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Abbilden der Neutrophilen Phagosomen und Zytoplasma Mit einem Ratiometrisch pH-Indikator

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DOI:

10.3791/55107

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5. April 2017

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1Centre for Molecular Medicine, Division of Medicine, University College London, 2Cell and Developmental Biology, University College London

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Handschrift beschreibt eine einfache Methode, um die phagosomalen und pH-Bereich sowie die cytoplasmatische pH von menschlichen und Maus-Neutrophilen unter Verwendung des ratiometrischen Indikatoren seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, oder S-1 zu messen. Dies wird in lebenden Zellen konfokale Fluoreszenzmikroskopie und Bildanalyse erreicht werden.

Zusammenfassung

Neutrophile sind entscheidend angeborene Verteidigung zu hosten und damit auch ein wichtiger Bestandteil der medizinischen Forschung. Phagosom, die intrazelluläre Kompartimente, in denen die Tötung und Verdauung von verschlungen Teilchen stattfinden, ist die Haupt Arena für die Neutrophilen Pathogen Abtötung, die strenge Regulierung erfordert. Phagosomalen pH ist ein Aspekt, sorgfältig gesteuert wird, die wiederum Regulierung antimikrobielle Protease-Aktivität. Viele fluoreszierende pH-sensitive Farbstoffe wurden verwendet, um die phagosomalen Umgebung sichtbar zu machen. S-1 hat mehrere Vorteile gegenüber anderen pH-empfindliche Farbstoffe, einschließlich seiner Doppelemissionsspektren, die Beständigkeit gegen Photobleiche, und seine hohe pKa. Mit dieser Methode haben wir gezeigt, dass die neutrophilen phagosome im Vergleich zu anderen Phagozyten ungewöhnlich alkalisch ist. Durch die Verwendung verschiedene biochemische Konjugationen des Farbstoffes können die phagosome aus dem Cytoplasma abgegrenzt werden, so dass Änderungen in der Größe und Form des phagosome beurteilt werden können. Dies ermöglicht es foder eine weitere Überwachung der Ionenbewegung.

Einleitung

Die Neutrophilen sind die häufigste angeborenen Immunzellen im Körper. Seine Hauptfunktion besteht darin , den Blutstrom patrouillieren und Verschlingen und die Fremdpartikel verdauen , dass es in einem Verfahren , wie Phagozytose 1, 2 bekannt , die auftreten können. Die Partikel werden in einem intrazellulären Kompartiment Phagosom genannt abgebaut. Die Aktivierung der neutrophilen NADPH-Oxidase, die Isoform NOX2, initiiert eine Kaskade biochemischer Reaktionen, die in dem Tod des Pathogens gipfelt. NOX2 Proteinuntereinheiten fortfahren in der phagosomalen Membran 3 eine Elektronentransportkette Komplex zu bilden. Einmal aktiviert, es transportiert Elektronen von NADPH durch die Membran zu molekularem Sauerstoff im Innern des phagosome, Superoxidanionen Herstellung und weiteren reaktive Sauerstoffspezies. Dies wird als respiratory burst bekannt, und es wird angenommen , dass für eine effiziente mikrobielle Tötung und Verdauung 2 wesentlich zu sein . Allerdings ist diese exklusive Bewegung der negativen Ladung durch die Membran würde bald NOX2 inaktivieren, wenn es nicht durch positive Ladung kompensiert bewegen sich in und / oder negative Ladung aus dem phagosome bewegen. Es wurde bekannt, dass die Mehrheit der Ladungsausgleich in den Neutrophilen wird HVCN1 4 durch den Protonenkanal durchgeführt wird , 5. Dieser Kanal ermöglicht die passive Bewegung von Protonen nach unten ihren elektrochemischen Gradienten aus dem Cytosol in die phagosome. Protonenkonzentration wird durch pH reflektiert, so dass für ein gegebenes Niveau der Oxidase-Aktivität kann der pH-Wert im phagosome Messung liefern Informationen über die relative Beteiligung von protonischen und nicht-protonischen Wege in den Ladungsausgleich.

Die humanen neutrophilen phagosome hat einen alkalischen pH - Wert von etwa 8,5 für 20 bis 30 Minuten nach der Phagozytose 5. Dies impliziert die Existenz von zusätzlichen Nicht-Protonen-Ionenkanälen in NOXLadungskompensation 2-induzierten, als Fusion und Freisetzung des Inhalts der sauren Granulat und alleinige Kompensation durch HVCN1 würde ein saures Milieu, im Gegensatz zu dem beobachteten aufrechtzuerhalten. Die Bewegung von Ionen Dieser negative Ladung zu kompensieren, kann auch Änderungen in phagosome Größe über Osmose ausüben. Diese können Ionen anwesend seine in den Neutrophilen bei hohen physiologischen Konzentrationen: Kaliumionen wurden in die phagosome 6 gezeigt zu bewegen, und Chlorid - Ionen - Bewegung ist ein weiterer Kandidat für die Neutrophilen - Funktion wichtig 7.

Die Regulierung des pH - Wertes in dem phagosome ist lebenswichtig für die antimikrobielle Protease - Aktivität 5. Myeloperoxidase (MPO) erscheint bei pH 6 optimale Aktivität zu haben, während für Kathepsin G und Elastase, die optimalen Niveaus sind pH 7-9 und pH 8-10 bzw. 5. Daher kann vorübergehende Veränderung in phagosomalen pH-Aktivitäts Nischen sorgen für verschiedene Enzyme Spaßction. Zu verstehen, wie pH-Wert in Neutrophilen mikrobiellen Tötung beteiligt ist nützliche Informationen für das Design neuer Neutrophilen-Vermehrung mikrobielle Mittel bereitstellen.

