Einem mikrofluidischen System mit Oberflächenstrukturierung zur Untersuchung Kavitationsblase (e) -Cell Interaktion und die Resultierende Bioeffects auf der Ebene einzelner Zellen

Summary

Ein mikrofluidischer Chip wurde hergestellt, um Paare von Goldpunkten für die Tandem-Blasenerzeugung und Fibronektin-beschichtete Inseln für die Einzelzellstrukturierung in der Nähe herzustellen. Das resultierende Strömungsfeld wurde durch Particle Image Velocimetry charakterisiert und zur Untersuchung verschiedener Bioeffekte eingesetzt, einschließlich der Zellmembranporation, der Membranverformung und der intrazellulären Calciumreaktion.

Abstract

In diesem Manuskript beschreiben wir zunächst das Herstellungsprotokoll eines mikrofluidischen Chips, mit Goldpunkten und Fibronektin-beschichteten Bereichen auf dem gleichen Glassubstrat, das mit gut definierten Positionen und Formen strukturiert, um die Erzeugung von Tandem-Blasen und einzelnen Zellen steuert genau in der Nähe. Wir zeigen dann die Erzeugung von Tandem-Blasen, die durch die Verwendung von zwei gepulste Laser ein Paar von Goldpunkten mit ein paar Mikrosekunden Zeitverzögerung zu beleuchten. Wir visualisieren die Blase-Blase Interaktion und die Strahlformung von Hochgeschwindigkeitsaufnahmen und zu charakterisieren, die sich ergebende Strömungsfeld mit Particle Image Velocimetry (PIV). Schließlich präsentieren wir einige Anwendungen dieser Technik für Einzelzellanalyse, einschließlich der Zellmembran Fungs mit Makroaufnahme, lokalisierte Verformung Membran durch die Verschiebungen der angeschlossenen Integrin-bindenden Perlen bestimmt, und die intrazelluläre Calcium-Reaktion von ratiometrisches Imaging. Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine schnelle und direktionale Strahlstrom produced durch die Tandem-bubble-Interaktion, die eine stark lokalisierte Scherbeanspruchung auf der Oberfläche einer Zelle in der Nähe gewachsen auferlegen kann. Darüber hinaus können verschiedene Bioeffekte durch Änderung der Stärke des Strahlflusses von der Zelle durch Einstellung der Arbeitsabstand zu den Tandemblasen induziert werden.

Introduction

Es gibt eine wachsende Erkenntnis , dass zellulärer Heterogenität, aus dem stochastischen Expression von Genen ergeben, Proteinen und Stoffwechselprodukten , innerhalb einer großen Zellpopulation vorhanden ist, und dient als ein grundlegendes Prinzip in der Biologie zur Zell Anpassung und Evolution ¹ zu ermöglichen. Daher ist es oft ungenau und unzuverlässig populationsbasierten Massenmessungen verwenden, um die Funktion der einzelnen Zellen und deren Wechselwirkungen zu verstehen. Die Entwicklung neuer Technologien für die Analyse Einzelzelle ist daher von großem Interesse in der biologischen und pharmakologischen Forschung und kann verwendet werden, beispielsweise, um besser auf die Schlüsselsignalwege und Prozesse in Stammzellen Biologie und Krebstherapie verstehen ^2-4. In den letzten Jahren hat die Entstehung von Mikrofluidik - Plattformen stark Einzelzellanalyse erleichtert, wobei die Positionierung, Behandlung und Beobachtung der Reaktion von einzelnen Zellen haben ⁵ mit neuartigen Analysestrategien durchgeführt.

Cavitation spielt eine wichtige Rolle in einem breiten Spektrum von biomedizinischen Anwendungen, einschließlich der Behandlung von Krebserkrankungen durch hochintensiven fokussierten Ultraschall (HIFU) ^6, die nicht-invasive Fragmentierung von Nierensteinen durch Stoßwellen - Lithotripsie (SWL) ^7, Drogen- oder Genübertragung durch Sonoporation ⁸ und die vor kurzem berichtet Zerstörung von Zellen oder Geweben durch hydrodynamische Kavitation bubble ^9,10. Trotzdem haben die dynamischen Prozesse der Kavitationsblase (e) Wechselwirkungen mit biologischen Gewebe und Zellen nicht gut verstanden worden. Dies ist wegen der Zufälligkeit in Kavitation Initiierung und Blasendynamik durch Ultraschall erzeugt, Stoßwellen und lokalen Hydraulikdruck; Des Weiteren gibt es einen Mangel Techniken ermöglicht, die von Natur aus komplex und schnelle Reaktionen von biologischen Zellen zu lösen, vor allem auf der Ebene einzelner Zellen.

