Methodenartikel

Analyse von Cap-bindende Proteine ​​in menschlichen Zellen zu Physiologische Sauerstoffbedingungen ausgesetzt

DOI:

10.3791/55112

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28. Dezember 2016

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1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir menschliche Zellkulturprotokolle zur Analyse von Translationsinitiationsfaktoren, die die 5'-Kappe von mRNA unter physiologischen Sauerstoffbedingungen binden. Diese Methode verwendet ein Agarose-gebundenes m7GTP Kappenanalogon und eignet sich zur Untersuchung von Kappenbindungsfaktoren und deren interagierenden Partnern.

Zusammenfassung

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Translationale Kontrolle ist ein Schwerpunkt der Genregulation, insbesondere in Zeiten zellulären Stresses. Die Cap-abhängige Translation über den eIF4F-Komplex ist bei weitem der häufigste Weg, um die Proteinsynthese in eukaryotischen Zellen zu initiieren, aber jetzt zeichnen sich stressspezifische Variationen dieses Komplexes ab. Die Reinigung von Cap-bindenden Proteinen mit einem Affinitätsharz, das aus Agarose-gebundenem m7GTP (einem 5'-mRNA-Cap-Analogon) besteht, ist ein nützliches Werkzeug, um Faktoren zu identifizieren, die an der Regulation der Translationsinitiierung beteiligt sind. Hypoxie (niedriger Sauerstoffgehalt) ist ein zellulärer Stress, der während der Entwicklung des Fötus und der Tumorprogression auftritt und stark von der Translationsregulation abhängt. Darüber hinaus wurde kürzlich berichtet, dass menschliche adulte Organe einen niedrigeren Sauerstoffgehalt (Physioxie 1-9 % Sauerstoff) aufweisen, der näher an der Hypoxie liegt als die Umgebungsluft, in der Zellen routinemäßig kultiviert werden. Mit der fortschreitenden Charakterisierung eines hypoxischen eIF4F-Komplexes (eIF4FH) steigt das Interesse am Verständnis der sauerstoffabhängigen Translationsinitiierung durch die 5'-mRNA-Kappe. Wir haben kürzlich eine humane Zellkulturmethode entwickelt, um Kappenbindungsproteine zu analysieren, die durch die Sauerstoffverfügbarkeit reguliert werden. Dieses Protokoll legt den Schwerpunkt darauf, dass Zellkultur und Lyse an einem Hypoxie-Arbeitsplatz durchgeführt werden, um die Exposition gegenüber Sauerstoff zu vermeiden. Die Zellen müssen mindestens 24 Stunden lang inkubiert werden, damit sich das flüssige Medium mit der Atmosphäre am Arbeitsplatz ausgleichen kann. Um diese Einschränkung zu vermeiden, können den Zellen vorkonditionierte Medien (sauerstoffarm) zugesetzt werden, wenn kürzere Zeitpunkte erforderlich sind. Bestimmte Cap-bindende Proteine erfordern Wechselwirkungen mit einer zweiten Base oder können das m7GTP hydrolysieren, daher können einige Cap-Interaktoren im Aufreinigungsprozess übersehen werden. Agarose-gebundene bis enzymatisch resistente Kappenanaloga können in diesem Protokoll substituiert werden. Diese Methode ermöglicht es dem Anwender, neuartige sauerstoffregulierte Translationsfaktoren zu identifizieren, die an der cap-abhängigen Translation beteiligt sind.

