Introduction
Somitter er de første segmenter dannet i forlængede kropsakse i udviklingen vertebrater og er forløbere af rygsøjlen, ribben, og dermis væv, såvel som af muskel og endotelceller. Under somitogenesis, epitel somitter dannes fra unsegmented presomitic mesoderm (PSM) (revideret i reference 1). Denne proces er reguleret af "segmentering ur", som består af et netværk af oscillerende gener og proteiner, for det meste tilhører Notch signalvejen. Segmenteringen Uret består af forskellige negative feedback-loops, der muliggør pulserende produktion af Notch aktivitet inden for en enkelt celle 2 (revideret i Referencer 3. - 6.). Mens den intracellulære fremgangsmåde til oscillation er godt karakteriseret, er det stadig ukendte hvordan disse svingninger er koordinerede tværs af PSM væv. Det har for nylig vist, gennem både eksperimentelle og teoretiske undersøgelser, at disse svingninger er essential til processen med somitogenesis og at Notch-vejen spiller en afgørende rolle i processen med både segmentering og svingende genekspression 7, 8. Det har imidlertid været meget rapporteret, at Notch-receptor 1 (Notch1) og Delta-lignende ligand (Dll) -1 har statiske gradienter i PSM 9, 10, 11.
Vi antager, at Notch-afhængige svingninger af PSM segmentering ur afhænge periodisk aktivering af de vigtigste Notch pathway receptor og ligand, Notch1 og Dll1 henholdsvis på tværs af muse PSM. Konklusionerne fra tidligere undersøgelser, der er rapporteret en statisk rostralt-caudale gradient af disse proteiner skyldtes, forudser vi, at en manglende følsomhed i Immunofarvning teknikker. De var derfor ikke registrere udsving Dll1 og Notch1 lavt niveau i caudale PSM.
Vi have udtænkt en metode til mere nøje undersøge disse faktorer, der kombinerer eksperimentelle data med matematisk modellering til at forudsige en mekanisme, hvorved svingninger af proteiner af ur komponenter koordineres på tværs af PSM 12.
Det overordnede mål med denne metode er at påvise og bestemme lavt niveau, dynamisk proteinekspression i PSM og kortlægge udtrykket profiler af proteiner af interesse i henhold til ekspression af det kendte ur-gen, Lunatic frynser (Lfng). Da en cyklus af segmenteringen uret i muse embryo tager 2 h for at afslutte, er forskellige prøver kræves for at opbygge et fuldstændigt Spatiotemporal profil Dll1 og Notch1 proteinekspression under en Lfng oscillation i PSM. Vi har derfor udviklet denne protokol til at muliggøre high-throughput påvisning af lav-niveau proteinekspression i hel-mount, kontralaterale PSM eksplantater. Imidlertid kan denne teknik også være nyttigt for undersøgelser that til formål at karakterisere lavniveau protein dynamik inden for enhver embryonale væv, der kan opdeles i kontralaterale halvdele.
Protocol
Alle forsøg blev udført under projektet licens nummer 6004219 i streng overholdelse af Dyr (videnskabelige procedurer) Act of 1986, og det britiske indenrigsministerium adfærdskodekser for anvendelse af dyr til videnskabelige forsøg.
1. PSM Eksplantat Dissection
- Opnå halen væv fra fostre fremstillet ved tidsstyret parring af vildtype (CD1) mus 13. Kort fortalt, på embryonisk dag (E) 10,5, aflive den gravide donor mus i en carbondioxid kammer. Høst børhornet og læg det i 1x steril phosphatbufret saltvand (PBS) opløsning i overensstemmelse med Home Office License procedurer eller tilsvarende lokale regler. Overfør børhornet til en vævskulturskål indeholdende frisk, sterilt PBS. Udfør alle efterfølgende dissektion skridt i denne løsning.
- Under et stereomikroskop, skære tykke muskuløse membran af uterine horn hjælp krum saks og udtrække hver foster forsigtigt ved hjælp fine pincet. Pas påat sikre, at halen væv ikke beskadiges i denne proces. Brug buede sakse og fine pincet, dissekere væk fosterhinden fra hver foster, pas på ikke at beskadige embryoet.
- Bruge enten en kirurgisk nål eller krum saks til at høste halen væv af hvert embryo ved at skære embryonet posteriort for de bageste lemmer knopper.