Aufgrund dieser Herausforderungen ist es nicht verwunderlich, dass nur sehr wenige Studien haben Bienen berichtet Blase-Zell-Wechselwirkungen unter gut kontrollierten experimentellen Bedingungen zu untersuchen. Zum Beispiel Membran Fungs einzelner Zellen in Suspension ¹¹ eingefangen und die impulsive große Verformung von menschlichen roten Blutkörperchen ¹² wurden unter Verwendung von lasererzeugten einzelnen Blasen in mikrofluidischen Kanälen gezeigt. Die letztere Technik kann jedoch produzieren nur sehr geringe Deformation in eukaryotischen Zellen aufgrund des Vorhandenseins des Kerns ^13. Außerdem ist es schwierig, stromabwärts Bioeffekte zu überwachen, wenn die Zellen in Suspension zu behandeln. In anderen Studien Ultraschallanregung eines zellgebundenen Mikrobläschen (oder Ultraschall - Kontrastmittel) zur Herstellung von Membran Porenbildung und / oder die intrazelluläre Calciumreaktionen in einzelnen anhaftenden Zellen wurde ⁸ berichtet. Membranfungs einzelner anhaftender Zellen können auch mit lasererzeugten Tandem - Blasen in einer dünnen Flüssigkeitsschicht , die lichtabsorbierende Trypanblaulösung ¹⁴ hergestellt werden, oderdurch eine oszillierende Gasblase durch Mikrolaserpulsen bestrahlt wird durch ein optisch absorbierenden Substrat in Mikrokammern ¹⁵ erzeugt. Im Vergleich hat das optisch absorbierende Substrat einen Vorteil gegenüber dem Laser absorbierendes Trypan-Blau-Lösung, da diese auf Zellen toxisch ist. Noch wichtiger ist, sind Laser erzeugten Blasen kontrollierbarer in Bezug auf die Blasengröße und Lage als akustisch angeregten Blasen. Dennoch in allen diesen früheren Studien, die Zellform, Orientierung und Haftbedingungen wurden nicht kontrolliert wird , die im wesentlichen die Zellantwort und Bioeffekte durch mechanische Spannungen ¹⁶ erzeugt beeinflussen.

Um diese Nachteile in früheren Studien zu überwinden, haben wir vor kurzem ein experimentelles System zur Blasenerzeugung, Zellmusterungs, bubble-bubble-Zell-Wechselwirkungen, und Echtzeit-Bioassays von Zellantwort in einem mikrofluidischen Chip aufgebaut unter Verwendung einer einzigartigen Kombination von Mikrofabrikations techn entwickelteniques. Drei Hauptmerkmale , die unsere experimentellen System von anderen in dem Feld zu unterscheiden sind: 1) das Strukturieren von Mikrometergrße Goldpunkte auf dem Glassubstrat lokalisierte Laserabsorptions für Blasenerzeugungs ¹⁷ zu ermöglichen; 2) das Strukturieren von Mikrometergrße Inseln extrazellulären Matrix (ECM) für die Zelladhäsion auf dem gleichen Substrat zu steuern, sowohl die Lage und Geometrie der einzelnen Zellen; und 3) die Kompression der Abmessung der Blase-bubble-Zell-Interaktionsdomäne von 3D auf einer quasi-2D-Raum in der Ebene zu erleichtern Visualisierung von bubble-bubble-Wechselwirkungen Strömungsfelder Jetting Zelldeformation und Bioeffekte alle erfasst in eine rationalisierte Bildgebungssequenz (Abbildung 1d).

