Introduction
Somites डर्मिस ऊतक, साथ ही मांसपेशियों और endothelial कोशिकाओं के हड्डीवाला प्रजातियों को विकसित करने में elongating शरीर अक्ष में गठित पहली क्षेत्रों रहे हैं और रीढ़ की हड्डी, पसलियों के पूर्ववर्ती हैं, और। somitogenesis के दौरान उपकला somites अनुभाग-रहित presomitic mesoderm (पी एस एम) (संदर्भ 1 में समीक्षा) से के रूप में। इस प्रक्रिया oscillatory जीन और प्रोटीन के एक नेटवर्क के होते हैं, जो ज्यादातर पायदान संकेतन मार्ग से संबंधित "विभाजन घड़ी," द्वारा नियंत्रित किया जाता है। (संदर्भ में समीक्षा की 3 - 6) विभाजन घड़ी विभिन्न नकारात्मक प्रतिक्रिया छोरों है, जो एक एकल कोशिका के भीतर 2 पायदान गतिविधि के गुणवाला उत्पादन में सक्षम होते हैं। दोलन के intracellular विधि अच्छी तरह से होती है, यह अभी भी काफी हद तक अनजान कैसे इन दोलनों पी एस एम ऊतक भर में समन्वय कर रहे है। यह हाल ही में दिखाया गया है, प्रायोगिक और सैद्धांतिक दोनों अध्ययन के माध्यम से, कि इन दोलनों आवश्यक तत्व हैंपायदान मार्ग somitogenesis की प्रक्रिया के लिए और कहा कि एल दोनों विभाजन और oscillatory जीन अभिव्यक्ति 7, 8 की प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हालांकि, यह व्यापक रूप से है कि पायदान रिसेप्टर 1 (Notch1) और सूचित किया गया है डेल्टा-तरह ligand (DLL) -1 पी एस एम 9, 10, 11 में स्थिर ढ़ाल है।
हम धारणा है कि पी एस एम विभाजन घड़ी की पायदान पर निर्भर दोलनों मुख्य मार्ग पायदान रिसेप्टर और ligand, Notch1 और Dll1, की आवधिक सक्रियण पर निर्भर क्रमश: माउस पी एस एम के पार। पिछले अध्ययनों का निष्कर्ष है कि इन प्रोटीनों की एक स्थिर व्याख्यान चबूतरे वाला दुम ढाल सूचना कारण थे, हम immunostaining तकनीक में संवेदनशीलता की कमी की भविष्यवाणी। वे इसलिए दुम पी एस एम में Dll1 और Notch1 के निम्न स्तर के उतार-चढ़ाव का पता लगाने में असमर्थ थे।
हमारे पासई एक विधि तैयार और अधिक बारीकी से इन कारकों की जांच करने, गणितीय मॉडलिंग के साथ प्रयोगात्मक डेटा के संयोजन एक व्यवस्था है जिसके द्वारा घड़ी घटकों के प्रोटीन के दोलनों पी एस एम 12 के पार समन्वय कर रहे हैं भविष्यवाणी करने के लिए।
इस विधि के समग्र लक्ष्य का पता लगाने और पी एस एम में निम्न स्तर के, गतिशील प्रोटीन अभिव्यक्ति यों और ज्ञात घड़ी जीन की अभिव्यक्ति के अनुसार ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल नक्शा करने के लिए है, पागल फ्रिंज (Lfng)। चूंकि माउस भ्रूण में विभाजन घड़ी का एक चक्र पूरा करने के लिए 2 घंटे लगते हैं, विभिन्न नमूनों पी एस एम में एक Lfng दोलन के दौरान Dll1 और Notch1 प्रोटीन अभिव्यक्ति का एक पूरा spatiotemporal प्रोफ़ाइल बनाने के लिए आवश्यक हैं। हम इस प्रकार पूरे माउंट में निम्न स्तर के प्रोटीन अभिव्यक्ति, contralateral पी एस एम explants की उच्च throughput का पता लगाने के लिए अनुमति देने के लिए इस प्रोटोकॉल विकसित किया है। हालांकि, इस तकनीक को भी पढ़ाई के टी के लिए उपयोगी हो सकता हैटोपी किसी भी भ्रूण ऊतक कि contralateral हिस्सों में विभाजित किया जा सकता भीतर निम्न स्तर प्रोटीन गतिशीलता को चिह्नित करने का लक्ष्य है।
Protocol
सभी प्रयोगों पशु (वैज्ञानिक प्रक्रिया) 1986 के अधिनियम और वैज्ञानिक प्रक्रियाओं में जानवरों के इस्तेमाल के लिए अभ्यास के ब्रिटेन के गृह मंत्रालय संहिताओं के लिए सख्त पालन में इस परियोजना के तहत लाइसेंस नंबर 6004219 प्रदर्शन किया गया।
1. पी एस एम Explant विच्छेदन
- जंगली प्रकार (CD1) चूहों 13 के समय पर संभोग के द्वारा उत्पादित भ्रूण से पूंछ ऊतक प्राप्त करते हैं। संक्षेप में, भ्रूण दिन (ई) 10.5 पर, एक कार्बन डाइऑक्साइड कक्ष में गर्भवती दाता माउस euthanize। गर्भाशय सींग फसल और गृह मंत्रालय लाइसेंस प्रक्रियाओं या समकक्ष स्थानीय नियमों के अनुसार 1x बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) समाधान में जगह। एक टिशू कल्चर ताजा, बाँझ पीबीएस युक्त डिश के लिए गर्भाशय सींग स्थानांतरण। इस समाधान में बाद के सभी विच्छेदन चरणों का प्रदर्शन।