- Balance halen væv ventrale nedad ved hjælp af både pincet og en nål. Generere par af PSM eksplantater fra hver embryoniske tail af dissekere halen væv i to halvdele langs midterlinien; udføre en blid vuggende bevægelse med en nål. Sørg for, at det neurale rør, notochord, og PSM væv ligeligt fordelt mellem de to eksplantater.
- Pipette hver kontralaterale PSM eksplantat på undersiden af en plast dyrkningsskål låg 35-mm i et lille volumen af forvarmet (37 ° C) dyrkningsmedium (DMEM-F12 + 0,1% L-glutamin erstatning suppleret med 10% føtalt kalveserum , 10 nM human bFGF, og 1% penicillin / streptomycin). <li> Sæt fadet på toppen af låget og hurtigt vende det, så PSM væv er suspenderet fra låget i en "hængende dråbe" medie. Kultur PSM eksplantater i et fugtigt kammer ved 37 ° C til 1 - 2 timer.
- Overfør par af PSM eksplantater til de enkelte brønde i en 24-brønds vævskulturplade. Der inkuberes i 4% paraformaldehyd i PBS i 1 time ved stuetemperatur (RT) eller 4 ° C natten over (O / N). ADVARSEL: Paraformaldehyd er giftigt, og der skal træffes passende sikkerhedsforanstaltninger, når du arbejder med denne løsning.
BEMÆRK: Udfør alle efterfølgende vaske- og inkubationstrin i en 24-brønds vævskulturplade. - Vask prøvebrønde i PBS ved RT på en rokkende platform, med en fin plastik Pasteur pipette til at udveksle PBS løsning på prøverne til frisk PBS 3 - 4 gange. Behandle en PSM eksplantation fra hvert par under anvendelse af immunhistokemi (trin 2) og den anden under anvendelse af fluorescerende in situ-hybridisering til et kendt ur-gen (step 3).
2. Immunhistokemi af PSM Eksplantater
- Vaske PSM eksplantation fra hver embryonale par er frembragt i trin 1 i 2% Triton X-100 i PBS i 1 time ved stuetemperatur på en vippende platform, og derefter skylles prøverne kortvarigt i PBS. Erstatte PBS på prøverne med blokerende opløsning (2% bovint serumalbumin (BSA) og 10% normalt gedeserum (NGS) i PBS + 0,1% Tween-20) og inkuber O / N ved 4 ° C på en vippeplatform.
BEMÆRK: Alle efterfølgende vaske og inkubation trinene i dette afsnit skal udføres ved RT på en rokkende platform, medmindre andet er angivet. Vask løsninger kan nemt ændres ved hjælp en spids plast eller glas Pasteur pipette. - Fortynd de ønskede primære antistof / antistoffer i funktionsdygtig puffer (0,1% BSA, 0,3% NGS og 0,2% Triton X-100 i PBS). I dette eksempel fortynde Dll1 og Notch1 antistoffer 1:25 i arbejde buffer.
BEMÆRK: Optimering vil være forpligtet til at bestemme den passende fortyndingsfaktor kræves i this trin, hvis der anvendes alternative antistoffer. - Inkubér eksplantater i antistofopløsningen i 3 - 5 dage ved 4 ° C på en vippeplatform. Vær sikker på at inkludere nogle prøver med arbejde buffer indeholdende ingen primære antistof til at fungere som sekundære antistof kontroller.
- Inddrive det primære antistof opløsning i en 1,5-ml opbevaringsrøret anvendelse af en pipette og opbevare det ved 4 ° C.
BEMÆRK: Udvundet primære antistof kan bruges flere gange, afhængigt af den anvendte antistof. - Udfør 2 vaske af prøverne i 5 - 10 min hver i PBS, efterfulgt af 3 vaske i 10 minutter hver i 2% Triton X-100 i PBS ved stuetemperatur på en vippende platform.
- Fortynd fluorescensmærkede sekundære antistof / antistoffer (epitop-matchede til det primære antistof / brugt antistoffer) i funktionsdygtig puffer. Eventuelt tilsættes 20 ug / ml Hoechst 33342 til denne opløsning for at modfarve kernerne.