Abbildung 1: Die Mikrofluidik - Chip und schematische Darstellungen von verschiedenen Assays. a) Gebaute Mikrofluidik - Chip mit Kanälen mit blauer Tinte gefüllt für die Visualisierung. b) Ein Bereich innerhalb des mikrofluidischen Chips mit gemusterten Zellen und Goldpunkten (der Abstand zwischen den beiden Goldpunkte in der Nähe von 40 & mgr; m). Viele Paare von Arbeitseinheiten können in einem Kanal angeordnet werden. c) Close-up Bild einer einzigen Arbeitseinheit , bestehend aus einem Paar von Goldpunkten und einer HeLa - Zelle zur Zelle Strukturierungsbereich geklebt. d) Schematische Darstellung des Gerätebetriebs. Eine einzelne Zelle hält sich an und breitet sich auf dem "H" -förmigen Insel mit Fibronektin beschichtet. Ein Paar von Kavitationsblasen (tandem bubble) mit gegenphasigen Schwingung werden durch Beleuchten gepulste Laserstrahlen auf den Goldpunkten (siehe Abbildung 4a), was zur Erzeugung eines schnellen und lokalisierte Strahl bewegt sich in Richtung der Zielzelle in der Nähe erzeugt wird . Die Zelle kann mit einem Calciumantwort für makromolekulare Aufnahme und / oder stimulierten verformt, porated werden, abhängig von der Arbeitsabstand (S _d) der Zelle zu dem Tandemblase.f = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diese Plattform kann ferner mit Fluoreszenzassays und funktionalisierten Kügelchen an die Zelloberfläche für Kavitation induzierten Bioeffekte befestigt kombiniert werden. Insbesondere eröffnet diese Plattform, um den Weg für eine zuverlässige und quantifizierbare Assays auf Einzelzellebene. Bis jetzt haben wir das Gerät für die Analyse von Tandem blaseninduzierten Zellmembran Verformung, Zellporenbildung und die intrazelluläre Aufnahme, Lebensfähigkeit, Apoptose und intrazellulären Calcium-Reaktion verwendet. In dem folgenden Protokoll beschreiben wir den Prozess der Chipherstellung und das Verfahren für die Analyse der verschiedenen Bioeffekte oben erwähnt. Außerdem sind die Operationen des Chips beschrieben.

Protocol

1. Mikrofertigung

HINWEIS: Alle Mikrofabrikationsverfahren werden in einem Reinraum durchgeführt. Eine Chrommaske wird vor dem Mikro entworfen, siehe Abbildung 2.

Abbildung 2: Schematische Darstellung des Kanaldesign in der Mikrofluidik - Chip und den Abmessungen der Arbeitseinheiten. a) Mask Design der ausgerichteten PDMS Mikrokanäle (grün) und die Muster auf dem Glassubstrat (blau und rot). b) vergrößertes Bild des Maskendesign in einem repräsentativen Abschnitt der Arbeitseinheit Arrays. c) Schematische Darstellung einer Arbeitseinheit ein Zellmuster (blau) und ein Paar von Goldpunkten (rot) zeigt. Alle Längenskalen sind auf der rechten unteren Ecke angezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine lar anzuzeigenger-Version dieser Figur.

