Method Article

Einem mikrofluidischen System mit Oberflächenstrukturierung zur Untersuchung Kavitationsblase (e) -Cell Interaktion und die Resultierende Bioeffects auf der Ebene einzelner Zellen

DOI:

10.3791/55106

⸱

January 10th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Mechanical Engineering and Materials Science, Duke University, 2Huacells Corp

In This Article

Summary

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Ein mikrofluidischer Chip wurde hergestellt, um Paare von Goldpunkten für die Tandem-Blasenerzeugung und Fibronektin-beschichtete Inseln für die Einzelzellstrukturierung in der Nähe herzustellen. Das resultierende Strömungsfeld wurde durch Particle Image Velocimetry charakterisiert und zur Untersuchung verschiedener Bioeffekte eingesetzt, einschließlich der Zellmembranporation, der Membranverformung und der intrazellulären Calciumreaktion.

Abstract

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In diesem Manuskript beschreiben wir zunächst das Herstellungsprotokoll eines mikrofluidischen Chips, mit Goldpunkten und Fibronektin-beschichteten Bereichen auf dem gleichen Glassubstrat, das mit gut definierten Positionen und Formen strukturiert, um die Erzeugung von Tandem-Blasen und einzelnen Zellen steuert genau in der Nähe. Wir zeigen dann die Erzeugung von Tandem-Blasen, die durch die Verwendung von zwei gepulste Laser ein Paar von Goldpunkten mit ein paar Mikrosekunden Zeitverzögerung zu beleuchten. Wir visualisieren die Blase-Blase Interaktion und die Strahlformung von Hochgeschwindigkeitsaufnahmen und zu charakterisieren, die sich ergebende Strömungsfeld mit Particle Image Velocimetry (PIV). Schließlich präsentieren wir einige Anwendungen dieser Technik für Einzelzellanalyse, einschließlich der Zellmembran Fungs mit Makroaufnahme, lokalisierte Verformung Membran durch die Verschiebungen der angeschlossenen Integrin-bindenden Perlen bestimmt, und die intrazelluläre Calcium-Reaktion von ratiometrisches Imaging. Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine schnelle und direktionale Strahlstrom produced durch die Tandem-bubble-Interaktion, die eine stark lokalisierte Scherbeanspruchung auf der Oberfläche einer Zelle in der Nähe gewachsen auferlegen kann. Darüber hinaus können verschiedene Bioeffekte durch Änderung der Stärke des Strahlflusses von der Zelle durch Einstellung der Arbeitsabstand zu den Tandemblasen induziert werden.

Introduction

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Es gibt eine wachsende Erkenntnis , dass zellulärer Heterogenität, aus dem stochastischen Expression von Genen ergeben, Proteinen und Stoffwechselprodukten , innerhalb einer großen Zellpopulation vorhanden ist, und dient als ein grundlegendes Prinzip in der Biologie zur Zell Anpassung und Evolution 1 zu ermöglichen. Daher ist es oft ungenau und unzuverlässig populationsbasierten Massenmessungen verwenden, um die Funktion der einzelnen Zellen und deren Wechselwirkungen zu verstehen. Die Entwicklung neuer Technologien für die Analyse Einzelzelle ist daher von großem Interesse in der biologischen und pharmakologischen Forschung und kann verwendet werden, beis....

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Protocol

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1. Mikrofertigung

HINWEIS: Alle Mikrofabrikationsverfahren werden in einem Reinraum durchgeführt. Eine Chrommaske wird vor dem Mikro entworfen, siehe Abbildung 2.

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Abbildung 2: Schematische Darstellung des Kanaldesign in der Mikrofluidik - Chip und den Abmessungen der Arbeitseinheiten. a) Mask Design der ausgerichteten PDMS Mikrokanäle (grün) und die Muster auf dem Glassubstrat (blau und rot). b) vergrößertes Bil....

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Results

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Die mikrofluidischen Plattform in dieser Arbeit beschrieben wurden, können verwendet werden, den Blasen Wechselwirkungen zu untersuchen und eine Vielzahl von Kavitation induzierten Bioeffekte auf Einzelzellebene zu analysieren. Hier stellen wir verschiedene Beispiele einer Vielzahl von experimentellen Untersuchungen und Bioassays zu demonstrieren, die in unseren experimentellen System durchgeführt werden kann. Wir werden zuerst mit der Strahlbildung, die Visualisierung der resultierenden.......

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Discussion

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Einzelzellanalyse, in Kombination mit lebenden Zellen Bildgebung hat sich unser Verständnis der dynamischen und oft variable Prozessen in einzelnen Zellen stark verbessert, wie Phänotyp - Entwicklung und Immunantwort 23. Im Gegensatz zu der herkömmlichen Zellkultur in Schalen oder -flaschen, ermöglichen mikrofluidische Systeme präzise Steuerung der Mikroumgebung, bis auf die Ebene einzelner Zellen in Echtzeit. Folglich schreitet in Mikrofluidik-Technologien und Techniken weitgehend den Durchsatz und die Repro.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