Einleitung

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Translational Steuerung zeichnet sich als ein ebenso wichtiger Schritt , um die Transkriptionsregulation in der Genexpression, insbesondere in Zeiten der zellulären Stress 1. Ein Schwerpunkt der Translationskontrolle ist bei der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Einleitung , wo die ersten Schritte der Proteinsynthese , die Bindung des eukaryotische Initiationsfaktor 4E (eIF4E) an die 7-Methylguanosin (m 7 GTP) 5' - Cap von mRNAs beinhalten 2 . eIF4E ist Teil eines trimeren Komplex namens eIF4F die eIF4A, eine RNA - Helikase und eIF4G, ein Gerüstprotein , die für die Rekrutierung anderer Übersetzungsfaktoren und die 40S - Ribosoms 3 umfasst. Unter normalen physiologischen Bedingungen, die überwiegende Mehrheit der mRNAs über einen CAP-abhängigen Mechanismus übersetzt, aber unter Perioden der zellulären Stress etwa 10% der humanen mRNAs enthalten 5 'UTR , die cap-unabhängige Translation Initiation 1,4 ermöglichen kann. Cap-abhängige Translation ist historisch Synonymous mit eIF4F jedoch stressspezifische Varianten von eIF4F haben ein Trend - Thema geworden 5-8.

Verschiedene Zellspannungen verursachen eIF4E Aktivität über die Säugetier-Ziel von Rapamycin-Komplex 1 (mTORC1) verdrängt werden. Diese Kinase wird unter Stress beeinträchtigt, die eines seiner Ziele in der erhöhten Aktivität führt, die 4E-Bindungsprotein (4E-BP). Nicht-phosphoryliert 4E-BP bindet an eIF4E und blockiert ihre Fähigkeit , mit eIF4G wodurch die Unterdrückung von Cap-abhängige Translation 9,10 zu interagieren. Interessanterweise hat ein Homolog von eIF4E namens eIF4E2 (oder 4EHP) eine viel geringere Affinität für 4E-BP 11, vielleicht so dass es Stress-vermittelten Repression zu entziehen. Tatsächlich zunächst als Repressor der Übersetzung charakterisiert aufgrund seiner mangelnden Wechselwirkung mit eIF4G 12 initiiert eIF4E2 Übersetzung von Hunderten von mRNAs , die RNA Hypoxie - Response - Elemente in ihren 3' - UTR 6,13 während des hypoxischen Stress enthalten. Diese Aktivierung is durch Wechselwirkungen mit eIF4G3 erzielte RNA - Bindungsprotein - Motiv 4 und der Hypoxie - induzierbaren Faktor (HIF) 2α einen hypoxischen eIF4F Komplex oder eIF4F H 6,13 zu bilden. Als Repressor unter normalen Bedingungen bindet eIF4E2 mit GIGYF2 und ZNF598 14. Diese Komplexe wurden, teilweise identifiziert durch Agarose-linked m 7 GTP Affinitätsharze. Diese klassische Methode 15 ist im Bereich der Übersetzungsnorm und ist die beste und am häufigsten verwendete Technik cap-Bindungskomplexe in Zug zu isolieren , nach unten und in - vitro - Bindungsassays 16-19. Da der cap-abhängigen Translationsmaschinerie als flexibel und anpassungsfähig mit inter ändernden Teilen Schwellen 6-8,13 Dieses Verfahren ist ein leistungsfähiges Werkzeug , um schnell neue cap-Bindungsproteine in der Stressantwort beteiligt identifizieren. Weiterhin ist in Variationen eIF4F könnte weitreichende Auswirkungen haben, da mehrere eukaryotische Modellsysteme scheinen eine eIF4E2 Homolog für Stressreaktionen zu verwenden, wiewie A. thaliana 20, S. Pombe 21, D. melanogaster 22 und C. elegans 23.