1. Gold - Punktmuster
   HINWEIS: Die Fläche jeder Gold Punkt innerhalb 25-30 & mgr; m ² sein , ausgebildet, so dass es groß genug ist , Laserenergie für die Blasenerzeugung zu absorbieren, aber klein genug , um einzelne Zellen daran anhaften zu vermeiden. Ein schematisches Diagramm für den Goldpunkt Herstellung wird in 3a gezeigt.
   1. Glasobjektträger Reinigung (in einer chemischen Haube)
      1. Spülen Sie die Objektträger aus Glas mit Aceton , gefolgt von Isopropylalkohol (IPA) und dann trocknen Sie es mit einem N ₂ -Strom.
      2. Einweichen der Schieber in Piranha - Lösung (H ₂ SO _4: H ₂ O ₂ = 4: 1) für 10 min.
      3. Nehmen Sie die Folie aus, spülen Sie es mit DI - Wasser, und es dann trocken mit einem N ₂ -Strom.
      4. Backen Sie den Glasobjektträger auf einer Heizplatte bei 120 ° C für 10 min.
      5. Behandeln Sie die Folie in einem Plasmaverascher bei 100 W für 90 s.
   2. Spin-Beschichtung (Spin-Coating-Haube)
      1. Schalten Sie auf einer Heizplatte und warten Sie, bis die Temperatur bei 95 ° C stabil ist.
      2. Folgen Sie dem Beschichtungsverfahren:
         1000 Umdrehungen pro Minute für 5 s mit einer 500 rpm / s Rampe;
         dann 3000 Umdrehungen pro Minute für 30 s mit einer 1.000-rpm / s Rampe.
      3. Befestigen Sie das gereinigte Glasobjektträger auf den Spin-Coater durch Anlegen eines Vakuums.
      4. Decken Sie die Gleitfläche mit P-20 und das Beschichtungs Rezept starten.
      5. Wiederholen Sie den Beschichtungsprozess für NFR-negativer Photoresist.
      6. Backen Sie die Folie bei 95 ° C für 60 s und warten, bis es kühlt auf Raumtemperatur ab.
   3. Die Fotolithografie
      1. Montieren Sie die Chrommaske auf die Mask Aligner und stellen Sie sicher, dass das Muster Seite nach unten in Richtung der Folie.
      2. Legen Sie die Photolithographie Rezept auf Festbelichtungsmodus mit 9 s von UV-Exposition und richten Sie schnell das Glassubstrat mit der Maske.
      3. Nach der Durchführung der UV-Bestrahlung aus, backen die Folie bei 956; C für 1 min, und lassen Sie es auf Raumtemperatur abkühlen dann.
   4. Entwicklung
      1. Entwickeln des Musters auf der Folie in Entwicklerlösung für 60 s.
      2. Entfernen Sie die Folie aus der Entwickler, spülen Sie es mit DI - Wasser, und trocknen Sie es mit einem N ₂ -Strom.
      3. Überprüfen Sie die Mustergeometrie unter dem Mikroskop, und messen und die Strukturgröße aufzuzeichnen.
   5. Goldabscheidung (E-beam Verdampfung) und Abheben
      1. Backen Sie die Folie bei 120 ° C für 5 Minuten, und lassen Sie es auf Raumtemperatur abkühlen.
      2. Reinigen der Schieber mit Plasma in dem reaktiven Ionenätzen (RIE) Maschine für 90 s bei 500 Torr und 100 W.
      3. Kaution 5 nm Ti und 15 nm Au auf den Objektträger unter Verwendung eines E-Beam - Verdampfer ^17.
      4. Genießen Sie die Schlitten über Nacht in einem Becherglas Photoresist-Entferner Lösungsmittel, das Gold, die auf der Oberseite des NFR widerstehen zu entfernen.
      5. Rufen Sie die Folie bündig it mit Aceton , gefolgt von IPA, und trocknen Sie es mit einem N ₂ -Strom.
      6. Trocknen Sie die Folie auf einer heißen Platte bei 115 ° C, bevor es in das Sauerstoffplasmaverascher bei 100 W für 90 s gereinigt wird.
2. Molecular-Montage Musterung durch Abheben (MAPL)
   Anmerkung: Die Fläche jeder Fibronektin beschichteten Insel ist so eingestellt, daß innerhalb von 700-900 & mgr; m ² ausreichende HeLa - Zelle zu erleichtern , in einer quadratischen Region ausbreitet , während die Wahrscheinlichkeit von mehreren Zellen minimiert auf der Insel aggregieren. Ein schematisches Diagramm zur Herstellung von zellStrukturierungs Inseln ist in 3b gezeigt.
   1. Spin - Beschichtung
      1. Wiederholen Sie Schritt 1.1.2, aber verwenden S1813-positiven Photoresist und eine Temperatur von 115 ° C.
   2. Aligned photolithographischen
      1. Montieren Sie die Chrommaske auf die Mask Aligner und stellen Sie sicher, dass die Seite mit dem Muster nach unten zeigt in Richtung der Folie mit derGoldpunkte.
      2. Legen Sie die Photolithographie Rezept auf Festbelichtungsmodus mit 9 s von UV-Exposition.
      3. Richten Sie die obere Maske mit dem unteren Schieber mit Ausrichtungsmarkierungen, um den Rand der Maske befindet, als Raumbezug.
      4. Überprüfen Sie den zentralen Teil der Maske und stellen Sie sicher, dass die Mustermerkmale korrekt ausgerichtet sind.
      5. Füllen Sie die UV-Bestrahlung ohne Nacherwärmung.
   3. Entwicklung
      1. Wiederholen Sie Schritt 1.1.3 , aber mit 45 s der Entwicklung , bevor sie auf einer Heizplatte getrocknet und in N ₂ Lagerung zu erhalten.
3. Chemische Behandlung
   1. Bereiten Sie die Passivierungslösung: 0,5 mg / mL PLL-g-PEG in 10 mM HEPES-Puffer.
   2. Rufen Sie die Folie aus N ₂ -Speicherung und reinigen RIE unter Verwendung der Parametereinstellung: 500 Torr Druck, 100 W Leistung und 90-s Dauer.
   3. Pipette ein Tropfen Passivierungslösung auf ein Stück Paraffinfilm.
   4. Sandwich der Lösung mit dem Film und der Folie, um sicherzustellen, dass die Seite mit dem Muster-Features nach unten in Richtung des Films; die Bildung von Blasen zu vermeiden.
   5. Warten Sie 45 Minuten, bevor die Folie aus dem Film zu entfernen.
   6. Weichen Sie die Folie nacheinander in Photoresist-Entferner, Photoresist-Entferner und DI-Wasser (1: 1) und DI-Wasser, und rühren es in einem Ultraschallbad für 90 s für jede einweichen.
   7. Trocknen Sie die Folie auf einer Heizplatte, die Feuchtigkeit zu entfernen, bevor es in einem Exsikkator Dichtungs- und es in einem Kühlschrank lagern.
4. Chip - Montage
   1. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.1-1.1.4, aber mit SU8-2025-negativen Photoresist und der Parametereinstellung genannte Microchem Protokoll ^18, eine so genannte Silikonform mit einer Photomaske herzustellen.
   2. Fertigen Sie ein PDMS Mikrokanal (40 mm x 25 mm x 5 mm, L x B x H) und eine kleine PDMS Platte (800 & mgr; m breite Rillenstruktur) unter Verwendung von Weich-Lithographie.
   3. Lochen die microchannel für die Fluidzugangsöffnungen und reinigen Sie sie mit Klebeband und dann mit IPA.
   4. Schirmen den gemusterten Bereich des Glassubstrats mit dem PDMS Bramme und gelten RIE (100 W, 500 mTorr, 60 s) zu entfernen PLL-g-PEG aus dem Peripheriebereich.
   5. Behandeln Sie den Mikrokanal mit einer reduzierten Dosis von RIE (25 W, 500 mTorr, 25 s), und dann auf das strukturierte Glassubstrat ausrichten (mit dem kleinen PDMS Platte entfernt); bringen den Mikrokanal und die strukturierte Glassubstrat in einen konformen Kontakt unter einem Stereoskop.