- एक stereomicroscope के तहत, घुमावदार कैंची का उपयोग गर्भाशय सींग की मोटी मांसपेशियों झिल्ली में कटौती और ध्यान से ठीक संदंश का उपयोग प्रत्येक भ्रूण निकाल सकते हैं। ध्यान रखेंयह सुनिश्चित करें कि पूंछ ऊतक इस प्रक्रिया में क्षतिग्रस्त नहीं है। घुमावदार कैंची और ठीक संदंश का प्रयोग, दूर काटना प्रत्येक भ्रूण से एमनियोटिक थैली, देखभाल करने के भ्रूण को नुकसान नहीं।
- रियर अंग कलियों को भ्रूण पीछे काटने से प्रत्येक भ्रूण की पूंछ ऊतक फसल के लिए या तो एक शल्य चिकित्सा सुई या घुमावदार कैंची का प्रयोग करें।
- दोनों संदंश और एक सुई का उपयोग कर नीचे शेष पूंछ ऊतक उदर-पक्ष। midline के साथ दो हिस्सों में पूंछ ऊतक विदारक द्वारा प्रत्येक भ्रूण पूंछ से पी एस एम explants के जोड़े उत्पन्न; एक सुई के साथ एक सौम्य कमाल की गति प्रदर्शन करते हैं। सुनिश्चित करें कि न्यूरल ट्यूब, पृष्ठदंड, और पी एस एम ऊतक समान रूप से दो explants के बीच बांटा जाता है।
- पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) संस्कृति के माध्यम (DMEM-F12 + 0.1% एल glutamine स्थानापन्न 10% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक की एक छोटी मात्रा में एक 35 मिमी प्लास्टिक संस्कृति डिश ढक्कन के नीचे पर प्रत्येक contralateral पी एस एम explant पिपेट , 10 एनएम मानव bFGF, और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन)। <li> ढक्कन के शीर्ष पर पकवान प्लेस और जल्दी से इसे पलटना तो यह है कि पी एस एम ऊतक के माध्यम से एक "फांसी ड्रॉप" में ढक्कन से निलंबित कर दिया है। संस्कृति 1 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified कक्ष में पी एस एम explants - 2 h।
- 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट के व्यक्तिगत कुओं के लिए पी एस एम explants की स्थानांतरण जोड़े। कमरे के तापमान (आरटी) या 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे रातोंरात (हे / एन) के लिए पीबीएस में 4% paraformaldehyde में सेते हैं। चेतावनी: Paraformaldehyde विषैला होता है, और उचित सुरक्षा उपायों जब इस समाधान के साथ काम कर लिया जाना चाहिए।
नोट: 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में बाद के सभी धोने और ऊष्मायन चरणों का प्रदर्शन। - 4 बार - पीबीएस में नमूना कुओं ताजा पीबीएस 3 के लिए नमूनों पर पीबीएस समाधान का आदान-प्रदान के लिए एक ठीक प्लास्टिक पाश्चर विंदुक का उपयोग कर, एक कमाल मंच पर आरटी पर धो लें। प्रत्येक जोड़ी में से एक पी एस एम explant प्रक्रिया immunohistochemistry (चरण 2) और एक ज्ञात घड़ी जीन के लिए सीटू संकरण में अन्य का उपयोग फ्लोरोसेंट का उपयोग कर (अजजाईपी 3)।
2. पी एस एम Explants की Immunohistochemistry
- प्रत्येक भ्रूण एक कमाल मंच पर आरटी पर 1 घंटे के लिए पीबीएस में 2% ट्राइटन X-100 में चरण 1 में उत्पन्न जोड़ी से एक पी एस एम explant धो लें, और फिर पीबीएस में नमूने कुल्ला संक्षेप। एक कमाल मंच पर 4 डिग्री सेल्सियस पर अवरुद्ध समाधान (2% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) और 10% सामान्य बकरी सीरम (NGS) में पीबीएस + 0.1% बीच 20) और सेते हे / एन के साथ नमूनों पर पीबीएस बदलें।
नोट: सभी बाद washes और इस खंड में ऊष्मायन कदम, एक कमाल मंच पर आरटी पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए जब तक अन्यथा कहा। धो समाधान आसानी से एक ठीक इत्तला दे दी प्लास्टिक या कांच पाश्चर विंदुक का उपयोग बदला जा सकता है। - काम कर बफर में वांछित प्राथमिक एंटीबॉडी / एंटीबॉडी पतला (0.1% बीएसए, 0.3% NGS, और पीबीएस में 0.2% ट्राइटन X-100)। इस उदाहरण में, बफर काम करने में Dll1 और Notch1 एंटीबॉडी 01:25 पतला।
नोट: अनुकूलन उचित कमजोर पड़ने कारक थी में आवश्यक निर्धारित करने के लिए आवश्यक हो जाएगारों कदम अगर वैकल्पिक एंटीबॉडी का इस्तेमाल कर रहे हैं। - एक कमाल मंच पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों - 3 के लिए एंटीबॉडी समाधान में explants सेते हैं। बफर काम कर कोई प्राथमिक एंटीबॉडी माध्यमिक एंटीबॉडी नियंत्रण के रूप में कार्य करने के लिए युक्त के साथ कुछ नमूने शामिल करना सुनिश्चित करें।