Die Neutrophilen phagosome ist ein hochreaktives Umgebung. Dies macht es schwierig, pH-Wert genau zu beurteilen, weil Farbstoffe können leicht oxidiert werden, um technische Artefakte führt. Historisch hat Fluoresceinisothiocyanat (FITC) der Farbstoff der Wahl 8 intrazellulären pH zu messen, 9. Es gibt jedoch einige Nachteile für die Verwendung bei der Messung von Neutrophilen phagosomalen pH-Wert. Es hat einen pKa von 6,4 10, was bedeutet , dass es nur genau verwendet werden kann , um pH - Werte von 5 bis 7,5 8 beurteilen zu können , wie es bei pH <8 11 sättigt. Da die Neutrophilen phagosomalen pH viel mehr alkalisch 5 werden kann, kann FITC nicht das gesamte Spektrum möglicher pH - Änderungen erfassen. Eine weitere signifikippe Problem mit FITC im Rahmen von Neutrophilen ist , dass es angenommen wird , von MPO 12 wurde gebleicht. Die MPO - Inhibitor, Natriumazid, verwendet werden , 13 zu begrenzen , Photobleich, aber es hat sich gezeigt , dass Natriumazid direkt die phagosomalen pH in einem MPO-unabhängigen Weise senkt und ist somit ungeeignet für die Verwendung in solchen Assays 5.

Im Vergleich zu anderen intrazellulären Farbstoffen S-1 hat einen relativ hohen pKa - Wert von 7,5 10. In sauren Bedingungen ist das Molekül protonierten und erzeugt ein Emissionssignal zwischen 560 und 600 nm, wenn sie bei 488 nm oder darüber angeregt werden. Wenn das Molekül in stärker alkalischen Bedingungen deprotoniert wird, ist die Emissionswellenlänge über 600 nm. Ein Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten bei den beiden Wellenlängen zeigt die Emissionsschicht, die mehr ist zuverlässiger als einzelne Fluoreszenzmessungen ist, wie es von Fluorophor-Konzentration und Zellstruktur nicht betroffen ist. S-1 kann an antigenem Material konjugiert werden, wie beispielsweise Zymosan 14, obwohl Hitze abgetöteten (HK) Candida albicans ist bevorzugt, da die größere Oberfläche eines konsistentere Fluoreszenzmesswert ergibt.

Wir haben auch verwendet , eine Modifikation dieses Verfahren zeitliche Veränderungen in pH (Abbildung 3) 5 zu studieren. Dieses Verfahren zur Messung des cytosolischen pH - Wertes kann leicht auf andere Zelltypen angewandt werden, wie an anderer Stelle beschrieben 15, 16, und Zellen , die mit alkalischen Phagosomen 14.

Protokoll

Ethik Aussage: Alle Tier Arbeit mit der Lizenz und Genehmigung des Vereinigten Königreichs Home Office durchgeführt wurde. Menschliche Teilnahme an dieser Forschung wurde von der Gemeinsamen UCL / UCLH Ausschüsse für die Ethik der Human Research genehmigt. Alle Teilnehmer zur Verfügung gestellt informierte Zustimmung.

1. Herstellung von C. albicans

  1. Wachsen Sie einen Candida - Disc (siehe Materialliste) auf einer YPD - Agar - Platte gemäß der Anweisungen des Herstellers. Wählen Sie eine Kolonie, und fügen Sie 15 ml YPD-Brühe. Inkubieren es in einem Schüttelinkubator bei 30 ° C und 200 Umdrehungen pro Minute , bis die Brühe trüb ist ( in der Regel ca. 2 Tage, oder bis zu einer Konzentration von etwa mehr als 1 x 10 9 / ml).
  2. Drehte das Candida Medium nach unten und Resuspendieren in 50 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Zentrifuge bei 3.000 xg für 10 min. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt.
  3. Das Röhrchen 50 ml PBS / Candida - Medium in einem Wasserbad enthält , vorerwärmt auf 60 ° C , so dass das gesamte Rohr s istfür 1 h ubmerged.
    1. Um zu bestätigen , dass die Candida sind durch Hitze abgetötete, Streifen eine Probe auf eine YPD - Agar - Platte und Inkubation über Nacht bei 30 ° C. Stellen Sie die Hitze abgetöteten (HK) Candida - Konzentration auf 5-9 x 10 8 / ml, in Abhängigkeit von Candida - Wachstum, und es in 1 ml Aliquots in einem -20 ° C - Gefrierschrank.
      HINWEIS: Alle Zellzahlen in diesem Protokoll wurden unter Verwendung eines automatisierten Zellzähler ausgeführt.

2. S-1 Kopplung an Hitze abgetötete (HK) Candida

  1. Bereiten eines Aliquots carboxy-S-1-succinimidylester (50 ug), indem sie in 100 & mgr; l von hochwertigen Dimethylsulfoxid (DMSO) verdünnt. Vortex gut zu mischen.
  2. Herstellung von 1 ml 1 x 10 8 HK Candida in 0,1 M Natriumbicarbonat (pH 8,3) in einem 15 ml Röhrchen.
  3. Füge 100 & mgr; l carboxy-S-1 ein Tropfen zu einer Zeit , zu der HK Candida , während bei etwa 2000 Umdrehungen pro Minute auf einem Vortex - Mischen (mittlere bis hohen Drehzahl). Wickeln Sie Aluminium foil um das Rohr und sie auf einer Walze bei Raumtemperatur für 1 h.
  4. Waschen Sie die HK Candida- S-1 (HKC-S-1) dreimal durch Zentrifugation bei 2.250 xg für 10 min jeweils. Für die ersten zwei Waschungen, das Pellet in 15 ml 0,1 M Natriumbicarbonat (pH 8,3). Nach dem dritten Waschen, Resuspendieren in 1 ml balancierter Salzlösung (BSS) -Puffer (siehe Tabelle 1).
  5. Übertragen der HKC-S-1-Suspension in Röhrchen in 100 ul Aliquots und lagern Sie sie bei -20 ° C.
    HINWEIS: Die Verwendung Rohre mit geringem Oberflächenmaterial zu binden, wenn möglich, als HKC-S-1-Partikel an die Wand des normalen Zentrifugenröhrchens kleben können.
  6. Opsonisieren HKC-S-1
    1. Für menschliche Neutrophile, 100 & mgr; l Human-IgG-Serum zu 100 ul aufgetauten HKC-S-1.
    2. Maus für Neutrophile, werden 50 ul normalem Mausserum und 50 & mgr; l Maus - Candida - Immunserum (erzeugt aus C57B6 - Mäusen mit HK Candida injiziert) 5 bis 100 & mgr; lder HKC-S-1.
    3. Mischen Sie es auf einem hitzeSchüttler bei 37 ° C und 1100 rpm für 60-90 min, und dann auf einer 4 & deg; C für 2 h Walze.
    4. Wasche dreimal in BSS-Puffer durch Zentrifugation bei 17.200 xg für jeweils 1 min. Resuspendieren in 100 ul Puffer BSS.