Hinweise darauf , dass Variationen in eIF4F nicht streng auf Stressbedingungen beschränkt, sondern in der normalen Physiologie 24 einbezogen werden. Die Sauerstoffversorgung der Gewebe (in Kapillarenden) oder innerhalb von Geweben (via Mikroelektroden gemessen wird ) variiert von 2-6% im Gehirn 25, 3-12% der Lunge 26, 3,5-6% im Darm 27, 4% in die Leber 28, 7-12% in der Niere 29, 4% in Muskel 30 und 6-7% in dem Knochenmark 31. Zellen und Mitochondrien enthalten weniger als 1,3% Sauerstoff 32. Diese Werte sind sehr viel näher an Hypoxie als die Umgebungsluft, wo Zellen routinemßig kultiviert. Dies legt nahe, dass das, was vorher waren gedacht als Hypoxie-spezifische zelluläre Prozesse in einer physiologischen Umgebung von Bedeutung sein können. Interessanterweise eIF4F und eIF4F H aktiv an der Translationsinitiations verschiedener Pools oder Klassen von mRNAs in verschiedenen menschlichen Zelllinien teilnehmen zu physiologischen Sauerstoff ausgesetzt oder "physioxia" 24. Niedrige Sauerstoff treibt auch die richtige Entwicklung des Fötus 33 und Zellen haben in der Regel höhere Proliferationsraten, längere Lebensdauer, weniger DNA - Schäden und weniger allgemeine Stressreaktionen in physioxia 34. Daher ist eIF4F H wahrscheinlich ein wichtiger Faktor bei der Expression von ausgewählten Genen unter physiologischen Bedingungen.

Hier bieten wir ein Protokoll zur Kultivierung von Zellen in festen physiologischen Sauerstoffbedingungen oder in einem dynamischen Schwankungsbereich, die wahrscheinlich mehr repräsentativ für Gewebe-Mikroumgebungen ist. Ein Vorteil dieses Verfahrens ist, dass Zellen innerhalb der Hypoxie Workstation lysiert werden. Es ist oft nicht klar, wie der Übergang von hypoxische Zellkultur zu Zellaufschluß wird in anderen Protokollen durchgeführt. Zellen werden oft zunächst von einem kleinen Hypoxie Inkubator entfernt werdenVordergrund - Lyse, aber diese Exposition gegenüber Sauerstoff konnte biochemische Wege beeinflussen , wie die zelluläre Reaktion auf Sauerstoff schnell ist (ein oder zwei Minuten) 35. Bestimmte cap-bindende Proteine erfordern Wechselwirkungen mit einer zweiten Base oder die m 7 GTP hydrolysieren daher einige Kappe Interaktoren können in dem Reinigungsverfahren fehlen. Agarose-gebundenen enzymatisch sicheren Verschluss-Analoga können in diesem Protokoll ersetzt werden. Erforschung der Aktivität und Zusammensetzung der eIF4F H und andere Variationen von eIF4F durch das hier beschriebene Verfahren wird Licht auf die komplizierten Genexpression Maschinerien , die Zellen während der physiologischen Bedingungen oder Stressreaktionen zu nutzen.

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Protokoll

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1. Vorbereitungen für die Zellkultur

  1. Erwerben Sie kommerziell verfügbaren Bestände von menschlichen Zellen.
    Hinweis: Dieses Protokoll nutzt HCT116 kolorektalem Karzinom und primären humanen renalen proximalen Tubulusepithelzellen (HRPTEC).
  2. Make 500 ml Medium für die Kultur von HCT116: Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) / Hochglucosemedium, supplementiert mit 7,5% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin (P / S).
  3. Machen Sie 500 ml Medium für die Kultur von HRPTEC: Epithelial Zellmedium mit 5% FBS, 1% Epithelzellwachstum Ergänzung und 1% P / S.
  4. Bereiten 500 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS): 140 mM NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 15 mM KH 2 PO 4. PH-Wert auf 7,4 und Sterilisieren durch Autoklavieren für 40 min bei 121 ° C.

