s je. Frost-Tau in flüssigem Stickstoff dreimal.
  3. Zentrifuge bei 14.000 g für 15 min und sammeln den Überstand.Bereiten 2,2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS) -Lösung durch Mischen von ABTS, 5 ml Natriumcitrat (1 M in Wasser), 0,1 ml Wasserstoffperoxid und 45 ml bi -destilliertes Wasser.
  4. Mischungs 0,1 ml jeder Überstand mit 0,1 ml ABTS-Lösung in einer 96-Well-Flachbodenplatte. Nach 10 min messen die Absorption bei 460 nm mit einem Spektralphotometer.

10. Die Bewertung der Expression von pro-inflammatorischen Zytokinen durch PCR

  1. Gewebehomogenisierung
    1. Homogenisieren 50 bis 100 mg von Dickgewebeproben in 1 ml eines sauren Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Mischung, die ein Leistungs Homogenisator.
    2. Inkubieren für 15 min bei Raumtemperatur.
  2. phasen~~POS=TRUNC
    1. In 0,2 ml Chloroform und kräftig schütteln für 30 s.
    2. für 30 min bei 4 ° C inkubieren.
    3. Zentrifuge bei 12.000 xg für 60 min bei 4 ° C.
    4. Übertragen Sie die upper wässrige Phase in ein neues Röhrchen (~ 500 ul).
  3. RNA - Fällung und Resuspension
    1. Mit 0,5 ml Isopropylalkohol und inkubiere die Proben bei 4 ° C für 60 min.
    2. Zentrifuge bei 12.000 xg für 30 min bei 4 ° C.
    3. Entfernen Sie den Überstand vollständig.
    4. 1 ml Ethanol 75% und Wirbel.
    5. Zentrifuge bei 12.000 xg für 30 min bei 4 ° C.
    6. Entfernen Sie den Überstand.
    7. Lassen Sie die restlichen Ethanol an der Luft trocknen für 3-5 min.
      HINWEIS: Es ist wichtig, nicht das RNA-Pellet vollständig trocknen zu lassen, da dies stark die Löslichkeit abnimmt.
    8. Wieder aufzulösen, das Pellet in 0,3 ml Diethylpyrocarbonat (DEPC) -behandeltem Wasser. Unmittelbar transkribieren die RNA-Proben in cDNA (stabiler, siehe Schritt 10.5) oder bei -80 ° C.
  4. RNA - Quantifizierung
    1. Verdünne 1 & mgr; l RNA mit 99 & mgr; l DEPC-behandeltem Wasser.
    2. Lesen the OD bei 260 nm und 280 nm mit einer UV / VIS-Spektrophotometer unter Verwendung von Probenkonzentration und Reinheit zu bestimmen.
  5. cDNA - Synthese
    1. Mischungs RNA Proben (1-5 & mgr; g) mit 1 & mgr; l Oligo (dT) 12-18 (0,5 ug / ul) und DEPC-behandeltem Wasser (Gesamtvolumen von 12 & mgr; l) in RNase-freie sterile Tuben.
    2. für 10 min bei 70 ° C inkubieren.
    3. Fügen Sie 2 ul 10fach PCR - Puffer, 1 & mgr; l 50 mM MgCl 2, 1 & mgr; l 10 mM dNTP - Mix, und 2 ul 0,1 M Dithiothreit (DTT).
    4. Inkubieren bei 4 ° C für 5 min.
    5. 1 & mgr; l reverse Transkriptase und inkubieren bei 42 ° C für 5 min.
    6. für 15 min bei 70 ° C inkubieren.
    7. für 15 min bei 4 ° C inkubieren. cDNA kann bei -20 ° C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden.
  6. PCR
    1. Mischungs 2,5 & mgr; l 10x PCR - Puffer, 1,5 ul 25 mM MgCl 2, 0,5 & mgr; l 10 mM dNTP Mix, 0,25 μL Taq-DNA-Polymerase, 0,25 & mgr; l von jedem Primer (10 uM) und cDNA (100 ng) und sterilem Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 25 & mgr; l.
    2. Führen Sie die Proben auf einem 96-Well-Thermocycler. Um zu verhindern, Amplifikation von genomischer DNA, Vorwärts- und Rückwärts-Primer sollten in verschiedenen Exons befinden: IL1β-FW: GCAACTGTTCCTGAACTCAACT und IL1β-RE: TCTTTTGGGGTCCGTCAACT; IL6-FW: CCTTCCTACCCCAATTTCCAA und IL6-RE: AGATGAATTGGATGGTCTTGGTC; KC-FW: TGTCAGTGCCTGCAGACCAT und KC-RE: CCTGAGGGCAACACCTTCA; und Actin-FW: TATCCACCTTCCAGCAGATGT und Actin-RE: AGCTCAGTAACAGTCCGCCTA. Mit den folgenden PCR-Bedingungen: 95 ° C für 5 min, gefolgt von 30 Zyklen bei 95 ° C für 15 s, 58 ° C für 30 s und 72 ° C für 30 s, sowie eine abschließende Extension für 10 min bei 72 ° C .