3. Isolierung von Neutrophilen

  1. Für menschliche Neutrophilen des peripheren Bluts, nehmen 15 ml Blut durch Venenpunktur von einem gesunden Spender und legen sie in eine 20 ml Spritze 90 ul von 1.000 IU / ml Heparin-Natrium-Lösung (60 ul Heparin / 10 ml Blut) enthält.
  2. Mit Hilfe einer Pipettenspitze, injizieren 1,5 ml 10% Dextran-Lösung in die Spritze. Kehren Sie es sanft 3-mal und lassen Sie es aufrecht auf der Bank stehen.
  3. 30-60 min warten, bis das Blut grob in zwei Hälften geteilt ist, mit einer oberen buffy coat-Schicht, die strohfarbene und eine untere Schicht enthält, Erythrozyten.
  4. Vorsichtig schiebt die oberste Schicht durch eine Nadel oder es mit einer Pipettenspitze entfernen. Legen Sie es ina 15 ml-Röhrchen. Vermeiden Sie die rote Schicht herausnehmen. Unter Verwendung einer 5 ml-Pipette, fügen 3-4 ml Dichtegradientenmedium (siehe Materialliste) an den Boden des Röhrchens unter der buffy coat-Schicht zwei verschiedene Schichten zu erhalten. Zentrifuge bei 913 × g für 10 min.
    HINWEIS: Bei Verwendung von Neutrophilen - Maus (Referenz 17 für Maus Neutrophilen Isolation sehen), verwendet , um die Zellsuspension , die anstatt aus dem Knochenmark ausgespült wurde.
  5. Gießen Sie den Überstand ab, hinter einem roten Pellet zu verlassen. Sanft Wirbel um das Pellet zu stören. 7 ml destilliertes, autoklaviert H 2 O zu dem Pellet und Invertzucker für 20 s um das Pellet zu resuspendieren. In 7 ml 2x Kochsalzlösung und mehrmals umschwenken zu mischen, um die verbleibenden roten Blutkörperchen lysieren.
  6. Zentrifuge bei 300 × g für 5 min. Gießen Sie den Überstand und das Pellet in BSS - Puffer auf etwa 4 x 10 6 / ml ab.
    HINWEIS: Für eine optimale Mikroskopie der Zellen, halten die Zellsuspensionskonzentration zwischen 1,5-6 x 10 6 / mL.

4. Herstellung von Folien

  1. ein 8-Well-Platte-Mikroskopie (siehe Materialliste) mit 200 & mgr; l Poly-L-Lysin (0,01% ige Lösung) in jeder Vertiefung für 40-60 min bei Raumtemperatur vorge behandeln.
  2. Entfernen des Poly-L-Lysin (kann wiederverwendet werden) und wäscht die Vertiefungen zweimal mit 200 ul destilliertem H 2 O.
  3. In 200 ul Zellsuspension, hergestellt in Schritt 3.6 in jeder Vertiefung. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30-60 min.
  4. Bereiten einen Aliquots von 5- (und-6) -Carboxy S-1 Acetoxymethyl (S-1-AM) ester (50 & mgr; g) durch Zugabe von 100 & mgr; l von hochwertigen DMSO zu einem Röhrchen. Vortex zu mischen. Wenn nicht in Gebrauch, bei -20 ° C.
  5. In einem Röhrchen, fügen Sie 1,7 ml BSS-Puffer und 20 ul S-1-AM. Vortex zu mischen.
  6. Waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit 200 & mgr; l BSS-Puffer, und dann den Puffer mit der S-1-AM-Lösung ersetzen. Achten Sie darauf, um die Monoschicht von Zellen nicht stört zum Boden des Bohrlochs angebracht durch vorsichtiges Pipettierendie Mauern der Mulden. Inkubieren bei Raumtemperatur mindestens 25 min.
  7. Waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit 200 & mgr; l BSS-Puffer. einen „Master-Mix“ des entsprechenden Medikaments in BSS-Puffer, um einen Inhibitor zu testen, bilden. Waschen Sie die Vertiefungen zweimal in der Inhibitorlösung.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher , dass die gleiche Menge an Arzneimittel Fahrzeug (zB DMSO oder Ethanol) in der Steuerung zu verwenden und wurde für den Inhibitor verwendet. Wenn die Wirkung von Zinkchlorid zu testen, verwendet BSS - Puffer fehlt KH 2 PO 4 (die HEPES - Lösung kann die Puffer allein), wie Zink mit Phosphat ausfällt.
  8. Beschallen die opsonisierten HKC-S-1 (Abschnitt 6.2) für etwa 3 s bei 5 & mgr; m Amplitude. In 10 & mgr; l zu jeder Vertiefung. Inkubiere die Platte bei 37 ° C für 15-20 min Phagozytose zu ermöglichen, die Zellen bereit, was für Schnappschüsse von Phagozytose abgebildet werden soll.