2. Einleitung der Zellkultur

  1. aspirieren vorsichtig das Medium von einem 80-90% konfluent Gericht ohne t störener Zellen.
  2. Aliquotieren 3-5 ml 1x PBS pro Kulturschale, schaukeln sanft jeden Kolben zur Beschichtung der Oberfläche der Schale, und sorgfältig die 1x PBS absaugen. Wiederholen Sie dies für eine zweite 1x PBS zu waschen.
  3. Aliquot 3 ml von 0,05% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in jede Kulturschale und sanft die Zellen mit Trypsin-EDTA gleichmäßig zu beschichten schaukeln. Inkubieren bei 37 ° C für 2-3 min.
  4. Übertragen Sie die abgelösten Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 4000 × g für 90 Sekunden.
  5. Resuspendieren Zellpellet in 1 ml vollständigem DMEM.
  6. Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer. Berechnen Sie, wie viele nicht-pyrogene und Polystyrol 100 mm - Schalen Zellkultur erforderlich , um eine anfängliche Aussaatdichte von etwa 2.500-5.000 Zellen pro cm 2 zu erreichen.
  7. Vorwärmen komplette Zellkulturmedium für 30-45 min in Schritten 1.2 oder 1.3 in einem 37 ° C Wasserbad gestellt.
  8. Dekontaminieren Mediumflasche und Zell Fläschchen mit 70% Ethanol. Von diesem Zeitpunkt an alleOperationen sollten aseptisch durchgeführt werden.
  9. Aliquot 6 ml komplettem DMEM in so viele 100 mm Zellkulturschalen erforderlich, um das gesamte Volumen des gefrorenen Zellen im Aussaatdichte in Schritt 2.6 erwähnt zu verwenden.
  10. Übertragen, um das Volumen der Zellsuspension berechnet in Schritt 2.6 zu jeder der 100 mm-Kulturschalen. Schaukeln Sie jede Platte manuell gleichmäßig die Zellen über die Oberfläche der Platte verteilen.
  11. Platzieren Sie die seeded 100 mm Zellkulturschale in den Inkubator bei 37 ° C in einer 5% CO 2 -Atmosphäre. Lassen Zellen mindestens 24 Stunden vor den nächsten Schritten zu brüten.

3. Subkultivierung

  1. Informieren jeder Zellkulturschale unter einem Mikroskop den Prozentsatz der Zellen Konfluenz (% Zellen mit der Fläche der Schale) zu bestimmen. Zurück Zellen in den Inkubator und vorwärmen komplettes Medium und 1x PBS. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt, wenn die Zellen 80-100% konfluent sind.
  2. aspirieren vorsichtig das verbrauchte Medium ohne die störendeZellen in jeder Kulturschale.
  3. Aliquotieren 3-5 ml 1x PBS pro Kulturschale, schaukeln sanft jeden Kolben zur Beschichtung der Oberfläche der Schale, und sorgfältig die 1x PBS absaugen. Wiederholen Sie dies für eine zweite 1x PBS zu waschen.
  4. Aliquot 3 ml 0,05% Trypsin-EDTA in jede Kulturschale und sanft schaukeln die Zellen gleichmäßig zu beschichten mit Trypsin-EDTA. Inkubieren bei 37 ° C für 2-3 min.
  5. Während dieser Inkubation aliquote 10 ml vollständigem Medium in so viele Kulturschalen erforderlich sind , um Zelldichte von 2.500-5.000 Zellen pro cm 2 erhalten.
  6. Wenn die Zellen von der Platte abgelöst, fügen Sie schnell 3 ml 1x definiert Trypsininhibitor und sanft die Schale für 1 min schwenken, um sicherzustellen, dass alle von der Trypsin-EDTA neutralisiert wurde.
  7. Übertragen Sie die abgelösten Zellen in ein steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen und beiseite stellen. 3 ml 1x PBS in die Schale jegliche verbleibenden Zellen zu sammeln und zu übertragen, die zum gleichen 15 ml Zentrifugenröhrchen.
  8. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren 150 xg5 min.
  9. Aspirieren den Überstand und Zellpellet in 3 ml vollständigem Medium.
  10. Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und Samen 150 mm Kulturschalen mit 15 ml vollständigem Medium eine Zelldichte von 2.500-5.000 Zellen pro cm 2 zu erhalten. Verwenden Sie zwei 150 mm für jede Kappe Bindungsassay.
    HINWEIS: Sauerstoffdiffusion zu den Zellen durch flüssige Medien ist abhängig von dem Volumen 36. Es wird empfohlen, das Volumen der Medien konsistent zwischen den Experimenten zu halten, ob anhaftenden Zellen oder Zellen in Suspension verwendet werden. Medien werden kann vorbehandelt (inkubiert in der Workstation für 24 Stunden wie in Diskussion besprochen), um diese Variabilitäten in Diffusion zu vermeiden.
  11. Legen Sie die geimpfte Kulturschalen im Inkubator bei 37 ° C in einer 5% CO 2 -Atmosphäre. Lassen Zellen mindestens 24 Stunden inkubiert, bevor zu den nächsten Schritten fortfahren.