- एक पिपेट का उपयोग कर एक 1.5 एमएल भंडारण ट्यूब में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान की वसूली और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान।
नोट: बरामद प्राथमिक एंटीबॉडी कई बार इस्तेमाल किया जा सकता है, का इस्तेमाल किया एंटीबॉडी पर निर्भर करता है। - पीबीएस में 10 मिनट प्रत्येक, एक कमाल मंच पर 2% ट्राइटन आरटी पर पीबीएस में एक्स 100 में 10 मिनट प्रत्येक के लिए 3 washes के द्वारा पीछा - 5 के लिए नमूने के 2 washes प्रदर्शन करना।
- पतला fluorescently लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी / एंटीबॉडी बफर काम करने में (प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए मिलान मिलान / एंटीबॉडी) का इस्तेमाल किया। वैकल्पिक रूप से, नाभिक counterstain के लिए इस समाधान के लिए 20 माइक्रोग्राम / एमएल Hoechst 33342 जोड़ें।
नोट: अनुकूलन उचित कमजोर पड़ने कारक इस चरण में आवश्यक निर्धारित करने के लिए आवश्यक हो सकता है। इस ई मेंXAMPLE, 1 की एक कमजोर पड़ने कारक: 400 आम तौर पर इस्तेमाल किया गया था। - एंटीबॉडी समुच्चय के गठन को रोकने के लिए 16 XG पर 10 मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान अपकेंद्रित्र। अच्छी तरह से प्रत्येक नमूने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 500 μL, समाधान है, जो एंटीबॉडी समुच्चय हो सकती है कि पिछले कुछ microliters उपयोग नहीं करने के ख्याल रख रही है - 250 जोड़े।
- अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिन - प्रकाश जोखिम को कम करने और माध्यमिक एंटीबॉडी 3 के लिए समाधान में नमूने सेते टिन पत्र के साथ नमूना प्लेट कवर।
- बढ़ते नमूने के लिए, नमूने पीबीएस में 0.1% बीच 20 में 10 मिनट के प्रत्येक (PBST) और एक कमाल मंच पर आरटी पर पीबीएस में एक बार के लिए 5 मिनट के लिए दो बार धोने से पहले (चरण 4 देखें)।
3. फ्लोरोसेंट पी एस एम Explants की स्वस्थानी संकरण (मछली)
- तो एक विकल्प के बर्तन में जमा हो जाती है, एक 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट के व्यक्तिगत कुओं के लिए शेष contralateral पी एस एम explants हस्तांतरण।
- के लिए नमूने धोPBST में 50% इथेनॉल में 10 मिनट, और फिर 2 washes के 10 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में प्रत्येक एक कमाल मंच पर आरटी पर ऊतक निर्जलीकरण के लिए प्रदर्शन करते हैं।
नोट: सभी बाद washes और इस खंड में ऊष्मायन कदम, एक कमाल मंच पर आरटी पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए जब तक अन्यथा कहा। - PBST में 50% इथेनॉल में 10 मिनट के लिए धोने से ऊतक rehydrate, PBST में 5 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार धोने के द्वारा पीछा किया।
नोट: कदम 3.2 और 3.3 आवश्यक निर्धारण इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक कदम उठाए हैं और लोप नहीं किया जा सकता। - आंदोलन के बिना 5 मिनट के लिए पीबीएस (PBST) में 0.1% बीच 20 में से 10 माइक्रोग्राम / एमएल proteinase कश्मीर नमूने सेते हैं। जल्दी proteinase कश्मीर को हटाने और PBST में 4% formaldehyde + 0.1% glutaraldehyde में 30 मिनट के लिए ऊतक के बाद तय करने से पहले PBST के साथ संक्षिप्त नमूने कुल्ला। चेतावनी: दोनों formaldehyde और glutaraldehyde विषाक्त कर रहे हैं, और उचित सुरक्षा उपायों जब इन समाधान के साथ काम कर लिया जाना चाहिए।
नोट: निम्न धोनेऔर ऊष्मायन 50% और 100% संकरण घोला जा सकता है (कदम 3.6 - 3.9) से जुड़े कदम आंदोलन के बिना किया जाना चाहिए। - PBST में 10 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार के नमूने धोने के बाद, एक बार नमूने 50% संकरण मिश्रण में (उपयुक्त intronic जांच के लिए धोने: 50% formamide, 5x खारा सोडियम साइट्रेट (एसएससी), 5 मिमी EDTA, 50 माइक्रोग्राम / एमएल tRNA, 0.2% बीच 20, 0.1% एसडीएस, और PBST में 100 माइक्रोग्राम / एमएल हेपरिन) आरटी पर तैयार किया। आंदोलन के बिना 65 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इस समाधान में नमूने सेते हैं।