BEMÆRK: Optimering kan være nødvendigt at fastsætte en passende fortyndingsfaktor kræves i dette trin. I denne eKSEMPEL, en fortyndingsfaktor på 1: 400 blev typisk anvendt. - Centrifugeres det sekundære antistof opløsning i 10 minutter ved 16 x g for at forhindre dannelsen af antistof-aggregater. Tilføj 250 - 500 uL af det sekundære antistof løsning til hver prøve godt, pas på ikke at bruge de sidste par mikroliter af den løsning, som kan indeholde antistof aggregater.
- Dæk prøvepladen med tin folie for at minimere lyseksponering og inkuber prøverne i det sekundære antistof opløsning i 3 - 5 dage ved 4 ° C i mørke.
- Før prøve montage, vaskes prøverne to gange for hver 10 minutter i 0,1% Tween-20 i PBS (PBST) og en gang i 5 min i PBS ved stuetemperatur på en vippende platform (se trin 4).
3. Fluorescerende in situ-hybridisering (FISH) af PSM Eksplantater
- Hvis den opbevares i en alternativ beholder, overfører de resterende kontralaterale PSM eksplantater til de enkelte brønde i en 24-brønds vævskulturplade.
- Vask prøverne for10 min i 50% ethanol i PBST, og derefter udføre 2 gange vask i 10 min hver i 100% ethanol på en vippende platform ved RT for at dehydrere vævet.
BEMÆRK: Alle efterfølgende vaske og inkubation trinene i dette afsnit skal udføres ved RT på en rokkende platform, medmindre andet er angivet. - Rehydrere vævet ved vask i 10 minutter i 50% ethanol i PBST, efterfulgt af vask to gange i 5 min hver i PBST.
BEMÆRK: Trin 3.2 og 3.3 er nødvendige fiksering trin, der kræves for denne protokol og kan ikke udelades. - Inkuber prøverne med 10 ug / ml proteinase K i 0,1% Tween-20 i PBS (PBST) i 5 min uden omrøring. Hurtigt at fjerne proteinase K og skyl prøverne kortvarigt med PBST før post-fastsættelse vævet i 30 minutter i 4% formaldehyd + 0,1% glutaraldehyd i PBST. ADVARSEL: Både formaldehyd og glutaraldehyd er giftige, og der skal træffes passende sikkerhedsforanstaltninger ved arbejde med disse løsninger.
BEMÆRK: Følgende vaskog inkubationstrin involverer 50% og 100% hybridiserings- blandinger (trin 3.6 - 3.9) bør udføres uden omrøring. - Efter vask af prøverne to gange i 10 min hver i PBST, vaske prøverne én gang i 50% hybridiseringsblanding (egnet til intron prober: 50% formamid, 5x saltvand-natriumcitrat (SSC), 5 mM EDTA, 50 ug / ml tRNA, 0,2% Tween-20, 0,1% SDS og 100 ug / ml heparin) i PBST fremstillet ved stuetemperatur. Inkuber prøverne i denne opløsning i 10 minutter ved 65 ° C uden omrøring.
- Skyl prøverne to gange med forvarmet (65 ° C) hybridiseringsblanding før inkubering af prøverne i hybridiseringsblanding i ≥ 2 timer (op til 48 timer) ved 65 ° C (længere inkubationstider forbedre det resulterende signal-til-støj kontrast) . Fjern hybridiseringsblandingen fra det foregående trin, og erstatte det med 0,25 - 0,5 mL af forvarmet (65 ° C) hybridiseringsblanding indeholdende en digoxigenin (DIG) -mærkede anti-sense-RNA-probe mod en kendt segmentering ur komponent.
IKKEE: For eksempel blev et intronisk Lunatic frynser (Lfng (i)) probe anvendes i en koncentration på 20 uL / mL til påvisning spirende Lfng mRNA. Fortyndingen anvendes i dette trin er probe-afhængige og vil kræve optimering. - Forsegl pladen ved hjælp af tape for at forhindre fordampning og inkuberes prøverne i sonden løsning for to nætter på 65 ° C.
- Ved hjælp af en spids plastik Pasteur pipette, genoprette sonden til genbrug og gemme det ved 20 ° C. Skyl prøverne to gange med forvarmet (65 ° C) post-hybridiseringsblanding (50% formamid, 0,2% Tween-20, og 1 x SSC) før vask prøverne to gange mere i 20 min hver ved 65 ° C i præ- varmet post-hybridiseringsblanding.
- Vask prøverne i 15 minutter ved 65 ° C i forvarmet 50% hybridiseringsblanding i 0,1% Tween-20 i Tris-pufret saltopløsning (TBST). Skyl prøverne to gange med TBST før vask i 30 minutter ved RT i TBST på en vuggende platform.