4. Physioxic Exposure

  1. Sehen Sie sich die Zellen unter dem Mikroskop. BESt Ergebnisse, stellen Sie sicher, dass die Zellen sind 70-80% konfluent für eine 24-Stunden-Exposition, 50-60% konfluent für eine 48 Stunden Belichtung und 40 bis 50% konfluent für eine 72 Stunden Exposition.
  2. Platzieren Sie die Zellen in eine Hypoxie-Workstation für die gewünschte Zeit (24, 48 oder 72 Stunden je nach Experiment).
  3. Stellen Sie die Workstation an den entsprechenden physioxia.
    HINWEIS: Zum Beispiel eine 3% O 2 Einstellung von 5% CO 2 und 92% N 2 begleitet würden.
    HINWEIS: Wenn die Sauerstoffschwankungen innerhalb eines dynamischen Bereichs sind eine bestimmte Zeitleiste, programmieren Sie den Zeitplan in das Gerät gewünscht über oder manuell die Sauerstoff-Einstellungen in den gewünschten Intervallen einzustellen.
  4. Stellen Sie die Luftfeuchtigkeit auf 60%. Die Workstation Atmosphäre ist sehr trocken dennoch und Medien wird deutlich bei langen Experimenten (> 48 h) zu verdampfen. Halten Sie eine Medien Reserve in einer Zellkulturflasche in der Workstation (so, dass die Medien mit der Workstation Atmosphäre ins Gleichgewicht gebracht wird), um die Medien in der Zellkultur dis aufzufüllener ist.
    HINWEIS: Jede Lösung , die mit den Zellen vor der Lyse (wie PBS und Trypsin-EDTA) sollte vorab konditioniert für 24 h vor der Verwendung innerhalb der Hypoxie Workstation so daß der gelöste Sauerstoff mit dem Luftsauerstoff zu interagieren 36 äquilibriert.
  5. Halten Zellen innerhalb der Arbeitsstation, bis die Lyse.

5. Vorbereitung Puffer für Cap-Bindungsassay

  1. Bereiten 1x Tris-gepufferter Salzlösung (TBS).
    1. In 800 ml dH 2 O lösen sich 8,76 g NaCl und 6,05 g Tris - Base.
    2. Man bringt die Lösung auf einen endgültigen pH von 7,4 unter Verwendung von 1 M HCl.
    3. Bringen Sie das endgültige Volumen auf 1 l mit dH 2 O.
  2. Bereiten Sie nicht denaturierende Lyse-Puffer. Bereiten Sie die Lyse-Puffer, den Tag des cap-Bindungstest. Machen Sie zusätzliche Lysepuffer die leeren Agarosekügelchen und die γ-aminophenyl-m 7 GTP Agarose - C10-verknüpften Kügelchen (Schritte 7.9 und 7.13) zu waschen.
    1. In 7 ml dH 2 O, fügen Sie 160 ul 5 M NaCll, 160 & mgr; l 1 M Tris-HCl pH 7,4, 40 ul 200 mM NaF, 40 & mgr; l 1 M MgCl 2 und 40 & mgr; l 1 mM Natriumorthovanadat.
    2. In 40 ul Igepal auf die 7 ml Lösung. Schneiden Sie die Spitze der Pipette abrufen zu helfen Igepal, da es extrem zähflüssig ist.
    3. Mischen durch Pipettieren von oben und unten, oder Wirbel, die 7 ml Lösung, bis alle der Igepal aufgelöst wurde.
    4. Heben Sie das endgültige Volumen der Lösung auf 8 ml und auf Eis halten.
  3. Bereiten Sie 4x Natriumdodecylsulfat (SDS) -PAGE Probenpuffer.
    1. In einem Becherglas kombinieren 16 ml 1 M Tris-HCl pH 6,8, 12,64 ml Glycerin und 8 ml Dithiothreitol (DTT).
    2. In 3,2 g SDS und 0,16 g Bromphenolblau. Lassen Pulver zu lösen vollständig mit einem magnetischen Rührstab durch Mischen.
    3. Aliquote in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 ° C.