Abbildung 3: Schematische Darstellung für Mikro und Chip - Montage. a) Muster der Goldpunkte auf dem Glassubstrat. b) Herstellung des Glassubstrats für die Zellmusterungs über MAPL. c) Montage des mikrofluidischen Kanal mit Plasma - Bindung. Sehen Sie sich die Materialliste für die Definitionen of die Abkürzungen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

5. Zellbindung
   HINWEIS: HeLa-Zellen werden routinemäßig in DMEM mit 10% FBS und 1% Antibiotikum / Antimitotikum Lösung in einer Zellkultur-Inkubator ergänzt gehalten. Ein schematisches Diagramm für die Chipmontage und Zellanheftung ist in 3c gezeigt.
   1. Prime der Chip mit PBS für 30 min bei 1 & mgr; l / min und dann Fibronektin-Lösung (50 ug / ml in PBS, 1 & mgr; l / min) für 45 min ziehen lassen.
   2. Während des Wartens, Zentrifuge einzelnen Zellen und Rekonstitution der Zellsuspension in vorgewärmten (37 ° C) Kulturmedium bei 5x10 ⁶ Zellen / ml trypsinize Zellkultur mit 0,25% Trypsin-EDTA, waschen Sie sie in einem Kulturmedium.
   3. Ersetzen Sie die Fibronektin-Lösung mit PBS und spülen Sie den Chip bei 10 & mgr; l / min für 5 min.
   4. Injizierendie hergestellte Zellsuspension in den Chip, den Fluss zu stoppen, klemmen den Ausgang, und 30 min den Chip in einer Zellkultur-Inkubator halten.
   5. Lassen Sie die Steckdose und spülen Sie den Chip mit Zellkulturmedium bei 10 & mgr; l / min für 5 min. Reduzieren die Perfusion Strömungsgeschwindigkeit des Kulturmediums auf 0,75 & mgr; l / min und Pflege der Zellkultur für 2 h in den Inkubator.

2. Blasenbildung und Strömungsvisualisierung

ANMERKUNG: Eine schematische Darstellung des Versuchsaufbaus zur tandem Blasenerzeugung , und die resultierende Strömungs Interaktion mit einer einzelnen Zelle in einem mikrofluidischen Kanal gezüchtet Nähe in 4a gezeigt.