- Præinkuberes eksplantaterne i blocking opløsning (TBST + 2% blokeringspuffer reagens (BBR) + 20% varmebehandlet gedeserum) i mindst 2 timer. Erstat denne opløsning med frisk blokerende opløsning indeholdende en 1: 200 fortynding af peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret anti-digoxigenin antistof. Inkuber prøverne O / N ved 4 ° C.
- Efter antistoffet inkubation skylles prøverne 3 gange med TBST ved stuetemperatur og overføre dem til individuelle brønde i en ny 24-brønds vævskulturplade. Vask eksplantaterne med TBST 3 gange i 1 time hver.
- På dette tidspunkt overføres prøverne til 0,5-ml storage rør eller de individuelle brønde i en 48-brønds vævskulturplade for at reducere det påkrævede volumen af de Tyramide signalforstærkning (TSA) påvisningsreagenser i de følgende trin.
- Inkuber prøver i TSA amplificeringsbuffer (se listen reagenser) ved stuetemperatur i 1 min uden omrøring under anvendelse af så lille et volumen som muligt og sikre, at prøverne er fuldt nedsænket i opløsningen.
- Tilføj TSA reagens (sereagenser liste) til prøven amplifikation buffer ved en fortynding på 1:50. Hurtigt blande opløsningen indtil TSA reagens er jævnt fordelt, dækker pladen eller rør i tin folie, og inkuber prøverne i 60 - 90 minutter i mørke.
- Fjern TSA amplifikation opløsning og vaske prøverne i TBST 3 gange i 5 min hver. Overfør eksplantaterne tilbage til en 24-brønds vævskulturplade at øge vaskevolumen og inkuber prøverne i 1% hydrogenperoxid i TBST i 1 time. Vask prøverne med TBST 3 gange i 5 minutter hver, og derefter to gange i 5 min hver med PBST før prøve montering (se trin 4).
4. Prøve Forberedelse til Imaging
- Der forberedes en opladet vedhæftning glasplade til hvert eksplantat par ved tilsætning 0,12 mm tykke imaging afstandsklodser, som forhindrer prøverne ikke fanges af tilsætning af et dækglas. Fjern den klæbende liner fra den ene overflade af et afstandsstykke og placere den klæbende side nedad på en glasplade, presning firmly at forsegle afstandsstykket til objektglasset.
BEMÆRK: For de resterende trin, bestræbe sig på at holde prøverne i svagt lys eller i mørke for at undgå fotoblegning. Pipette eksplantatpartikler par onto et forberedt objektglas ved anvendelse af en glas Pasteur-pipette i centrum af afstandsstykket, der sikrer, at det dissekerede side af eksplantatet vender mod objektglasset. Arrangere kontralaterale par af eksplantater side om side. - Fjern så meget væske som muligt fra slide ved hjælp af et glas Pasteur pipette og væge off enhver resterende fugt omkring prøverne ved hjælp af et stykke foldet næsten fnugfri silkepapir.
- Lad prøverne at holde sig til slide i 45 - 60 s, indtil vævet begynder at dukke klæbrig og gennemskinnelige. I løbet af denne tid, fjernes den resterende klæbende liner fra spaceren med en pincet. Lad ikke prøverne til at tørre ud.
- Tilføj en stor dråbe dobbelt funktion mountant og clearing-opløsning (0,5% p-phenylendiamin og 20 mM Tris, pH 8,8, i 90% glycerol) til prøverne i centrumaf spaceren. BEMÆRK: Denne løsning bliver brun / sort, når lov til at oxidere.
- Placer forsigtigt en cirkulær dækglas (nr. 1.5) på tværs prøverne, der sikrer at mountant fordeles jævnt, og at alle kanter af dækglasset kontakt med afstandsstykket. Placer cover-gled glide op og ned på nogle lav-lint silkepapir.
- Tryk godt ned for at sikre, at dækglasset fuldt klæber til spacer, og at enhver overskydende mountant fjernes. Gentag, indtil der ikke mere mountant blots på papir.
- Ren og mærke dias (e) passende, og gemme dem i mørke, indtil billedbehandling, kortsigtet ved -20 ° C eller lang sigt ved -80 ° C. Efter fjernelse af dias fra opbevaring, give dem mulighed for fuldt ud at tø før billeddannelse.