5. konfokale Mikroskopie

  1. ein konfokales Mikroskop, Einstellen der Laserwellenlänge so than den Zellen angeregt bei 555 nm und die Emission von zwei Kanälen festgestellt wird, oder Detektoren: 560-600 nm und über 600 nm.
    HINWEIS: Spezielle Mikroskopparameter für jedes Mikroskop unterscheiden und müssen vom Forscher optimiert werden.
  2. Sehen Sie sich die Zellen ein 63X-Objektiv mit Öl. Verwenden Sie eine Kachel-Scan-Bild auf die kontinuierliche Einstellung der Mitte Kachel anzuzeigen. Mit Hilfe der Fluoreszenzintensität und der Verstärkung der Detektorkanäle, stellen den Fokus und die Intensität des Lasers und die Verstärkung der beiden Kanäle um das Bild zu optimieren.
  3. Teilen Sie die Bild der Einstellungen unter Verwendung beiden Kanäle zu sehen; überprüfen, dass es keine Sättigung der Fluoreszenzintensität im Zytoplasma oder Vakuolen ist. Sättigung erscheint als rote Punkte. Reduzieren Sie die Laserintensität so, dass es eine minimale Anzahl von roten Punkten, aber die Zellen und phagosomes sind hell genug, um klar zu sehen.
  4. Wenn Sie zufrieden sind, klicken Sie auf „Experiment starten.“ A 9-tile Abtastbild erzeugt. Speichern Sie das Bild als eine komplexe Datei empfohlen vondie Software, die ein zusammengesetztes Bild der beiden Kanäle (nicht JPEG- oder TIFF) enthält.

6. Kalibrierung Experimente

  1. Konstruieren Sie die pH - Standardkurve mit Candida allein.
    1. Bereiten Sie die Puffer von pH 3,0 bis 13,0, gemäß Tabelle 1.
    2. Nehmen Sie eine Teilmenge (100 & mgr; l) von HKC-S-1. Spin es für 1 min bei 17.200 x g nach unten. Resuspendieren in 500 & mgr; l der zugeordneten Puffer.
    3. Ausgehend von dem niedrigsten pH-Bereich, fügen die Suspension auf eine vorbehandelte gut (aus Schritt 4.2). Platzieren der Schieber auf dem konfokalen Mikroskop auf einem Heiztisch auf 37 ° C.
    4. Notieren Sie sich die Fluoreszenz jedes min für 10 min. Wiederholen Sie dies für jeden Puffer.
  2. Saponin Standardkurve.
    1. Isolieren 1 x 10 7 humane Neutrophilen 5 und resuspendieren sie in 1 ml des niedrigsten pH - Puffers.
    2. Folgen Sie die in Abschnitt 4 beschriebenen Verfahren zur Messung phagosomal pH-Wert in Neutrophilen.
    3. Nach der Inkubation mit der Suspension Candida für 20 min, Zugabe von 0,3% Saponin (15 & mgr; l von 10% Stamm einen vorbehandelte gut (aus Schritt 4.2)) an die Schale, und dann 20 min bei 37 ° C inkubieren. Nehmen Sie ein Bild jede Minute für 10 Minuten. Wiederholen Sie dies für jeden Puffer.
  3. Cytosolischen pH Standardkurven der hohen K + / Nigericin - Technik unter Verwendung von 5, 18, 19.
    1. Bilden Sie die beschriebenen Puffer in Tabelle 1 von pH 4,0 bis 13,0.
    2. Führen Sie die Schritte 4,1-4,7, nur Neutrophile in den vorbehandelten Vertiefungen verlassen - jede Vertiefung einen anderen Puffer enthalten. Fügen Sie die Folie in die 37 ° C erhitzt, Phase und erfassen die Fluoreszenz jedes min für 10 min.
    3. Anmerkung: Es kann einige Zeit dauern, bis der cytosolischen pH mit der externen Lösung zu stabilisieren, aber nach diesem Punkt ist der S-1-Verhältnis Wert wirdKonstante. Messung der extrazellulären HKC-S-1 in jedem Experiment kann als Kontrolle dienen, um zu überprüfen, dass alle hinzugefügt Inhibitoren interferieren nicht mit der S-1 emittierte Fluoreszenz oder den Puffer des pH beeinflussen.

7. Bildanalyse

HINWEIS: Hier Anweisungen für die Bildanalyse (Quantifizierung der Fluoreszenz) mit der ImageJ freien Software zur Verfügung gestellt wird. Die Verwendung von ImageJ wird empfohlen.

  1. Herunterladen und Installieren von ImageJ Version> 1.46r gemäß der Entwickler-Anweisungen (https://imagej.nih.gov/ij/). Installieren Sie die Zusatz-Code-Datei mit diesem Protokoll beigefügt namens „phagosomalen Messung.“
  2. Bild öffnen J und laden Sie die Bilddatei für die Analyse auf der Symbolleiste ausgewählt. Um die beiden Kanäle zu kombinieren, verwenden Sie Bild> Farbe> Composite-Machen.
  3. Rechtsklick auf eine Datei auszuwählen, in dem Ergebnis zu speichern.
  4. Klicken Sie auf das Zeilenwerkzeug in der Werkzeugleiste und doppelklicken Sie auf die Breite erhöhen # &34; 2 „ist.
  5. Zeichnen Sie eine Linie über die Breite eines phagosome, und dann mit der rechten Maustaste auf „Maß pH“. Die mittlere Intensität der zwei Kanäle erfasst wird, und ihr Verhältnis wird automatisch durch die Codedatei in ImageJ berechnet.
  6. Nach den Messungen Fertigstellung der rechten Maustaste wählen „Datei speichern“.
  7. Um den phagosome Bereich zu messen, verwenden Sie das vierte Symbol entlang der Werkzeugleiste freihändig um den Bereich zu ziehen. Rechtsklick auf die Option „Messfeld.“
    HINWEIS: Die Ergebnisse werden gespeichert und eine Protokolldatei im Verzeichnis ausgewählt erzeugt. Die Ergebnisse können unter Verwendung von Tabellenkalkulationsprogramm, R oder eine gleichwertige Software verarbeitet. Die Beziehung zwischen dem Fluoreszenzverhältnis auf pH beträgt ca. sigmoidal, und die Verhältniswerte von der ImageJ Analyse erzeugt wird, können eine verallgemeinerte logistische oder Sigmoidfunktion oder durch lineare oder kubische Spline-Interpolation auf pH umgewandelt werden.
  8. Um Zytoplasma zu messen, eine Linie über das Zytoplasma ziehen und die rechte Maustaste auf „Maß pH“.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt Schnappschüsse von Neutrophilen verschiedener Herkunft unterschiedlicher phagosomalen Umgebungen zu demonstrieren. Zur quantitativen Analyse zu erleichtern, ist es wichtig, die Vertiefungen mit einer entsprechenden Anzahl von Zellen zu impfen: zu viele werden die Zellen dazu führen, dass über jede andere Schicht, was es schwierig macht eingeschlossen phagosomes zu sehen genau; zu wenig Willen, natürlich, weniger Ergebnisse liefern, zumal nicht jeder neutrophile Phagozytose wird. 2 ist ein Bild , das über tigten ist; Dies kann durch Aufteilen des Bildes zwischen seinen beiden Kanälen (unter Verwendung der Mikroskop-Software in der Materialliste oder einem äquivalenten empfohlen) bewertet werden - rote Punkte zeigen, wo maximale Fluoreszenz detektiert wurde. Dies kann durch eine Verringerung der Intensität des Lasers begegnet werden. Kalibrierungskurven , die verschiedene Puffersysteme verwenden , sind in Abbildung 3, von Levine et al angepasst dargestellt. 5 </ Sup>. Die Fehlerbalken zeigen, dass es eine gewisse Variation in der Fluoreszenz zwischen den Messungen. Abbildung 4 zeigt ein Beispiel dafür , wie die Daten für phagosomalen pH - Wert und Bereich könnten vorgelegt werden. Dieser Ansatz ermöglicht es jede einzelne Messung mit einer überlegenden boxplot angezeigt werden. Allerdings könnten die Daten auch in einem Histogramm-Balkendiagramm angezeigt werden.