1. Die Erzeugung von Tandem - Blasen mit zwei Lasern und Zeitsteuerung
   1. Platzieren Sie den Mikrofluidik-Chip auf der Stufe eines inversen Mikroskops und richten Sie die Brennpunkte der beiden gepulsten Nd: YAG-Laser (λ = 532 nm, 5 ns Pulsdauer) auf einem Paar von gemusterten Goldpunkten getrennt by 40 um.
   2. Verwenden einer digitalen Verzögerungsgenerator die zwei Laser mit einer Zeitverzögerung etwa 2,5 & mgr; s zu triggern zwei Blasen an der Goldpunkte eingeleitet zu erzeugen.
   3. Stellen Sie die Laserausgangsenergie (~ 10 & mgr; J) innerhalb von 50 ± 2 um einen maximalen Durchmesser der Blasen zu erzeugen.
   4. Synchronisieren eines High-Speed-Kamera (200-ns-Exposition und 2 Millionen Bilder pro Sekunde (fps)) zu den Lasern und erfassen die Dynamik der Blasenexpansion, Kollaps, den Blasen-Interaktion und Strahlbildung.
2. Die Quantifizierung der Strahlgeschwindigkeit
   1. Aufzeichnen der Position der Düsenspitze (J ₁₎ an dem proximalen Ende der ersten Blase (B ₁₎ und dem distalen Ende der B _1, beginnend bei der Erzeugung der zweiten Blase (B ₂₎ und endend mit dem Aufsetzen von J ₁ zu dem distalen Ende von B _1; siehe die schematische in 5a.
   2. passen Linienförmig den zeitlichen Verlauf der Position für Both der proximale (Düsenspitze) und den distalen Enden. Berechnen Sie die Steigung der Spitzenposition-Zeit-Kurve für das proximale Ende der Strahlgeschwindigkeit zu bestimmen. Der Schnittpunkt der beiden Linien zeigt den Strahl Aufsetzen Zeit. Weitere Details finden Sie in der Referenz 19 zu finden.
3. Visualisierung der Tandem - Blase-induzierten Strömungsfeld
   1. Bereiten Sie 1 & mgr; m aus Polystyrol (PS) Beadsuspension in DI-Wasser (2,6% w / v) und injizieren die Kügelchen in die Mikrofluidik-Chip.
   2. Erzeugen tandem Blasen beschrieben, wie in Schritt 2.1.1-2.1.3.
   3. Notieren Sie die Tandem-Blasendynamik unter Verwendung eines Hochgeschwindigkeits-Videokamera mit einer Bildfrequenz von 5 M fps mit einer 100-ns Belichtungszeit.
   4. Laden Sie die aufgenommenen Bildsequenz in einem kommerziellen PIV-Software.
   5. Dividieren jedes Bild in kleinere Abfragefenster von 16 x 16 Pixel (px) mit einem 75% überlappen.
   6. Anwenden Multipass-Iterations- und regionale Filter, um die Fehler im Geschwindigkeitsfeld Berechnung zu reduzieren, undgeben die Ergebnisse in einer Geschwindigkeitsvektorkarte.

Abbildung 4: Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus und Bildaufzeichnung. a) Versuchsaufbau zur Tandem - Blase Generation. b) Zeitlicher Ablauf für verschiedene Arten von Abbildungsnahmen verwendet. FL: Fluoreszenzmikroskopie, BF: Hellfeld, IFT: Inter-Zeit. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

3. Single-Zell-Analyse und Bioeffects

HINWEIS: Die Tandemblase neben den Zielzellen erzeugt wird, und die resultierenden Bioeffekte werden in einem Arbeitsabstand abhängigen Weise untersucht. Der zeitliche Ablauf für verschiedene Arten von Bildaufnahmen ist in Abbildung 4b dargestellt.

1. Membranporenbildung und hochmolekularen Aufnahme
   HINWEIS: Die Aufnahme von extrazellulären Makromolekülen in die Zielzelle wird durch die fortschreitende Diffusion von Membran impermeant Propidiumiodid (PI) durch die Poration Stelle auf der Zellmembran aus.
   1. Nach dem Schritt 1.5, ersetzen Sie die regelmäßigen Kulturmedium (dh DMEM) mit PI - Lösung (100 & mgr; g / ml in DMEM) läuft bei einer Perfusionsfördermenge von 0,5 & mgr; l / min während des gesamten Experiments.
   2. Programmieren der Mikroskopsteuerung Software, um automatisch die PI Fluoreszenzwürfel auf dem Drehturm auswählen und die Zeitsteuerung der CCD-Kamera mit dem PI-Fluoreszenzanregung synchronisieren, um Fluoreszenzbilder mit einer Belichtungszeit von 200 ms zu erfassen.
   3. neben einer Zielzelle, Aufnahme sowohl Hellfeld- (BF) und Fluoreszenz (FL) Bilder vor dem Tandemblasenbehandlung nach der beiden Laserherde sind mit einem Paar von Goldpunkten ausgerichtet sind.
   4. Verwenden Mikroskop Steuerungssoftware sofortbeginnen kurz nach einer Zeitraffer-Fluoreszenzbildaufzeichnung der Zielzelle 2.1 Schritt die Geschichte der PI-Aufnahme zu erfassen.
2. Membranverformung
   1. Vorbereitung 1-um-Kügelchen (1% w / v, aktiviert mit wasserlöslichem Carbodiimid) und funktionalisieren sie mit Peptid-2000 (100 ug / ml in PBS).
   2. Nach dem Schritt 1.5, brüten die anhaftenden Zellen mit den funktionalisierten Kügelchen bei einer Dichte von 1x10 ⁹ Perlen / ml bei 37 ° C für 30 min.
   3. Wiederholen Sie Schritt 2,1 bis Tandemblasen neben der Zielzelle herzustellen und die Zellverformung mit einem Ultra-High-Speed-Kamera mit einer Bildfrequenz von 5 Millionen fps aufzeichnen.
   4. Identifizieren einer Triade von drei Kügelchen , die während des Experimentes auf der Abbildungsebene verbleiben und zu kompilieren ihre Positionen als (x _1, y ₁₎ (x _2, y ₂₎ und (x _3, y ₃₎ in der Experiment - Koordinaten.
   5. Berechnen Sie die Fläche der Triade vor und after die Tandem-Blase Behandlung mit der Formel:
      