6. Zellyse

  1. Bereiten Sie nicht denaturierende Lyse-Puffer und auf Eis halten den Tag der the cap-Bindungstest.
  2. Vorwärmen 1x PBS und Trypsin in einem 37 ° C Wasserbad für 30 min.
  3. Aliquot 980 ul Lysepuffer in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für jede cap-Bindungsassay durchgeführt wird.
  4. Zugabe von 10 & mgr; l von 4- (2-aminoethyl) benzolsulfonyl Fluorid-Hydrochlorid und 10 & mgr; l 100x-Protease-Inhibitor-Cocktail zu den 980 & mgr; l Lysepuffer. Halten Sie sich auf dem Eis.
  5. Entsorgen Sie die Medien von jedem 150-mm-Schale in einem Abfallbehälter in der Hypoxie-Workstation.
  6. Waschen Sie die Zellen mit 3-4 ml warmem 1x PBS und entsorgen Sie die gesamte Flüssigkeit.
  7. 1 ml warmes 0,05% Trypsin-EDTA zu jeder Schale und ließ für 2 min sitzen oder bis die Zellen nicht mehr an der Platte haftete.
  8. Mit einer Pipette übertragen die Zellen einer Platte zu einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen, wie erforderlich, so daß jede Platte der Zellen auf einem separaten 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen überführt wird.
  9. Zentrifugieren Sie die 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen bei 6000 × g für 90 s to die Zellen pelletieren.
  10. Saugen Sie das Trypsin mit Hilfe einer Pipette ohne das Pellet zu stören. Wenn das Pellet gestört ist, wieder Zentrifuge die 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen bei 6000 × g für 90 Sekunden.
  11. Waschen Sie die Zellen mit warmem 1x PBS durch sanftes Pipettieren von 200 ul PBS in das Röhrchen gerade oberhalb des Pellets. Re-Zentrifuge, wenn das Pellet wird gestört.
  12. Saugen Sie das PBS, ohne das Pellet zu stören.
  13. Pipette 500 & mgr; l aus den 1 ml hergestellt Lyse-Pufferlösung auf die erste Zellpellet. Das Pellet vollständig durch Auf- und Abpipettieren.
  14. Kombinieren Sie die resuspendierten Zellen mit dem zweiten Zellpellet und resuspendieren das zweite Pellet durch Auf- und Abpipettieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Pellets wurden für jede Probe kombiniert und erneut suspendiert.
  15. Kombinieren des Lysats mit den verbleibenden 500 ul Lysepuffer in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  16. Entfernen Proben aus der Hypoxie-Workstation.
    HINWEIS: Nach dem Lysepuffer Zugabe einll nachfolgenden Schritte sind in der Umgebungsluft durchgeführt werden, da der Hypoxie-Workstation auf 37 ° C eingestellt ist und die folgenden Schritte ausgeführt werden kalt (4 ° C oder auf Eis) werden.
  17. Lyse der Zellen unter Verwendung von leichtem Rühren durch Drehen der Proben bei 4 ° C für 1,5-2 Stunden.
  18. Zentrifugation der lysierten Zellen bei 12.000 xg für 15 min bei 4 ° C um Zelltrümmer zu entfernen.
  19. Übertragen Sie das Lysat in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und verwerfen das Pellet.
  20. Reservieren ein Teil (5-10%) des Überstands als Ganzes Zelllysat Eingangssteuerung für zukünftige Western-Blot-Analyse verwendet werden.