figure-results-1
Abbildung 1: Geeignete Snapshot - Bilder von Neutrophilen von Menschen und Mäusen. Um ganz rechts ist ein qualitativer visueller Schlüssel der ungefähren Farbe der S-1-gefärbte phagosomes auf den pH-Wert entspricht. Die gelbe Farbe zeigt mehr Säure, während Rot mehr Alkalität zeigt. (A) zeigt Hvcn1 - / - Maus - Knochenmark - Neutrophile 20 min nach der Phagozytose. Die phagosomes erscheinen sehr rot, alkalisch und geschwollen. Der rote Pfeil in der rechten unteren Teil desBildpunkte auf einer intrazellulären Candida, während der Pfeil in der linken oberen Punkte an eine extrazelluläre Partikel. (B) zeigt Wildtyp- Knochenmark der Maus , die Neutrophile Candida eingenommen haben; sie sind viel weniger alkalisch als Hvcn1 - / - Zellen. (C) zeigt menschliche peripheres Blut Neutrophilen am gleichen Punkt nach der Phagozytose. Sie erscheinen leicht alkalischer als die Maus Wildtypzellen, aber die phagosomes sind noch nicht so groß und rot wie die Hcvn1 - / - Zellen. (D) zeigen menschliche Neutrophilen , die 5 uM Diphenylen iodonium (DPI) phagozytiert Candida in Gegenwart haben. Alle phagosomes sind sehr sauer, mit einem pH-Wert von 6 oder weniger; das Medikament hemmt die NADPH-Oxidase, so gibt es keine Ausgleichsionenbewegung. Die Protonen aus dem sauren Granulat freigesetzt, die zur Sicherung verursachen phagosome sauren pH 20, und eine erhöhte Rekrutierung der V-ATPase the phagosomalen Membran bei Behandlung mit DPI 9. Das Zytoplasma erscheint auch mehr alkalisch im Vergleich zu den Zellen von den anderen Bedingungen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

figure-results-2
Abbildung 2: Übersättigung von Hvcn1 - / - Maus Knochenmark Neutrophilen. Es ist wichtig, aus den Analysebilder ausschließen, in denen die Fluoreszenzdaten über gesättigt sind. Wie in Abschnitt 5.3 beschrieben, wird das zusammengesetzte Bild in zwei Bilder aufgeteilt (oben links, roter Pfeil) mit sowohl einzeln dargestellt Kanälen. In dieser Software wird geprüft Bereichsanzeige auf (links unten, roter Pfeil), werden alle Pixel, die über gesättigt sind leuchtend rot. Es ist eine Übersättigung, die in beiden Kanälen (1 und 2). Ein magnification einiger Zellen und extrazelluläre Candida wird unten rechts dargestellt, mit Pfeilen auf die betroffenen Stellen zeigen. diese Punkte zu analysieren zu einer falschen Quotientenmeßschaltung führen würde. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

figure-results-3
Abbildung 3: Standardkalibrierungskurven für die Umwandlung von S-1 - Fluoreszenz - Verhältnissen auf pH - Messungen. Die Standardkurven für Candida allein in den verschiedenen Puffern (markiert als „Tris“) , und wenn die Zellen mit Saponin ( „Saponin“) permeabilisiert werden , sind sehr ähnlich, was zeigt , dass die S-1 das Lesen innerhalb und außerhalb der Zelle (phagosome und extrazellulärem mittel) sind vergleichbar. Die Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SD. Die S-1-Verhältnis / pH-Kurve verkürzt wird, wenn i getestetn das Zytoplasma ( „Cytoplasma“), die unter Berücksichtigung der in der Bildanalyse genommen werden sollte. Diese Zahl wurde von Levine et al modifiziert. 5. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