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Ergebnisse

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Diät-Ergänzungen können von DSS Kolitis Schützen

Entzündungshemmende und anti-oxidative Nahrungsergänzungsmittel, wie Vitamin C, Vitamin E, die Stickstoffmonoxid (NO) -Quelle L-Arginin und ω3-mehrfach ungesättigte Fettsäuren (ω3-PUFAs), wurden mit unterschiedlichem Erfolg in der Tier verwendet Modelle Anzeichen von Entzündungskrankheiten 3,6,15 zu lindern. Malnutrition, oxidativer Stress, und die Produktion von pro-inf...

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Diskussion

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Um Nahrungsergänzungsmittel in den klinischen Studien zu verwenden, müssen die Vorteile und die Sicherheit dieser Ergänzungen sorgfältig in tierexperimentellen Studien in vivo bewertet werden. Im Falle von Kolitis, mehrere geeignete Tiermodelle, die die klinischen Symptome von IBD ähneln wurden eingerichtet, einschließlich der chemischen Modellen DSS, TNBS oder Essigsäure; Knock-out (KO) Modelle wie IL10-KO; und immunzellvermittelte Kolitis Verwendung adoptive T-Zell - Transfer 19-21. Das DSS - Model...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem mexikanischen Rat für Wissenschaft und Technologie (CONACYT, 207268 und 233395 zu Michael Schnoor) unterstützt. KFCO ist ein Empfänger eines CONACYT Stipendiums (396.260) einen Master-Abschluss zu erhalten.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,3% Gelatine Bioxon158
10% FormaldehydJ.T. Baker2106-03
96-Well-Platte mit flachem BodenCorning3368
Absolutes Ethanol J.T. Baker9000-03
Absolutes XylolJ.T. Baker9490-03
ABTSSigma AldrichH5882
RinderserumalbuminSigma-Aldrich9048-46-8
ColoScreenHelena Laboratories5072
Corabion (Mit freundlicher Verfügung gestellt von Merck, Naucalpan, Mexiko)Merck
Dextransulfat-NatriumsalzAffymetrix9011-18-1(MW 40.000-50.000)
DihydroethidiumLife TechnologyD11347
Eosin-Y J.T. BakerL087-03
Evans blauSigma-Aldrich314-13-6
ZuführnadelCadence Science Inc.9921
Glas-Objektträger-Gestell mit GriffElektronenmikroskopie70312-16
ObjektträgerCorning2947
Harris Hämatoxylin Sigma-AldrichH3136
Hexadecyltrimethyammonium (HTAB)Sigma AldrichH6269
Histosette (Einbettkassette)SimportM498.2
Salzsäure 1 mJ.T. Baker9535-62
WasserstoffperoxidSigma AldrichH3410
KetaminPiSA AgropecuariaQ-7833-028
Flüssiges Paraffin Paraplast39501-006
Lithiumcarbonat Sigma-Aldrich2362
N,N-dimethylformamidJ.T. Baker68-12-2
N-acetylcysteinSigma-AldrichA9165
KunststoffwürfelElektronenmikroskopie70181
Poly-L-Lysin-LösungSigma-Aldrich25988-63-0
Prisma 5 statistisch SoftwareGraphPad SoftwarePrism 5
Kochsalzlösung 0,9% NaClCS PiSAQ-7833-009
NatriumcitratSigma-AldrichW302600
Kunstharz Poly Mont7987
Taq DNA-PolymeraseInvitrogen11615-010
Tissue-tek. O.C.T CompoundSakura Finetek4583
TuberkulinspritzeBD Plastipak305945
Tween 20Sigma-Aldrich9005-64-5
VECTASHIELD Antifade Eindeckmedium mit DAPIVector LaboratoriesH-1200
XylazinPiSA AgropecuariaQ-7833-099

Referenzen

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DSS Colitis ModellVerabreichung von Nahrungserg nzungsmittelnintestinale epitheliale Permeabilit tAnalyse des oxidativen Stresseshistologische BeurteilungEvans Blue ExtraktionKonfokalmikroskopieH matoxylin Eosin F rbungDisease Activity IndexMessung der Kolonl nge

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