7. Cap-Bindungsassay

  1. Für jede Probe werden 50 & mgr; l des Zuschnitts Agarosekügelchen Steuer Slurry und 50 ul der γ-aminophenyl-m 7 GTP Agarose - C10-linked Kügelchenaufschlämmung 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zu trennen. Mit einer Schere die Spitze der Pipette zu entfernen Sammlung des Wulstes Aufschlämmung zu erleichtern.
  2. Pellet die Perlen by Zentrifugieren der Aufschlämmung bei 500 xg für 30 sec.
  3. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und resuspendieren die Perlen in 500 ul TBS.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 7.2 und 7.3. Pellet die Kügelchen bei 500 g für 30 Sekunden und entfernen Sie den Überstand.
  5. Den Überstand des Lysats aus Schritt 6,19 bis 1,5 ml Mikroröhrchen, das die leeren Agarosekügelchen enthält.
    HINWEIS: Die leeren Agarosekügelchen wirken als pre-Löschschritt Proteine ​​aus dem Lysat zu entfernen, die nicht spezifisch mit der Wulst zusammenwirken.
  6. Inkubieren für 10 min bei 4 ° C unter leichtem Schütteln.
  7. Pellet die leere Agarosekügelchen von bei 500 × g für 30 Sekunden zentrifugiert.
  8. Übertragen Sie das Lysat auf die 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen , die γ-aminophenyl-m 7 GTP Agarose - C10-verknüpften Kügelchen enthält.
  9. Waschen Sie die leere Agarosekügelchen durch Resuspendieren der Kügelchen in 500 ul Lysepuffer, die Perlen der Pelletierung von 30 s bei 500 · g zentrifugiert, und Verwerfen des supernatant. Wiederholen Sie diese vier Mal für insgesamt fünf Wäschen.
  10. Resuspendieren der leeren Agarosekügelchen in 1x SDS-PAGE-Probenpuffer, und kochen Sie die Perlen für 90 Sekunden bei 95 ° C. Bei -20 ° C für zukünftige Western-Blot-Analyse zu beobachten, ob das Protein von Interesse bindet unspezifisch an dem Wulst.
  11. Inkubieren des Lysats mit den γ-aminophenyl-m 7 GTP Agarose - C10-verknüpften Kügelchen unter leichtem Schütteln für 1 h bei 4 ° C cap-Bindungsproteine zu erfassen.
  12. Pellet die γ-aminophenyl-m 7 GTP Agarose - C10-gebundene Kügelchen durch bei 500 × g für 30 Sekunden zentrifugiert. Überstand verwerfen.
  13. Waschen Sie die γ-aminophenyl-m 7 GTP Agarose - C10-verknüpften Kügelchen Schritt 7.9 wiederholen.
  14. Resuspendieren der Kügelchen in 600 & mgr; l Lysepuffer.
  15. Hinzufügen GTP zu einer Endkonzentration von 1 mM.
  16. Inkubieren der γ-aminophenyl-m 7 GTP Agarose - C10-verknüpften Kügelchen + 1 mM GTP unter leichtem Schütteln für 1 h bei 4 ° C. Anmerkung: Diesedistanziere werden Proteine , die nicht spezifisch mit m 7 GTP interagieren (dh interagieren auch mit nicht-methylierte GTP).
  17. Pellet die γ-aminophenyl-m 7 GTP Agarose - C10-gebundene Kügelchen durch bei 500 × g für 30 Sekunden zentrifugiert.
  18. Den Überstand in ein neues 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen eingewogen und 200 & mgr; l 4x SDS-PAGE-Probenpuffer (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% Bromphenolblau und 10% Glycerin). Bewahren Sie die GTP Kontrollprobe bei -20 ° C für eine spätere Western - Blot - Analyse 37. Waschen Sie die Perlen um 7,9 Schritt zu wiederholen.
  19. Resuspendieren der Kügelchen in 1x SDS-PAGE-Probenpuffer (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% Bromphenolblau und 10% Glycerin) und Kochen bei 95 ° C für 90 sec. Speichern die m 7 GTP-gebundenen Fraktion , die bei -20 ° C für zukünftige Western - Blot - Analyse 37.