   6. Berechnen Sie die Fläche Stamm als:
      
   7. Auf der Basis der Koordinaten der drei Eckpunkte vor und nach der Tandem - Blase Behandlung, die Berechnung der örtlichen Hauptdehnung und Flächen Stamm folgenden etablierten Protokollen ^20,21.
3. Viability und Apoptose
   HINWEIS: FITC Annexin V markiert Zellen, einschließlich apoptotischen diejenigen, durch die Externalisierung von Phosphatidylserin (grüne Fluoreszenz). PI-Etiketten die Kerne von nekrotischen Zellen (rote Fluoreszenz). Hellfeldabbildung wird verwendet, die Zellmorphologie zu dokumentieren und mit der Identifizierung von Zelllebensfähigkeit und Apoptose zu unterstützen.
   1. Notieren Sie sich die Position jedes behandelte Zelle in der mikrofluidischen Kanal (durch die Adress - Etiketten in den Kanal erleichtert, siehe 2b
   2. Inkubieren der behandelten Zellen in dem Zellkulturmedium für weitere 2 h, bevor der Chip mit FITC Annexin V Lösung 15 min Perfusion. Positive Zellen zeigen grüne Fluoreszenz.
   3. Wiederholen Sie Schritt 3.3.2 24 h nach der bubble Tandembehandlung die langfristigen Bioeffekte in den Zielzellen zu untersuchen.
4. Calcium - Reaktion
   1. Mix 3 & mgr; l Fura-2 AM Stammlösung (1 mg / ml in DMSO) mit 3 & mgr; l 10% w / v Pluronic F-127 in 500 & mgr; l der reduzierten Serummedium die endgültige Markierungslösung (6 & mgr; M) hergestellt wurde.
   2. Nach dem Schritt 1.5, ersetzen Sie die Zellkulturmedium mit der Markierungslösung und Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln für 40 min (1 & mgr; l / min Durchblutungsrate).
   3. Füllen Sie den Kanal mit dem reduzierten Serummedium (0,75 & mgr; l / min Durchblutungsrate), bevor die Zelle Experiment zu starten.
   4. Starten Sie ratiometrisches Imaging (Wellenlänge: 340/380 nm, 50-ms-Exposition)der Zielzelle die kommerzielle PTI-System.
   5. Nach 10 s von ratiometrisch Bildgebungs der Zelle bei Ruhepegel erzeugen tandem Blasen wie in Schritt 2.1; erste Platte mit einem Zwischenrahmenzeit (IFT) von 0,1 s für 1 min, dann erhöhen Sie die IFT auf 1 s für eine andere min, und eine weitere Erhöhung auf 5 s nach 2 min.
   6. Verwenden Sie das PTI-Software, das Verhältnis R = F340 / F380 in der Region von Interesse (ROI) zu berechnen, die auf die intrazelluläre Calcium-Konzentration proportional ist.

Results

Die mikrofluidischen Plattform in dieser Arbeit beschrieben wurden, können verwendet werden, den Blasen Wechselwirkungen zu untersuchen und eine Vielzahl von Kavitation induzierten Bioeffekte auf Einzelzellebene zu analysieren. Hier stellen wir verschiedene Beispiele einer Vielzahl von experimentellen Untersuchungen und Bioassays zu demonstrieren, die in unseren experimentellen System durchgeführt werden kann. Wir werden zuerst mit der Strahlbildung, die Visualisierung der resultierenden...