- 65 डिग्री सेल्सियस पर (48 घंटे तक) ≥ 2 घंटे के लिए संकरण मिश्रण में नमूने incubating से पहले पूर्व गर्म (65 डिग्री सेल्सियस) संकरण मिश्रण के साथ दो बार कुल्ला नमूने (अब ऊष्मायन बार परिणामस्वरूप संकेत करने वाली शोर विपरीत में सुधार) । पिछले चरण से संकरण मिश्रण निकालें, और 0.25 के साथ की जगह - पूर्व गर्म के 0.5 एमएल (65 डिग्री सेल्सियस) संकरण से युक्त एक digoxigenin (डीआईजी) एक ज्ञात विभाजन घड़ी घटक के खिलाफ विरोधी भावना आरएनए जांच -labeled मिश्रण।
नहींई: उदाहरण के लिए, एक intronic पागल फ्रिंज (Lfng (i)) जांच 20 μL / एमएल की एकाग्रता में इस्तेमाल किया गया था नवजात Lfng mRNA पता लगाने के लिए। इस चरण में इस्तेमाल किया कमजोर पड़ने जांच पर निर्भर है और अनुकूलन की आवश्यकता होगी। - प्लेट चिपचिपा टेप का उपयोग वाष्पीकरण को रोकने और 65 डिग्री सेल्सियस पर दो रातों के लिए जांच के समाधान में नमूने सेते हैं सील।
- एक ठीक इत्तला दे दी प्लास्टिक पाश्चर विंदुक का प्रयोग, पुन: उपयोग करने के लिए जांच की वसूली और 20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान। पूर्व में 65 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट प्रत्येक के लिए नमूने दो बार धोने से पहले पूर्व गर्म (65 डिग्री सेल्सियस) के बाद संकरण मिश्रण (50% formamide, 0.2% बीच 20, और 1x एसएससी) के साथ दो बार कुल्ला नमूने बाद के संकरण मिश्रण गरम।
- नमूने 15 मिनट के लिए Tris बफर नमकीन घोल (TBST) में 0.1% बीच 20 में पूर्व गर्म 50% संकरण मिश्रण में 65 डिग्री सेल्सियस पर धो लें। एक कमाल मंच पर TBST में आरटी पर 30 मिनट के लिए धोने से पहले TBST के साथ दो बार नमूने कुल्ला।
- पूर्व सेते blo में explantscking समाधान (TBST + 2% बफर अभिकर्मक (BBR) + 20% गर्मी का इलाज बकरी सीरम अवरुद्ध) 2 घंटे की एक न्यूनतम के लिए। ताजा अवरुद्ध एक 1 युक्त समाधान के साथ इस समाधान बदलें: हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) के 200 कमजोर पड़ने संयुग्मित विरोधी digoxigenin एंटीबॉडी। 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने हे / एन सेते हैं।
- एंटीबॉडी ऊष्मायन के बाद, आरटी पर नमूने TBST के साथ 3 बार कुल्ला और उन्हें एक नया 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट के व्यक्तिगत कुओं के लिए स्थानांतरण। 1 घंटे के लिए 3 बार TBST के साथ explants धो लें।
- इस बिंदु पर, 0.5 एमएल भंडारण ट्यूब या एक 48 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में नमूने हस्तांतरण निम्न चरणों में Tyramide संकेत प्रवर्धन (टीएसए) का पता लगाने अभिकर्मकों के लिए आवश्यक मात्रा को कम करने के लिए।
- आंदोलन के रूप में संभव के रूप में छोटे एक मात्रा का उपयोग करते हुए, यह सुनिश्चित करना है कि नमूने पूरी तरह से समाधान में डूब रहे हैं बिना 1 मिनट के लिए आरटी पर टीएसए प्रवर्धन बफर में नमूने (अभिकर्मकों सूची देखें) सेते हैं।
- टीएसए अभिकर्मक जोड़ें (देखेंअभिकर्मकों सूची) 1:50 कमजोर पड़ने पर नमूना प्रवर्धन बफर करने के लिए। जल्दी से, समाधान मिश्रण जब तक टीएसए अभिकर्मक समान रूप से वितरित किया जाता है प्लेट या टिन पत्र में ट्यूबों को कवर किया, और 60 के लिए नमूने सेते हैं - अंधेरे में 90 मिनट।
- टीएसए प्रवर्धन समाधान निकालें और 5 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार TBST में नमूने धो लें। 1 घंटे के लिए TBST में धोने की मात्रा बढ़ाने के लिए और 1% हाइड्रोजन पेरोक्साइड में नमूने सेते 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट पर वापस explants स्थानांतरण। 5 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार TBST के साथ नमूने धो लें, और फिर प्रत्येक 5 मिनट के लिए दो बार PBST के साथ बढ़ते नमूना करने से पहले (चरण 4 देखें)।
4. इमेजिंग के लिए नमूना तैयार
- 0.12 एमएम मोटी इमेजिंग स्पेसर, जो एक coverslip के अलावा द्वारा कुचल दिया जा रहा से नमूने को रोकने जोड़कर प्रत्येक explant जोड़ी के लिए एक आरोप लगाया आसंजन गिलास स्लाइड तैयार करें। एक स्पेसर में से एक सतह से चिपकने वाला लाइनर निकालें और एक गिलास स्लाइड पर यह चिपकने वाला पक्ष नीचे जगह, दबाव चirmly स्लाइड के लिए स्पेसर सील करने के लिए।