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Wir möchten uns für die Nutzung der Reinraumeinrichtung SMIF an der Duke University bedanken. Wir möchten uns auch bei Hao Qiang für seine Hilfe bei der Messung der Strahlgeschwindigkeit bedanken. Die Autoren danken Todd Rumbaugh von Hadland Imaging für die Bereitstellung der in dieser Studie verwendeten Shimadzu HPV-X-Kamera. Die Arbeit wurde teilweise vom NIH durch die Zuschüsse 5R03EB017886-02 und 4R37DK052985-20 finanziert.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagenz/Materialien
75 mm x 38 mm Einfache ObjektträgerCorning2947-75X38
AcetonSigma Aldrich, Co.320110ACS-Reagenz, ≥ 99,5%
IsopropylalkoholSigma Aldrich, Co.W292907≥ 99,7%, FCC, FG
SchwefelsäureSigma Aldrich, Co.320501ACS-Reagenz, 95,0-98,0 %
WasserstoffperoxidSigma Aldrich, Co.21676330 Gew.-% in H2
O Primer P-20MicrochemMCC Primer 80/20
NFR FotolackJSRNFR016D2
PhotomaskPhotoplotstoreN/A4x4 Direct Write Mask
MF-319 EntwicklerShipley (Rohm and Haas)Microposit MF-319
1165 Photoresist RemoverDow Chemical, Co. DEM-100180731-Methyl-2-pyrrolidinon basierter
S1813 FotolackShipley (Rohm and Haas)S1813
PLL-g-PEG SuSoSPLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
HEPESThermoFisher Scientific15630080
ParaffinfilmHACH251764
SU-2025 FotolackMicrochemSU-2025
PDMSDow Corning184 SIL ELAST KIT 0,5 kg
Microbore SchlauchSaint-Gobain PPL Corp.S-54-HL
MetallstifteNew England Small TubeNE-1300-01Cut Tube (gerade), 0.025" Außendurchmesser x 0,017" Innendurchmesser x 0,50" Lange
HeLa-ZellenDuke Cell Culture Facility(307-CCL-2) HeLa, S.148
DPBS (1x) PufferThermoFisher Scientific14190144 DMEM-Kulturmedium
ThermoFisher Scientific11995065
Fibronektin Rinderprotein, PlasmaThermoFisher Scientific33010018
0,25% Trypsin-EDTA (1x)ThermoFisher Scientific25200056
PropidiumiodidThermoFisher ScientificP21493
Carboxylat-Mikrosphären 1.00  μ mPolysciences, Inc08226-15
Carboxylat-Mikrosphären 2.00  μ mPolysciences, Inc18327-10
EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid)ThermoFisherScientific22980
Sulfo-NHSSulfo-NHS (N-Hydroxysulfosuccinimid)24510
Peptite-2000Advanced BioMatrix5020-5MG
FITC Annexin VThermoFisher ScientificA13199
Fura-2, AMThermoFisher ScientificF1221
DMSOSigma Aldrich, Co.D2650
F-127InvitrogenP68660,2 &Mikro; m filtriert (10%ige Lösung in Wasser)
Reduzierte Serummedien ThermoFisher Scientific11058021
Name<>CompanyKatalognummerKommentare
<>Ausrüstung
Plasma-AschemaschineEmitechK-1050XO2 / Ar-Plasma-Veraschung von Fotolack und andere organische Materialien
Mask AlignerSÜSS MicroTecKarl Süss MA6/BA6
E-Beam-VerdampferCHA Industries CHAIndustries Solution E-Beam
RIETrion Technology Trion Technology Phantom II(Oxid / Nitrid / Polymer)
Ätzen StereoskopAmScopeAmerican Scope SM-4TZ-FRLStereomikroskop
SpritzenpumpeChemyx IncNanoJet
Zellkultur-InkubatorNuAireAutoFlow NU-8500 Water Jacket CO2 Inkubator
Biologische SicherheitswerkbänkeNuAireNU-425-400
WasserbadVWR1122s Zentrifuge
IECCentra CL2
MikroskopZeissAxio Observer Z1
Nd:YAG Laser   (Laser 1)New WaveResearch Tempest
Nd:YAG Laser  (Laser 2)New Wave ResearchOrion
Delay Generator Berkeley Nucleonics BNC 565-8c
BlitzlampeDyna-LiteML1000 fasergekoppelte Blitzröhre
HochgeschwindigkeitskameraDRS Hadland  Imacon 200
HochgeschwindigkeitskameraShimadzuHPV-X
HochgeschwindigkeitskameraVision ResearchPhantom V7.3
PIV-SoftwareLaVisionDaVis 7.2
KameraZeissAxioCam MRc 5
SoftwareZeissAxioVision
PTI SystemHoribaS/N: 1705 RAM-X
EasyRatio SoftwareHoribaEasy Ratio Pro 2Version 2.3.125.86
63x ObjektivZeissLD Plan Neofluar

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, D., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
  2. Weaver, W. M., et al. Advances in high-throughput single-cell microtechnologies. Curr Opin Biotechnol. 25, 114-123 (2014).
  3. Gossett,....

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Microfluidic SystemSurface PatterningCavitation BubbleTandem BubblesSingle Cell AnalysisHigh Speed ImagingParticle Image VelocimetryCell Membrane PorationIntracellular Calcium ResponseGold Dot Patterning

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