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Ergebnisse

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Analyse von Cap-Bindungsfähigkeit in Reaktion auf den Sauerstoff von eIF4E und eIF4E2 in einem m 7 GTP Affinitätssäule

Die 1 und 2 Western - Blots von typischen m 7 GTP Affinitätsreinigung von zwei Haupt cap-Bindungsproteine in Reaktion auf Sauerstoff- Schwankungen in zwei humanen Zelllinien repräsentieren: primäre humane renale proximalen tubulären Epithelzellen (HRPTEC) in...

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Diskussion

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Die Analyse der Cap-bindenden Proteinen in menschlichen physiologischen Sauerstoffbedingungen ausgesetzt Zellen können für die Identifizierung von neuen Sauerstoff-regulierten Translationsinitiationsfaktoren ermöglichen. Die Affinität dieser Faktoren für die 5 'Cap der mRNA oder andere cap-assoziierte Proteine können durch die Stärke ihrer Verbindung zu m 7 GTP-gebundenen Agarosekügelchen gemessen werden. Eine Einschränkung dieser Technik ist, dass sie die cap-Bindungspotential von Proteinen nach der Lyse...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde vom Natural Sciences and Engineering Council of Canada und dem Ministerium für Forschung und Innovation von Ontario unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
γ-aminophenyl-m7GTP Agarose C10-linked beadsJena BioscienceAC-1555Agarose-linked m7GTP
100 mm KulturschaleCorning87722210-cm-Kulturschale
150 mm KulturschaleThermofisher13018315 cm Kulturschale
AEBSF HydrochloridACROS OrganicsA0356829AEBSF
Agarose BeadsJena Bioscience AC-0015Agarose-Bead-Kontrolle
Bromophenol BlueFisherBP112-25Bestandteil des SDS-PAGE-Ladepuffers
1,5 ml ZentrifugenröhrchenFroggaBio1210-00SWird zum Zentrifugieren kleiner Volumina
verwendet 15 ml Konische ZentrifugenröhrchenFisher1495970CWird bei der Kultivierung von Primärzellen
verwendet Definierter TrypsininhibitorFisherR007100DTI
DithiothreitolFisherBP172-25DTT
Epithelzellmedium (komplettes Kit)ScienCell4101Enthält Serum und Wachstumsfaktor-Ergänzungen)
GlycerinFisherBP229-1Bestandteil des SDS-PAGE-Ladepuffers
100 mM Guanosin 5'-triphosphat, 1 mlJena Bioscience272076-0251MGTP
HCT116 kolorektales KarzinomATCCCCL-247Humane Krebszelllinie
Menschliche proximale tubuläre Epithelzellen der NiereATCCPCS-400-010HRPTEC
Hyclone DMEM/High GlucoseGE Life SciencesSH30022.01Standardmedien für humane Zellkulturen
Hyclone Penicillin-Streptomycin-LösungGE Life SciencesSV30010Antibiotikakomponente von DMEM
H35 HypOxystationHypoxygenN/AHypoxie-Arbeitsplatz
Igepal CA-630MP Biomedicals2198596Reinigungsmittelkomponente des Lysepuffers
MonokaliumphosphatFisherP288-500KH2PO4
KaliumchloridFisherP217-500KCl
MagnesiumchloridFisherM33-500MgCl2
NatriumchloridFisherBP358-10NaCl
NatriumfluoridFisher5299-100NaF (Phosphatase-Inhibitor-Komponente des Lysepuffers)
DinatriumphosphatFisher5369-500Na2HPO4
Premium Grade Fetales RinderserumSeradigm1500-500FBS
Protease Inhibitor Cocktail (100x)Zellsignalisierung58715Bestandteil des Lysepuffers
NatriumdodecylsulfatFisherBP166-100SDS
NatriumorthovanadatSigma56508Na3VO4
Tris BaseFisherBP152-5Bestandteil von Puffern
0,05 % Trypsin-EDTA (1x)Life Technologies2500-067Trypsin zur Ablösung adhärenter Zellen

Referenzen

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