figure-results-4
Abbildung 4: Quantifizierung der phagosomalen pH und Fläche. Diese Abbildung zeigt ein Beispiel für die Datenpräsentation. Die Diagramme wurden unter Verwendung der Programmiersoftware erzeugt R. A: phagosomalen Verhältnis und entsprechende pH - Wert für A zeigt (Hvcn1 - / - Maus - Knochenmark - Neutrophile), B: Wildtyp- Maus - Knochenmark Neutrophilen, C: humane periphere Blut Neutrophile und D: menschliche Neutrophilen mit 5 uM DPI n = 3/300. Einzelmessungen sind als kleine Quadrate dargestellt, mit einem mit medi Übereinander boxplotein und Quartilabstand. Ein roter Balken stellt den Mittelwert. Wie in den Bildern in Abbildung 1 zu sehen ist , Hvcn1 - / - Zellen haben sehr alkalisch phagosomes im Vergleich zu Wildtyp - Maus und humanen Neutrophilen. Sie haben auch einen größeren phagosomalen Bereich (4B, n = 3/300). Humane neutrophilen phagosomes ist etwas alkalisch und größer als Wildtyp-Maus Neutrophile, während menschliche Neutrophilen mit DPI inkubiert haben sehr sauer und kleine phagosomes. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Balancierter Salzlösung (BSS) Puffer
NaCl 156 mM
KCl 3 mM
MgSO 4 2 mM
KH 2 PO 4 1,25 mM
CaCI2 2 mM
Glucose 10 mM
Hepes 10 mM
pH 7,4 mit NaOH oder HCl
YPD - Brühe
YPD-Brühe 50 g
Destilliertes Wasser L 1
Autoklaven bei 121 ° C für 15 min
Für YPD-Agar: Vor dem Autoklavieren 15 g / l Agar hinzufügen
10% Dextranlösung
Dextran klinischer Güte 50 g
NaCl 4,5 g
Destilliertes Wasser 500 ml
In der Glasflasche und Autoklaven bei 121 ° C für 15 min
2x Kochsalzlösung
NaCl 18 g
Destilliertes Wasser L 1
In der Glasflasche und Autoklaven bei 121 ° C für 15 min
10% Saponin Lager
BSS-Puffer 50 ml
Saponin 5 g
Wärme BSS-Puffer auf 37 ° C abgekühlt, Saponin und mischen.
Hinzufügen 0,1% Natriumazid als Konservierungsmittel, Lager Mischung bei 4 ° C.
Kalibrierpuffer
Candida Standardkurve
bildet erster 0,15 M Lager jeden Puffer
Make-up 0,15 M NaCl-Lösung
15 ml Endvolumen: 5 ml 0,15 M der gewünschten Pufferlösung + 10 ml 0,15 M NaCl-Lösung
pH 3 100 mM NaCl 50 mM Glycin
pH 4 100 mM NaCl 50 mM Acetat
pH 5 100 mM NaCl 50 mM Acetat
pH 6 100 mM NaCl 50 mM Acetat
pH 7 100 mM NaCl 50 mM Tris
pH 8 100 mM NaCl 50 mM Tris
pH 9 100 mM NaCl 50 mM Tris
pH 10 100 mM NaCl 50 mM Glycin
pH 11 100 mM NaCl 50 mM Phosphat
pH 12 100 mM NaCl 50 mM Phosphat
pH 13 100 mM NaCl 50 mM Phosphat
Cytosolic Standardkurve
Verwendung Bisher 0,15 M Stammpufferlösungen hergestellt
Make-up 0,15 M KCl-Lösung
15 ml Endvolumen: 5 ml 0,15 M erwünschten Puffer + 10 ml 0,15 M KCl-Lösung
10 mM Stammlösung von Nigericin in Ethanol, fügt 15 & mgr; l zu jeder Endvolumens Lösung
pH 3 100 mM KCl 50 mM Glycin 10 & mgr; M Nigericin
pH 4 100 mM KCl 50 mM Acetat 10 & mgr; M Nigericin
pH 5 100 mM KCl 50 mM Acetat 10 & mgr; M Nigericin
pH 6 100 mM KCl 50 mM Acetat 10 & mgr; M Nigericin
pH 7 100 mM KCl 50 mM Tris 10 & mgr; M Nigericin
pH 8 100 mM KCl 50 mM Tris 10 & mgr; M Nigericin
pH 9 100 mM KCl 50 mM Tris 10 & mgr; M Nigericin
pH 10 100 mM KCl 50 mM Glycin 10 & mgr; M Nigericin
pH 11 100 mM KCl 50 mM Phosphat 10 & mgr; M Nigericin
pH 12 100 mM KCl 50 mM Phosphat 10 & mgr; M Nigericin
pH 13 100 mM KCl 50 mM Phosphat 10 & mgr; M Nigericin
pH alle Kalibrierlösungen mit entweder HCl oder NaOH

Tabelle 1: Zusammensetzung von Puffern. Diese Tabelle beschreibt die entsprechenden Zusammensetzungen der verschiedenen Puffer in dem Protokoll verwendet.

Zusatz - Code - Datei. Diese Datei enthält eine Reihe von Makros, geschrieben von AP Levine, die für die Bildanalyse notwendig sind. Die Autoren würden uns freuen, um zu versuchen, alle Fragen bei der Verwendung dieser Code zugeordnet zu adressieren. Bitte klicken Sie hier , um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Sobald die entsprechenden Reagenzien, Mikroskop-Einstellungen und Kalibrierungsexperimente aufgebaut werden, ist dieses Verfahren relativ einfach durchzuführen. Die kritischen Schritte umfassen: Markieren des Candida mit S-1 , um sicherzustellen , dass es keine Überlastung des Farbstoffs ist, Kalibrieren, und das Bild wird analysiert.

S-1 ist ein Reagenz , um mehr alkalischen pH - Umgebungen geeignet, die für Neutrophile 21 besonders wichtig ist , sondern beschränkt seine Verwendung in bestimmten Zelltypen. Weitere sauren Umgebungen, wie beispielsweise Makrophagen Phagosomen, SNARF-4 oder S-4, ist besser geeignet wegen seiner niedrigeren pKa 22. Darüber hinaus wird für genauere Ablesungen zytoplasmatische, ist es besser zu nutzen S-4, wie die Standardkurve für S-1 zeigt , dass die Fluoreszenz - Verhältnisse Plateau unterhalb pH 6 (Figur 3) beginnen. Andere Farbstoffe, wie beispielsweise 2' , 7'-Bis- (2-Carboxyethyl) -5- (und-6) -carboxyfluorescein (BCECF) oder pHrodo Red auch geeignet in einem cont sein kannext, die sauer sein soll. Doch die Zytoplasmafärbung ist immer noch notwendig für die korrekte Identifizierung der phagosomes enthält Candida.