नोट: शेष चरणों के लिए, कम रोशनी में या अंधेरे में रखने के लिए नमूने photobleaching से बचने का प्रयास करेंगे। एक तैयार स्लाइड पर पिपेट explant जोड़े स्पेसर के केंद्र के भीतर एक गिलास पाश्चर विंदुक का उपयोग, यह सुनिश्चित करना है कि explant के विच्छेदित ओर स्लाइड चेहरे। कंधे से कंधा मिलाकर explants की contralateral जोड़े की व्यवस्था। - एक गिलास पाश्चर विंदुक का उपयोग स्लाइड से जितना संभव हो उतना तरल निकालें और मुड़ा कम एक प्रकार का वृक्ष ऊतक कागज के एक टुकड़े का उपयोग कर नमूने आसपास के किसी भी अवशिष्ट नमी बाती।
- , 60 एस जब तक ऊतक चिपचिपा और पारदर्शी प्रकट करने के लिए शुरू होता है - नमूने 45 के लिए स्लाइड का पालन करने की अनुमति दें। इस समय के दौरान, संदंश का उपयोग स्पेसर से शेष चिपकने वाला लाइनर को हटा दें। नमूने बाहर सुखाने के लिए अनुमति न दें।
- एक बड़े नमूनों के लिए (90% ग्लिसरॉल में 0.5% पी-PHENYLENEDIAMINE और 20 मिमी Tris, पीएच 8.8,) दोहरे समारोह mountant और समाशोधन समाधान की बूंद केंद्र के भीतर जोड़ेस्पेसर की। नोट: जब oxidize करने की अनुमति दी यह समाधान भूरे / काले बदल जाता है।
- ध्यान से नमूने भर में एक परिपत्र coverslip (सं। 1.5) जगह है, यह सुनिश्चित करना कि mountant समान रूप से वितरित किया जाता है और coverslip के सभी किनारों स्पेसर के साथ संपर्क बनाने कि। कवर फिसल स्लाइड उल्टा कुछ कम एक प्रकार का वृक्ष टिशू पेपर पर रखें।
- यह सुनिश्चित करने के लिए पूरी तरह से coverslip स्पेसर का पालन करता है और कहा कि किसी भी अतिरिक्त mountant निकाल दिया जाता है मजबूती से नीचे प्रेस। कोई और अधिक mountant blots कागज तक दोहराएँ।
- स्वच्छ और स्लाइड (s) उचित रूप से लेबल, और जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर इमेजिंग, अल्पकालिक या -80 डिग्री सेल्सियस पर लंबे समय तक अंधेरे में उन्हें दुकान। भंडारण से स्लाइड हटाने के बाद, उन्हें पूरी तरह से इमेजिंग से पहले पिघलना करने के लिए अनुमति देते हैं।
- छवि टाइलों के अधिग्रहण और एक उच्च वृद्धि के उद्देश्य के साथ एक confocal खुर्दबीन का उपयोग घुड़सवार नमूने हैं। छवि एक 40x तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग explant जोड़े 4-माइक्रोन जेड अंतराल पर 488 एनएम, 568 एनएम और 647 एनएम लेजर का उपयोग कर लीएनईएस, हरे, लाल, और दूर लाल fluorophores, क्रमशः, इस अध्ययन के 12 में प्रोटीन और mRNA का पता लगाने के लिए कार्यरत उत्तेजित करने के लिए।
नोट: टाइलों छवियों विश्लेषण के लिए एक एकल छवि बनाने के लिए अधिग्रहण के बाद सिले थे।
5. पोस्ट-अधिग्रहण छवि विश्लेषण
- प्रत्येक प्रयोगात्मक नमूने के पी एस एम के भीतर ब्याज की एक क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें।
- एक नहीं, प्राथमिक नियंत्रण नमूना बाद में मात्रा का ठहराव के लिए पहले के स्तर पर अभिव्यक्ति के स्तर, घटाना पृष्ठभूमि और सीमा छवियों यों। एक मूल, एक धुरी, और प्रत्येक नमूने के लिए एक इकाई लंबाई को परिभाषित करें।
- एम नमूने 12 में से प्रत्येक के लिए सामान्यीकृत rostro दुम अक्ष के साथ स्थिति के एक समारोह के रूप में प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना। तीव्रता भूखंडों को सामान्य बनाने के बाद, कंधे से कंधा मिलाकर तीव्रता प्रोफाइल जगह और एक तीव्रता मैट्रिक्स एफ (मैं, जम्मू) है कि मैं पर तीव्रता का वर्णन प्राप्त
6. नमूने के टेम्पोरल आदेश
- एक ज्ञात घड़ी घटक के अस्थायी आदेश देने अनुमान है, इसकी तीव्रता मैट्रिक्स को परिभाषित। फिर, इतनी के रूप में एक अस्थायी आवधिक पैटर्न प्राप्त करने के लिए तीव्रता मैट्रिक्स के कॉलम को पुनर्व्यवस्थित। ऐसा करने के लिए समारोह को परिभाषित
जहां एक (च जम्मू, कश्मीर) जम्मू वें एफ और एक टी के स्तंभ के autocorrelation समारोह का प्रतिनिधित्व लक्ष्य autocorrelation समारोह, पैटर्न के अस्थायी अवधि को लागू करने के लिए चुना, द्वारा दी गई है
- महानगरों-हेस्टिंग्स (या किसी अन्य न्यूनीकरण एल्गोरिथ्म) 12 उपयोग के नमूने है कि कम से कम छ समारोह के आदेश की पहचान। इस प्रकार, के क्रम का निर्धारणएम नमूने है कि एक ज्ञात घड़ी घटक के अस्थायी अवधि अधिकतम हो।
- एम नमूनों की अनुमानित अस्थायी आदेश देने का उपयोग करना, भागीदारी चैनल 12 में अभिव्यक्ति पैटर्न के लिए एक आदेश दिया kymograph का निर्माण।