- Billede de monterede prøver ved hjælp af en konfokal mikroskop med flisebelagt erhvervelse og en stor forstørrelse mål. Billede eksplantatet par ved hjælp af en 40X nedsænkning olie målsætning ved 4-um z-intervaller ved hjælp af 488-nm, 568 nm og 647 nm laser lines at vække de grønne, røde, og langt-røde fluoroforer, henholdsvis ansat til protein og mRNA detektion i denne undersøgelse 12.
BEMÆRK: Flisebelagt billeder blev syet efter købet for at danne et enkelt billede til analyse.
5. Post-erhvervelse billedanalyse
- Brug billedanalyse software til at definere et område af interesse inden for PSM af hver eksperimentel prøve.
- For at kvantificere ekspressionsniveauer, trække baggrund og tærskelværdierne billeder til niveauet for en ikke-primær kontrolprøve inden efterfølgende kvantificering. Definer en oprindelse, en akse, og en enhed længde for hver prøve.
- Beregn fluorescensintensitet som en funktion af position langs den normaliserede Rostro-caudale akse for hver af de M sampler 12. Efter normalisering af intensitet plots, placere intensitetsprofiler siden af hinanden og opnå en intensitet matrix f (i, j), som beskriver den intensitet ved i
6. Temporal Bestilling af prøver
- At udlede tidsmæssig bestilling af en kendt ur komponent, definere sin intensitet matrix. Derefter omarrangere kolonner af intensiteten matricen for således at opnå et tidsmæssigt periodisk mønster. For at gøre dette, definere funktionen
hvor A (f j; k) repræsenterer autokorrelationsfunktionen af j'te søjle af f og A T er et mål autokorrelationsfunktion, valgt at håndhæve den tidsmæssige periodicitet på det mønster, givet ved
- Brug Metropolis-Hastings (eller en anden minimering algoritme) 12 for at identificere rækkefølgen af prøverne, der minimerer funktionen g. Således bestemme rækkefølgen afM sampler, der maksimerer den tidsmæssige hyppighed af en kendt ur komponent.
- Brug af udledte tidsmæssige bestilling af M prøverne, konstruere en ordnet kymograph til ekspression mønster i partner med kanal 12.
Representative Results
Denne protokol tillader visualisering af Spatiotemporal profil af et protein af interesse sammen ur gentranskription i muse PSM 12. For eksempel er Dll1 (Figur 1A-C) og Notch1 (figur 1D-F) proteinekspression vist sig at oscillere ud af takt med den spirende transkription af Notch-regulerede segmentering clock gen Lfng. Kvantificering af Dll1, Notch1, og Lfng (i) signalintensitet i forhold til antero-posterior (AP) akse i PSM (figur 1G) afslører klare oscillerende ekspressionssystemer dynamik for disse mål (figur 1 H-J). Den Spatiotemporal profil Dll1 og Notch1 proteinekspression hele taktcyklus er klart visualiseres og kvantificeres ved hjælp af denne protokol gennem post-erhvervelse billedanalyse af høj opløsning faste billeddata væv.