Ein wichtiges Merkmal eines phagosomalen pH-Indikator ist, dass es nicht irreversibel durch die reaktive phagosomalen Umgebung verändert wird. S-1 scheint die Neutrophilen Milieu resistent. Dies wird von Levine et al. 5 (siehe Ergänzungs Video 4 von Referenz 5) , welche die Phagozytose und nachfolgende Freisetzung eines S-1-markierter Candida Teilchen durch eine Hvcn1 demonstrieren - / - Neutrophilen. Wenn phagozytiert, schaltet sich das Teilchen von gelb / orange bis rot (neutralen bis alkalischen pH-Wert), jedoch, wenn das Teilchen durch die Neutrophilen freigesetzt wird, kehrt er in seine ursprüngliche Farbe.

Es ist wichtig, einige der Einschränkungen bei der Verwendung von S-1 verbunden zu erwähnen. Die Tatsache, daß dieser Farbstoff beiden Emissionsspektren ermöglicht ratiometrisch meas haturement ist ein Vorteil, aber eine spezielle Ausrüstung benötigt wird, um Bilder zu erfassen; das Mikroskop für die Experimente verwendet wird, muß zwei Bilder gleichzeitig aufnehmen kann, oder mit einer unwesentlichen Zeitverzögerung. Die Autoren gehen davon aus, dass die Forscher dieses Protokoll versucht haben Erfahrung konfokale Mikroskopie, oder haben Zugriff auf eine ausgebildete Fachkraft. Wir können nicht alle spezifischen Mikroskop Parameter auflisten, wie sie für jedes Mikroskop unterscheiden und müssen vom Forscher optimiert werden. Der Acetoxymethylester konjugiert an S-1, dass der Farbstoff in das Zytoplasma diffundieren können durch unspezifische Esterasen im Zytoplasma der Zelle abgebaut das fluoreszierende Molekül zu bilden. Esterasen, wie alkalische Phosphatase, ist in Humanserum und fötales Rinderserum, die verwendet werden, um Zellkulturmedien zu ergänzen. Dementsprechend, in dem das Medium die Zellen, die mit S-1-AM (Abschnitt 4.5) enthalten darf nicht Serum geladen werden. Dies kann eine Herausforderung sein, wenn Zellen verwendet, die eine nährstoff ric erfordernh Medium zu erhalten, sie als die ausgeglichene Salzlösung in diesem Protokoll verwendet. Ähnlich können andere fluoreszierende Mediumkomponenten, wie Phenolrot, kann mit S-1-Messungen stören.

Die Fehlerbalken in Figur 3 zeigen , dass es bei jedem pH gewissen Variation im Verhältnis von Messungen ist. Eine geeignete Anzahl von Wiederholungen jeden Experiment (mindestens n = 3) und so viele Einzelmessungen in jedem einzelnen Experiment werden die Inter-vakuolären Variation zu überwinden benötigt. Es ist daher ratsam , den pH - Wert von mindestens 100 Phagosomen für jede Bedingung und ebenso viele phagosomalen Bereichen zu messen , die nur eine Candida zu enthalten scheinen. Die Phagosomen zur Quantifizierung zu mess sollten diejenigen sein , die eine Candida Teilchen vollständig verschlungen haben (dh jene , vollständig von Zytoplasma umgeben). Zur Milderung gegen unbeabsichtigte Verzerrungen bei der Auswahl von Zellen / phagosomes zur Quantifizierung sollten alle Analysen werden durchgeführt, währendblind für die experimentellen Bedingungen.

Hier beschreiben wir die Isolierung von Neutrophilen durch Dextransedimentation von Vollblut, gefolgt von einer Zentrifugation der Plasmaschicht durch eine Dichtegradienten. Wir verwenden diese Technik, da sie schnell und effizient eine reine (> 95%) Population von Neutrophilen produziert, obwohl es auch anderen Methoden zur Verfügung, wie zum Beispiel Vollblut Zentrifugation durch andere Dichtegradienten Formeln oder negative Selektion von Neutrophilen mit einem speziellen Kits mit Antikörpern oder magnetischen Perlen. Jedoch kann diese für die meisten Gruppen unerschwinglich teuer sein, die Neutrophilen routinemäßig zu isolieren. Außerdem verwenden wir das Antikoagulans Heparin in dem Blutsammelröhrchen, während andere Forscher mehr daran gewöhnt sein können Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder Säure-Citrat-Natrium (ACD) zu verwenden. Da es viele verschiedene Methoden zur Auswahl, ist es auf die persönliche Präferenz des Forschers auf.

Außerdem,bei der Isolierung und Manipulation von Neutrophilen sie sollten mit Vorsicht behandelt werden, um übermäßige Aktivierung zu vermeiden. Vorsorgliche Schritte umfassen: nur Plastikgeschirr verwendet wird, kein Glas; Filter-Sterilisieren alle Puffer jegliche verunreinigende Endotoxin zu entfernen; beim Spinnen Neutrophilen sicherstellen, dass die Zentrifuge gut ausgewogen ist übermäßige Vibrationen zu vermeiden; so weit wie möglich begrenzt die Zeit Neutrophilen bleiben in einem Pellet nach Zentrifugation; Neutrophile nicht in Lösung von mehr als 5 x 10 6 / ml beizubehalten; und führt das Experiment so bald wie möglich nach der Isolierung.

Dieses Verfahren kann angepasst werden, um Veränderungen im pH-Wert und phagosomalen Bereich über die Zeit zu messen, indem ein beheiztes Bühnenbild bis 37 ° C auf dem Mikroskop und Schnappschüsse einmal all 30-60 s von der gleichen Position einnehmen, da für die Kalibrierungsschritte beschrieben. Es könnte theoretisch auch für höhere Durchsatzexperimente angepasst werden, wie zum Beispiel in 96-Well-Platten und für die Durchflusszytometrie Experimente, in denen S-1 kannals pH - Indikator 23 verwendet werden. Bei diesen Einstellungen wird die Betonung der individuellen Zellaktivität durch eine globale Wirkung auf die Zellpopulation ersetzt.