Representative Results
इस प्रोटोकॉल माउस पी एस एम 12 में घड़ी जीन प्रतिलेखन के साथ ब्याज की एक प्रोटीन के spatiotemporal प्रोफ़ाइल के दृश्य परमिट। उदाहरण के लिए, Dll1 (चित्रा 1 ए सी) और Notch1 (चित्रा 1 डी-एफ) प्रोटीन अभिव्यक्ति पायदान विनियमित विभाजन घड़ी जीन Lfng की नवजात प्रतिलेखन के साथ synchrony से बाहर कांपना करने के लिए दिखाए जाते हैं। Dll1, Notch1, और Lfng (i) पी एस एम (चित्रा 1G) की Antero पीछे (एपी) अक्ष के संबंध में संकेत तीव्रता इन लक्ष्यों (चित्रा 1H-जे) के लिए स्पष्ट oscillatory अभिव्यक्ति की गतिशीलता का पता चलता है की मात्रा। घड़ी चक्र के दौरान Dll1 और Notch1 प्रोटीन अभिव्यक्ति के spatiotemporal प्रोफ़ाइल स्पष्ट रूप से कल्पना और उच्च संकल्प तय ऊतक छवि डेटा की अधिग्रहण के बाद छवि विश्लेषण के माध्यम से इस प्रोटोकॉल का उपयोग मात्रा रहे हैं।
चित्रा 1: स्थानिक-सामयिक दृश्य और Dll1 की मात्रा और Notch1 प्रोटीन अभिव्यक्ति गतिशीलता। (वायुसेना) में छह E10.5 भ्रूण (वायुसेना) का पता लगाने के साथ-साथ एक छमाही में Dll1 प्रोटीन (एसी) या Notch1 प्रोटीन (डीएफ) के स्थानिक वितरण दिखा Lfng पूर्व mRNA (Lfng (i)) से explants के जोड़े इसी प्रत्येक जोड़ी की contralateral आधा। के रूप में Lfng (i) अभिव्यक्ति के स्थानिक प्रोफ़ाइल द्वारा निर्धारित पैनलों, चरण 1 (ए और डी), चरण 2 (बी और ई), और विभाजन घड़ी चक्र के चरण 3 (सी और एफ) के अनुसार व्यवस्थित कर रहे हैं। Dll1 (हरा), Notch1 (लाल), और Lfng (i) (ग्रे) पी एस एम के Antero पीछे अक्ष के साथ अभिव्यक्ति के लिए डोमेन की हद ख हैकलर-कोडेड सलाखों के द्वारा सीमांकन een। बिंदीदार रेखा सबसे हाल ही में गठित विखंड (s), पी एस एम के बाहरी किनारों, और आसन्न तंत्रिका ऊतक (सी और ई) के पदों पर हदबंदी। स्केल सलाखों (नीचे प्रत्येक पैनल के लिए छोड़ दिया, वायुसेना) का प्रतिनिधित्व 100 माइक्रोन। (G) एक उदाहरण तीव्रता साजिश पी एस एम भर में संकेत तीव्रता में भिन्नता अक्षीय चित्रण। डेटा एक explant में Lfng पूर्व mRNA (काला हैश लाइन) दिखा contralateral explant में Notch1 प्रोटीन (लाल) (भ्रूण 1), साथ ही Lfng पूर्व mRNA (काला ठोस लाइन) में की तुलना में दो explant जोड़े से साजिश रची है एक और explant contralateral explant (भ्रूण 2) में Dll1 प्रोटीन (हरा) की तुलना में। मापा संकेत तीव्रता (शाफ़्ट) अक्षीय स्थिति के खिलाफ साजिश रची है (एक्स अक्ष; [एक] सही और पीछे पी एस एम [पी] बाईं ओर करने के लिए पी एस एम पूर्वकाल)। (एच) Dll1, Notch1, और Lfng (i) के स्थानिक वितरण दिखा एक kymograph भर मेंकई PSMs। kymograph की प्रत्येक पंक्ति में एक व्यक्ति पी एस एम explant के संकेत तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है। पंक्तियाँ Lfng पूर्व mRNA (मैं) एकाधिक घड़ी दोलनों में दिखाया गया डेटा की आवधिक विस्तार से नकली है के माध्यम से Dll1, Notch1, और Lfng (i) के spatiotemporal वितरण के spatiotemporal वितरण के अनुसार अस्थायी अनुक्रम में व्यवस्थित कर रहे हैं (एच) , Dll1 और Notch1 अभिव्यक्ति की गतिशीलता के oscillatory प्रकृति पर प्रकाश डाला। दुम पी एस एम में (जे) गुणवाला Notch1 प्रोटीन अभिव्यक्ति क्षेत्र में (मैं) से पता चला आभासी kymograph में सीमांकन की बढ़ाई से प्रकाश डाला है। संदर्भ 12. से संशोधित यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: Dll1 और Notch1 प्रोटीन अभिव्यक्ति की स्थानिक-सामयिक गतिशीलता की मात्रा। (ए) एक उदाहरण तीव्रता साजिश पी एस एम भर में संकेत तीव्रता में भिन्नता अक्षीय दर्शाया गया है। दो explant जोड़े से डेटा साजिश रची एक explant में Lfng पूर्व mRNA (काला हैश लाइन) दिखा contralateral explant छमाही में Notch1 प्रोटीन (लाल), साथ ही Lfng पूर्व mRNA (काला ठोस लाइन) एक से एक आधा explant में की तुलना दूसरी पूंछ दूसरे पूंछ की contralateral explant छमाही में Dll1 प्रोटीन (हरा) की तुलना में। मापा तीव्रता (शाफ़्ट) अक्षीय स्थिति के खिलाफ साजिश रची है (एक्स अक्ष; व्याख्यान चबूतरे [एक] सही और दुम [पी] बाईं ओर के लिए)। (बिहार) Kymographs कई PSMs भर Notch1, Dll1, एनआईसीडी, और Lfng (i) के स्थानिक वितरण दिखा। (बी और सी) एनआईसीडी (बी) और Dll1 (सी) पी एस एम वर्गों में अभिव्यक्ति; (डी और ई) Lfng (i) (डी) और Dll1 (<strong> contralateral explant हिस्सों में ई); (एफ और जी) contralateral explant हिस्सों में Lfng (i) (एफ) और Notch1 (G)। संदर्भ 12. से यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