Figur 1: Spatio-tidsmæssig Visualisering og Kvantificering af Dll1 og Notch1 Protein Expression Dynamics. (AF) Par af eksplantater fra seks E10.5 embryoer (AF) viser den rumlige fordeling af Dll1 protein (AC) eller Notch1 protein (DF) i den ene halvdel langs påvisning af Lfng præ-mRNA (Lfng (i)) i tilsvarende kontralaterale halvdel af hvert par. Paneler er ordnet efter fase 1 (A og D), fase 2 (B og E), og fase 3 (C og F) af segmentering taktcyklus, som bestemt ved den rumlige profil Lfng (i) ekspression. Omfanget af udtrykket domæner for Dll1 (grøn), Notch1 (rød), og Lfng (i) (grå) langs antero-posteriore akse PSM har Been afgrænset af farvekodede stænger. De stiplede linier afgrænse positionerne af det senest dannede somit (er), de ydre kanter af PSM, og det tilstødende neuralt væv (C og E). Scale barer (nederst til venstre i hvert panel, AF) repræsenterer 100 um. (G) Et eksempel intensitet plot afbilder den aksiale variation i signalintensitet på tværs af PSM. Dataene plottes fra to eksplantatpartikler par viser Lfng præ-mRNA (sort hash'et linje) i ét eksplantat sammenlignet med Notch1 protein (rød) i den kontralaterale eksplantatet (Embryo 1), samt Lfng præ-mRNA (sort optrukket linje) i anden eksplantat sammenlignet med Dll1 protein (grøn) i den kontralaterale eksplantatet (Embryo 2). Målt signalintensitet (y-akse) er afbildet mod aksial position (x-aksen; anterior PSM [A] til højre og bageste PSM [P] til venstre). (H) En kymograph viser den rumlige fordeling af Dll1, Notch1, og Lfng (i) på tværsmange PSM'er. Hver række af kymograph repræsenterer signalintensiteten af en individuel PSM eksplantation. Rækker er anbragt i tidsmæssig sekvens ifølge den spatiotemporale fordeling af Lfng præ-mRNA (I) Spatiotemporal fordeling af Dll1, Notch1, og Lfng (i) gennem flere clock svingninger simuleres ved den periodiske udvidelse af dataene vist i (H) , fremhæver oscillerende natur Dll1 og Notch1 udtryk dynamik. (J) Pulserende Notch1 proteinekspression i den kaudale PSM er fremhævet af forstørrelse af regionen afgrænset i den virtuelle kymograph vist i (I). Modificeret fra reference 12. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Kvantificering af Spatio-tidsmæssige Dynamics of Dll1 og Notch1 Protein Expression. (A) Et eksempel intensitet plot viser aksiale variation i signalintensitet på tværs af PSM. Afbildede data fra to eksplantatpartikler par viser Lfng præ-mRNA (sort hash'et linje) i ét eksplantat sammenlignet med Notch1 protein (rød) i den kontralaterale eksplantat halvdel, samt Lfng præ-mRNA (sort optrukket linje) i en halv eksplantat fra en anden hale sammenlignet med Dll1 protein (grøn) i den kontralaterale eksplantat halvdel af den anden hale. Målte intensiteter (y-akse) er afbildet mod aksial position (x-aksen; rostralt [A] til højre og kaudale [P] til venstre). (BH) Kymographs viser den rumlige fordeling af Notch1, Dll1, NiCd, og Lfng (i) på tværs talrige PSM'er. (B og C) NiCd (B) og Dll1 (C) ekspression i PSM sektioner; (D og E) Lfng (i) (D) og Dll1 (<strong> E) i kontralaterale eksplantatpartikler halvdele; (F og G) Lfng (i) (F) og Notch1 (G) i kontralaterale eksplantatpartikler halvdele. Fra reference 12. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Kritiske trin i protokollen
Den nuværende protokol beskriver en følsom metode til at udføre kvantitativ analyse af lav-niveau protein udtryk og oscillerende dynamik i E10.5 mus PSM eksplantater. En robust protokol for både immunhistokemi og fluorescerende in situ hybridisering (FISH) er efterfulgt af høj opløsning hel-mount konfokal billeddannelse, og derefter ved billedanalyse og tidsmæssige segmentering af kymographs at generere en spatiotemporale kort over proteinekspression tværs af PSM. Et højt signal-til-støj-forhold i protein og mRNA detektion er afgørende for at sikre succes for denne teknik. Der skal udvises omhu for at grundigt udveksle alle løsninger effektivt i de vasketrin og til at holde temperaturen af de 65 ° C vask i de relevante faser af trin 3. Det er mest fordelagtigt at tage sig tid til at kilde effektive antistoffer og RNA-prober mod mål af interesse, og at teste disse reagensergrundigt på hele-mount prøver forud for starter denne protokol.
Ændringer og fejlfinding
De vigtigste problemer, der kan opstå, når du udfører denne protokol skyldes dårligt signal afsløring styrke og kvalitet. Dette afhænger i høj grad af effektiviteten af de antistoffer eller RNA-prober anvendes til immunhistokemi eller fisk trin i protokollen, hhv. Et antal forskellige trin kan kræve optimering, før der opnås tilstrækkelig detekteringssignal. En almindelig årsag til dårlig detektion signal er forkert fiksering; Det er bydende nødvendigt, at enten friske PFA eller PFA opbevares ved 4 ° C i ikke mere end en uge bruges til at fastsætte prøverne. Længden af fiksering kan også kræve optimering, afhængigt af antistoffet eller RNA-probe anvendt. For antistoffer, anbefales det at følge producentens anvisninger om muligt, mens det for RNA-prober, vi rådgive høring af den offentliggjorte litteratur.