Dieses Verfahren zielt darauf ab, einen relativ einfachen Versuchsaufbau zur Verfügung zu stellen, auf denen einzelne Forscher anpassen können ihr Interessengebiet gerecht zu werden. Forscher wollen können Neutrophilen phagosomalen pH und Umgebung zu erkunden, während auch die Bewegung der anderen Ionen zu messen, beispielsweise die intrazelluläre Calciumkonzentration. Es gibt mehrere fluoreszierende Indikatoren Ca 2+ leicht zugänglich für die konfokale Mikroskopie, wie beispielsweise Indo-1, die auch Doppelemissionsspektren bei 400 und 475 nm 24 hat. Diese Emissionswellenlängen nicht überlappen, mit S-1-Emissionsspektren, aber die Anregungswellenlänge ist im ultravioletten (UV) Ende des Spektrums, die Zellen schädlich sein kann, und ein UV-Laser ist auf allen Mikroskopen nicht alltäglich. Eine umfassende Überprüfung der verschiedenen Indikatoren zuMessung der intrazellulären Kalziumfluss wird von Takahashi et al abgedeckt. 25 und Hillson et al. 26.

Schließlich gibt es noch andere Methoden zur Verfügung phagosomalen pH unter Verwendung verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe wie Nunes et al zu messen. 27, 28 haben 13 sowie andere Gruppen demonstriert. Andere Forscher haben ebenfalls verwendet S-1 cytosolischen pH 29 oder pH 14 phagosomalen zu messen. Jedoch ist dieses Protokoll einzigartiges gleichzeitig den pH - Wertes von sowohl Cytosol und phagosome bei der Messung, die die Möglichkeit bietet , Änderungen in phagosomalen Querschnittsfläche zu beobachten , und zwischen Wildtyp- und Hvcn1 zu unterscheiden - / - Maus Neutrophilen und menschliche Neutrophilen mit und ohne eine Arbeits NADPH-Oxidase.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde uns freundlicherweise vom Wellcome Trust, der Biotechnologie und Biologische Wissenschaften Research Council und der Irwin Joffe Memorial Fellowship finanziert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Candida albicans ATCC 10231 Vitroide  80 CFUSigma-AldrichRQC14003-10EADirekt auf eine Spread-Agar-Platte nach Herstellerangaben
legen YPD-BouillonSigma-AldrichY1375Herstellerangaben beachten, verschiedene Anbieter existieren
Dextran Klinische Qualität MW = 200.000-300.000MP Biomedicals2101514Verwenden Sie Handschuhe 
Heparin-Natrium-Infusionslösung (ohne Konservierungsstoffe), 1.000 IE/ml Fannin, Wockhardt UK LtdFP1077Wir haben von UCH stationäre Apotheke
SNARF-1 Carbonylsäure, Acetat, Succinimidylester - SpezialverpackungThermo Scientific/InvitrogenSS22801Gebrauchshandschuhe
5-(und-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethylester, AcetatThermo Scientific/InvitrogenC1272Gebrauchshandschuhe
Vivaglobin humanes IgG  160 mg/ml LösungCSL Behringals Geschenk erhaltenVerschiedene Anbieter existieren
Normales MausserumAbcamab7486Verschiedene Anbieter existieren
Lymphoprep (Density Gradient Medium)Alere Ltd1114547Steril und vor direkter Sonneneinstrahlung schützen, kann durch Ficoll-Paque
NigericinSigma-AldrichN7143Giftig, Handschuhe verwenden, verschiedene Anbieter existieren
SaponinSigma-Aldrich47036Giftig, Handschuhe verwenden, verschiedene Anbieter existieren
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma-AldrichD8418Giftig, Handschuhe verwenden, verschiedene Anbieter existieren
4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-ethansulfonsäure (HEPES)Sigma-AldrichH3375Verschiedene Anbieter existieren
Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris)Sigma-AldrichT1503 Es existieren verschiedene Anbieter
Kaliumchlorid (KCl)Sigma-AldrichP9333Verschiedene Anbieter existieren
Natriumchlorid (NaCl)Sigma-AldrichS7653Verschiedene Anbieter Magnesiumchlorid
(MgCl2)Sigma-AldrichM8266Verschiedene Anbieter Magnesiumsulfat
(MgSO4)Sigma-AldrichM7506Verschiedenes Anbieter existieren
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4)Sigma-AldrichP9791Verschiedene Anbieter existieren
Calciumchlorid (CaCl2)Sigma-AldrichC1016Verschiedene Anbieter existieren
GlukoseSigma-AldrichD9434Verschiedene Anbieter existieren
Absolutes Ethanol Sigma-Aldrich2860Es gibt verschiedene Anbieter
Diphenyleniodonium (DPI)Sigma-AldrichD2926Verschiedene Anbieter existieren
ZinkchloridSigma-Aldrich208086Verschiedene Anbieter existieren, verdünnen sich nicht in phosphatbasierten Puffern, da es
Poly-L-LysinSigmaP4707Anbieter existieren
Laserscanning konfokal Mikroskop (Zeiss LSM 700)Carl ZeissDas Mikroskop muss in der Lage sein, bei 555 nm anzuregen und die Emission bei zwei Kanälen gleichzeitig zu messen (560-600 nm, >610 nm)
Ibidi & micro slide 8 wellibiTreat ThistleScientific IB-80826Andere geeignete Bildgebungsschalen können ersetzt werden
Soniprep 150Jedes geeignete Ultraschallgerät reicht aus
TC20 Automatisierter ZellzählerBioRadVerschiedene Anbieter existieren
1,5 mL Protein LoBind TubesSigma-AldrichZ666505-100EASpeziell als Candida können an normalen eppendorfs haften
Substituiert werden ausfällt Verschiedene

Referenzen

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Schlagwörter

KonfokalmikroskopieS 1 Farbstoffphagosomaler pH Wertzytoplasmatischer pH WertNeutrophilen IsolierungCandida OpsonierungFluoreszenzbildgebungIonenfluss

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