वर्तमान प्रोटोकॉल एक संवेदनशील तरीका E10.5 माउस पी एस एम explants में निम्न स्तर के प्रोटीन अभिव्यक्ति और oscillatory गतिशीलता के मात्रात्मक विश्लेषण प्रदर्शन करने का वर्णन है। दोनों immunohistochemistry और सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरोसेंट के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल उच्च संकल्प द्वारा पीछा किया जाता है पूरे माउंट confocal इमेजिंग, और फिर छवि विश्लेषण और kymographs के अस्थायी विभाजन से पी एस एम भर में प्रोटीन अभिव्यक्ति का एक spatiotemporal नक्शे उत्पन्न करने के लिए। प्रोटीन और mRNA का पता लगाने में एक उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात इस तकनीक की सफलता सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है। देखभाल अच्छी तरह से चरण 3 के प्रासंगिक चरणों में धोने के चरणों के दौरान प्रभावी रूप से सभी के समाधान के आदान प्रदान और 65 डिग्री सेल्सियस washes के तापमान को बनाए रखने के लिए लिया जाना चाहिए यह समय स्रोत के लिए प्रभावशाली एंटीबॉडी और आरएनए के खिलाफ जांच लेने के लिए सबसे फायदेमंद है ब्याज की और लक्ष्य इन अभिकर्मकों परीक्षण करने के लिएअच्छी तरह से पूरे माउंट नमूने इस प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले पर।
संशोधन और समस्या निवारण
मुख्य मुद्दों है कि जब इस प्रोटोकॉल के प्रदर्शन का सामना करना पड़ा हो सकता है गरीब संकेत का पता लगाने ताकत और गुणवत्ता से उत्पन्न होती हैं। यह काफी हद तक एंटीबॉडी या आरएनए जांच, क्रमशः प्रोटोकॉल में immunohistochemistry या मछली कदम के लिए इस्तेमाल की प्रभावकारिता पर निर्भर है। पहले पर्याप्त संकेत का पता लगाने हासिल की है विभिन्न चरणों के एक नंबर अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। गरीब संकेत का पता लगाने के लिए एक आम कारण अनुचित निर्धारण होता है; यह जरूरी है कि या तो ताजा पीएफए या पीएफए कोई भी तुलना में अब सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत नमूनों को ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है। निर्धारण की लंबाई भी इस्तेमाल किया एंटीबॉडी या आरएनए जांच पर निर्भर करता है, अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। एंटीबॉडी के लिए, यह संभव जहां निर्माता के निर्देशों का पालन करने के लिए है, जबकि आरएनए जांच के लिए, हम प्रकाशित साहित्य के परामर्श को सलाह देने की सलाह दी है।
Lfng के पूर्व mRNA का पता लगाता है इस्तेमाल किया। बहुतायत के अपने रिश्तेदार की कमी के कारण, Lfng पूर्व mRNA का पता लगाने के संकरण अच्छा संकेत का पता लगाने के लिए 5x खारा सोडियम साइट्रेट (एसएससी) युक्त मिश्रण में जांच के साथ ऊष्मायन की एक लंबी अवधि की आवश्यकता है। एक ही परिस्थितियों अन्य जांच जो दुर्बलता से व्यक्त mRNAs पता लगाने के लिए आवेदन कर सकते हैं, लेकिन हमारे अनुभव में, अधिक स्थिर mRNA लक्ष्य का पता लगाने संकरण मिश्रण में एक छोटा जांच संकरण कदम और कम एसएससी सांद्रता (जैसे, 1.3x एसएससी) की आवश्यकता हो सकती है। दोनों immunohistochemistry और मछली के लिए, प्रोटोकॉल पहले पूरे भ्रूण पर अनुकूलित किया जाना चाहिए, और एंटीबॉडी या जांच के इष्टतम एकाग्रता अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए।
तकनीक की सीमाएं