Lfng. På grund af sin relative mangel på overflod, påvisning af Lfng præ-mRNA kræver en lang periode med inkubation med sonden i hybridiseringsblanding indeholdende 5x saltvand-natriumcitrat (SSC) for godt signal detektion. De samme betingelser kan gælde for andre sonder, der registrerer svagt udtrykte mRNA'er, men vores erfaring, kan påvisning af mere stabile mRNA-mål kræver en kortere probehybridisering trin og lavere SSC koncentrationer i hybridisering mix (f.eks 1,3x SSC). For både immunhistokemi og fisk, skal protokollen først optimeres på hele embryoner, og den optimale koncentration af antistof eller proben skal bestemmes empirisk.
Begrænsninger af teknikken
Som nævnt ovenfor succesen af denne teknik er stærkt afhængig af kvaliteten af proteinet og mRNA-detektion. We har skitseret en række forslag til, hvordan protein og mRNA detektion kan forbedres, men i mangel af høj kvalitet fluorescerende signal detektion, er der ingen måde eksperimentet kan fortsætte. Antallet af proteinmål der kan analyseres i hver vævsprøve er begrænset af den spektrale opløsning af det konfokale mikroskop og ved epitoperne af de anvendte antistoffer. I denne undersøgelse, var vi i stand til at bruge op til tre epitoper for protein detektion sammen med en DNA-plet på hver prøve 12. Denne protokol tillader kun påvisningen af en mRNA target Selv om de nuværende alternative metoder kunne anvendes til at øge dette til op til tre mål 14.
Betydningen af Teknik med Respekt for eksisterende / Alternative Metoder
Den her beskrevne metode giver en følsom teknik til at opdage protein udsving lavt niveau i hele-mount PSM-eksplantater. Den kvantificering af disse dynamikker ermuligt ved at udføre FISH for et kendt ur-gen i tilsvarende kontralaterale eksplantater. Et bibliotek af kymographs genereres der kan organiseres over en segmentering taktcyklus, fremhæve de spatiotemporale udtryk dynamikken i et mål af interesse inden for denne tidsramme. En afgørende forskel i denne teknik frem for andre er brugen af beregningsmæssige automatisering til tidsmæssigt bestille store datasæt, som tillader spatiotemporale udtryk dynamik nye ur komponenter, der skal analyseres i en saglig måde. For eksempel denne teknik forudsat indsigt i, hvordan Dll1 og Notch1 proteiner og deres svingninger er co-reguleret over hele PSM. Alternative metoder i denne sammenhæng har også påberåbt immunfarvning, men de havde ikke registrere de små udsving i Dll1 og Notch1 protein niveauer i caudale PSM, der var tydeligt ved hjælp af denne metode. I stedet er de rapporterede en stabil gradient af udtryk, der er stærkest i rostrale område 9
Fremtidige Programmer eller vejvisning efter Mastering Teknik
Når denne protokol er blevet beherskes, kan high-throughput ekspressionsanalyse udføres for ethvert protein af interesse i PSM.PSM eksplantater genereret fra flere mus kuld kan behandles på en gang for at generere det høje antal stikprøver nødvendigt, til analyse. Selvom vi kun har brugt vildtype embryoner i disse studier, er det muligt at udføre denne analyse ved anvendelse af genetisk modificerede embryoner for at vurdere vigtigheden af en eller flere faktorer på proteinekspressionsplasmider dynamik. Ud over PSM, kan denne protokol tilpasses til andre systemer, der er sammensat af to kontralaterale halvdele og kan anvendes til følsomt detektere lavniveau proteinekspression og oscillerende dynamik. Et eksempel for hvilke denne protokol kan tilpasses er studiet af dynamiske proteinekspression i muse neuralrøret, eftersom kontralaterale halvdele kunne genereres og dyrkes, og Notch-aktivitet er blevet vist at være både nuværende og vigtige for mønsterdannelse 15. Vi opfordrer andre grupper til at tilpasse denne protokol til andre systemer, og for at give feedback til fremtidige forbedringer.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en MRC studentship til RAB, en MRC studentship til CSLB, og en WT projekt tilskud til JKD (WT089357MA). Arbejdet blev også støttet af en Welcome Trust Strategisk award (097.945 / Z / 11 / Z). Vi takker Dr. E. Kremmer for den slags gave Dll1 antistof og Dr. O. Pourquie for Lfng RNA-probe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12 | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 11320033 | |