Discussion

Einzelzellanalyse, in Kombination mit lebenden Zellen Bildgebung hat sich unser Verständnis der dynamischen und oft variable Prozessen in einzelnen Zellen stark verbessert, wie Phänotyp - Entwicklung und Immunantwort ^23. Im Gegensatz zu der herkömmlichen Zellkultur in Schalen oder -flaschen, ermöglichen mikrofluidische Systeme präzise Steuerung der Mikroumgebung, bis auf die Ebene einzelner Zellen in Echtzeit. Folglich schreitet in Mikrofluidik-Technologien und Techniken weitgehend den Durchsatz und die Repro...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagenz/Materialien
75 mm x 38 mm Einfache Objektträger	Corning	2947-75X38
Aceton	Sigma Aldrich, Co.	320110	ACS-Reagenz, ≥ 99,5%
Isopropylalkohol	Sigma Aldrich, Co.	W292907	≥ 99,7%, FCC, FG
Schwefelsäure	Sigma Aldrich, Co.	320501	ACS-Reagenz, 95,0-98,0 %
Wasserstoffperoxid	Sigma Aldrich, Co.	216763	30 Gew.-% in H2
O Primer P-20	Microchem	MCC Primer 80/20
NFR Fotolack	JSR	NFR016D2
Photomask	Photoplotstore	N/A	4x4 Direct Write Mask
MF-319 Entwickler	Shipley (Rohm and Haas)	Microposit MF-319
1165 Photoresist Remover	Dow Chemical, Co.	DEM-10018073	1-Methyl-2-pyrrolidinon basierter
S1813 Fotolack	Shipley (Rohm and Haas)	S1813
PLL-g-PEG SuSoS		PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630080
Paraffinfilm	HACH	251764
SU-2025 Fotolack	Microchem	SU-2025
PDMS	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0,5 kg
Microbore Schlauch	Saint-Gobain PPL Corp.	S-54-HL
Metallstifte	New England Small Tube	NE-1300-01	Cut Tube (gerade), 0.025" Außendurchmesser x 0,017" Innendurchmesser x 0,50" Lange
HeLa-Zellen	Duke Cell Culture Facility	(307-CCL-2) HeLa, S.148
DPBS (1x) Puffer	ThermoFisher Scientific	14190144 DMEM-Kulturmedium
	ThermoFisher Scientific	11995065
Fibronektin Rinderprotein, Plasma	ThermoFisher Scientific	33010018
0,25% Trypsin-EDTA (1x)	ThermoFisher Scientific	25200056
Propidiumiodid	ThermoFisher Scientific	P21493
Carboxylat-Mikrosphären 1.00  μ m	Polysciences, Inc	08226-15
Carboxylat-Mikrosphären 2.00  μ m	Polysciences, Inc	18327-10
EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid)ThermoFisher	Scientific	22980
Sulfo-NHS	Sulfo-NHS (N-Hydroxysulfosuccinimid)	24510
Peptite-2000	Advanced BioMatrix	5020-5MG
FITC Annexin V	ThermoFisher Scientific	A13199
Fura-2, AM	ThermoFisher Scientific	F1221
DMSO	Sigma Aldrich, Co.	D2650
F-127	Invitrogen	P6866	0,2 &Mikro; m filtriert (10%ige Lösung in Wasser)
Reduzierte Serummedien	ThermoFisher Scientific	11058021
Name	<>Company	Katalognummer	Kommentare
<>Ausrüstung
Plasma-Aschemaschine	Emitech	K-1050X	O2 / Ar-Plasma-Veraschung von Fotolack und andere organische Materialien
Mask Aligner	SÜSS MicroTec	Karl Süss MA6/BA6
E-Beam-Verdampfer	CHA Industries CHA	Industries Solution E-Beam
RIE	Trion Technology	Trion Technology Phantom II	(Oxid / Nitrid / Polymer)
Ätzen Stereoskop	AmScope	American Scope SM-4TZ-FRL	Stereomikroskop
Spritzenpumpe	Chemyx Inc	NanoJet
Zellkultur-Inkubator	NuAire	AutoFlow NU-8500 Water Jacket CO2 Inkubator
Biologische Sicherheitswerkbänke	NuAire	NU-425-400
Wasserbad	VWR	1122s Zentrifuge
	IEC	Centra CL2
Mikroskop	Zeiss	Axio Observer Z1
Nd:YAG Laser   (Laser 1)	New Wave	Research Tempest
Nd:YAG Laser  (Laser 2)	New Wave Research	Orion
	Delay Generator Berkeley Nucleonics	BNC 565-8c
Blitzlampe	Dyna-Lite	ML1000 fasergekoppelte Blitzröhre
Hochgeschwindigkeitskamera	DRS Hadland	Imacon 200
Hochgeschwindigkeitskamera	Shimadzu	HPV-X
Hochgeschwindigkeitskamera	Vision Research	Phantom V7.3
PIV-Software	LaVision	DaVis 7.2
Kamera	Zeiss	AxioCam MRc 5
Software	Zeiss	AxioVision
PTI System	Horiba	S/N: 1705 RAM-X
EasyRatio Software	Horiba	Easy Ratio Pro 2	Version 2.3.125.86
63x Objektiv	Zeiss	LD Plan Neofluar