| GlutaMAX™-1 (100x) | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 35050 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10270106 | |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140122 | |
| anti-mouse monoclonal Notch1 antibody^ | BD Pharmingen | 552466 | |
| anti-rat polyclonal Dll1 antibody^* | N/A | N/A | |
| Lfng intronic anti-sense RNA probe^* | N/A | N/A | |
| 16% paraformaldehyde | Pierce (ThermoFischer Scientific) | PI28908 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche (Sigma-Aldrich) | 31158 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Made in house | N/A | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Normal goat serum (NGS) (heat-treated) | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 16210072 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFischer Scientific | H3570 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 46139 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Saline-sodium citrate (SSC) | Sigma-Aldrich | 93017 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | |
| tRNA | Roche (Sigma-Aldrich) | 101095 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Tris-buffered saline (TBS) | Made in house | N/A | |
| Blocking Buffer Reagent | Roche (Sigma-Aldrich) | 11096176001 | |
| anti-DIG horseradish peroxidase (HRP) conjugated antibody | Roche (Sigma-Aldrich) | 11207733910 | |
| Tyramide signal amplification (TSA) kit | Perkin Elmer | NEL744001KT | |
| *The Dll1 antibody and RNA probe used in this study are not commercially available. Please see acknowledgements for sources. | |||
| ^Antibodies/RNA probes should be sourced which are applicable to the research interests of the reader. | |||
References
- Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock. Development. 139 (4), Cambridge, England. 625-639 (2012).
- Krol, A. J., Roellig, D., et al. Evolutionary plasticity of segmentation clock networks. Development. 138 (13), Cambridge, England. 2783-2792 (2011).
- Dequéant, M. -L., Ahnert, S., et al. Comparison of Pattern Detection Methods in Microarray Time Series of the Segmentation Clock. PLoS ONE. 3 (8), 2856 (2008).
- Bailey, C., Dale, K. Somitogenesis in Vertebrate Development. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester, UK. 1-15 (2015).
- Maroto, M., Bone, R. A., Somitogenesis Dale, J. K. Somitogenesis. Development. 139 (14), Cambridge, England. 2453-2456 (2012).
- Kageyama, R., Masamizu, Y., Niwa, Y. Oscillator mechanism of notch pathway in the segmentation clock. Developmental Dynamics. 236 (6), 1403-1409 (2007).
- Ferjentsik, Z., Hayashi, S., et al. Notch Is a Critical Component of the Mouse Somitogenesis Oscillator and Is Essential for the Formation of the Somites. PLoS Genetics. 5 (9), 1000662 (2009).
- Wiedermann, G., Bone, R. A., Silva, J. C., Bjorklund, M., Murray, P. J., Dale, J. K. A balance of positive and negative regulators determines the pace of the segmentation clock. eLife. 4, 05842 (2015).
- Chapman, G., Sparrow, D. B., Kremmer, E., Dunwoodie, S. L. Notch inhibition by the ligand DELTA-LIKE 3 defines the mechanism of abnormal vertebral segmentation in spondylocostal dysostosis. Human Molecular Genetics. 20 (5), 905-916 (2011).
- Sparrow, D. B., Chapman, G., et al. A Mechanism for Gene-Environment Interaction in the Etiology of Congenital Scoliosis. Cell. 149 (2), 295-306 (2012).
- Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nature communications. 3, 1141 (2012).
- Bone, R. A., Bailey, C. S. L., et al. Spatiotemporal oscillations of Notch1, Dll1 and NICD are coordinated across the mouse PSM. Development. 141 (24), Cambridge, England. 4806-4816 (2014).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), 160 (2007).
- Denkers, N., García-Villalba, P., Rodesch, C. K., Nielson, K. R., Mauch, T. J. FISHing for chick genes: Triple-label whole-mount fluorescence in situ hybridization detects simultaneous and overlapping gene expression in avian embryos. Developmental Dynamics. 229 (3), 651-657 (2004).
- Stasiulewicz, M., Gray, S. D., et al. A conserved role for Notch signaling in priming the cellular response to Shh through ciliary localisation of the key Shh transducer Smo. Development. 142 (13), Cambridge, England. 2291-2303 (2015).