जैसा कि ऊपर कहा, इस तकनीक की सफलता प्रोटीन और mRNA का पता लगाने की गुणवत्ता पर निर्भर है। डब्ल्यूई कैसे प्रोटीन और mRNA पता लगाने में सुधार किया जा सकता है के रूप में कई सुझाव रेखांकित किया है, लेकिन उच्च गुणवत्ता फ्लोरोसेंट संकेत का पता लगाने के अभाव में, वहाँ कोई रास्ता प्रयोग आगे बढ़ सकते है। प्रोटीन लक्ष्य की संख्या कि प्रत्येक ऊतक के नमूने में विश्लेषण किया जा सकता confocal खुर्दबीन के वर्णक्रमीय संकल्प से और इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के epitopes द्वारा सीमित है। इस अध्ययन में, हम प्रत्येक नमूना 12 पर एक डीएनए दाग के साथ प्रोटीन का पता लगाने के लिए तीन epitopes करने के लिए उपयोग करने में सक्षम थे। इस प्रोटोकॉल केवल एक mRNA लक्ष्य का पता लगाने के लिए परमिट हालांकि वर्तमान वैकल्पिक तरीकों के लिए तीन ठिकानों 14 को यह बढ़ाने के लिए नियोजित किया जा सकता है।
मौजूदा / वैकल्पिक तरीके के लिए सम्मान के साथ तकनीक का महत्व
विधि यहाँ वर्णित एक संवेदनशील तकनीक पूरे माउंट पी एस एम explants में निम्न स्तर के उतार चढ़ाव प्रोटीन का पता लगाने के लिए प्रदान करता है। इन गतिशीलता की मात्रा का ठहराव हैcontralateral explants इसी में एक ज्ञात घड़ी जीन के लिए मछली के प्रदर्शन से संभव है। kymographs के एक पुस्तकालय उत्पन्न होता है कि एक विभाजन घड़ी चक्र से अधिक का आयोजन किया जा सकता है, इस समय सीमा के भीतर ब्याज का लक्ष्य के spatiotemporal अभिव्यक्ति की गतिशीलता पर प्रकाश डाला। दूसरों पर इस तकनीक में एक महत्वपूर्ण अंतर कम्प्यूटेशनल स्वचालन के उपयोग के अस्थायी बड़े डेटा सेट है, जो उपन्यास घड़ी घटकों के spatiotemporal अभिव्यक्ति की गतिशीलता एक निष्पक्ष तरीके से विश्लेषण किया जा करने के लिए परमिट व्यवस्था करने के लिए है। उदाहरण के लिए, इस तकनीक को कैसे Dll1 और Notch1 प्रोटीन और उनके दोलनों सह विनियमित पूरे पी एस एम पार कर रहे हैं में अंतर्दृष्टि प्रदान की है। इस संदर्भ में वैकल्पिक तरीकों में भी immunostaining पर भरोसा किया है, लेकिन वे Dll1 और Notch1 दुम पी एस एम में प्रोटीन का स्तर है कि इस पद्धति का उपयोग स्पष्ट किया गया है में छोटे उतार चढ़ाव का पता नहीं लगा था। इसके बजाय, वे अभिव्यक्ति की एक सतत ढाल कि व्याख्यान चबूतरे वाला क्षेत्र 9 में सबसे मजबूत है सूचना
भविष्य के अनुप्रयोगों या दिशा-निर्देश तकनीक माहिर के बाद
एक बार जब इस प्रोटोकॉल में महारत हासिल किया गया है, उच्च throughput अभिव्यक्ति विश्लेषण पी एस एम में ब्याज की किसी भी प्रोटीन के लिए किया जा सकता है।कई माउस litters से उत्पन्न पी एस एम explants एक बार में कार्रवाई की जा सकती उच्च नमूना विश्लेषण के लिए आवश्यक संख्या उत्पन्न करने के लिए। हालांकि हम केवल इन अध्ययनों में जंगली प्रकार के भ्रूण का इस्तेमाल किया है, यह क्रम में प्रोटीन अभिव्यक्ति गतिशीलता पर एक या एक से अधिक कारकों के महत्व का आकलन करने में इस विश्लेषण आनुवंशिक रूप से संशोधित भ्रूण का उपयोग कर प्रदर्शन करने के लिए संभव है। पी एस एम के अलावा, इस प्रोटोकॉल अन्य प्रणालियों है कि दो contralateral हिस्सों से बना रहे हैं और संवेदनशीलता कम स्तर प्रोटीन अभिव्यक्ति और oscillatory गतिशीलता का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। के बाद से contralateral हिस्सों उत्पन्न किया जा सकता है और सुसंस्कृत, और पायदान गतिविधि दोनों वर्तमान और patterning 15 के लिए महत्वपूर्ण होने के लिए दिखाया गया है इसका एक उदाहरण है, जिसके लिए इस प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, माउस न्यूरल ट्यूब में गतिशील प्रोटीन अभिव्यक्ति का अध्ययन है। हम अन्य समूहों के अन्य प्रणालियों के लिए इस प्रोटोकॉल के अनुकूल करने के लिए और भविष्य में सुधार के लिए राय देने के लिए प्रोत्साहित करते हैं।
Acknowledgments
इस काम के लिए एक शाही एमआरसी छात्रवृत्ति, CSLB के लिए एक एमआरसी छात्रवृत्ति, और JKD (WT089357MA) के लिए एक गुम्मट परियोजना अनुदान द्वारा समर्थित किया गया। काम भी एक वेलकम ट्रस्ट सामरिक पुरस्कार (097945 / Z / 11 / जेड) द्वारा समर्थित किया गया। हम Dll1 एंटीबॉडी और Lfng आरएनए जांच के लिए डॉ ओ Pourquie की तरह का उपहार के लिए डॉ ई Kremmer धन्यवाद।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12 | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 11320033 | |
| GlutaMAX™-1 (100x) | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 35050 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10270106 | |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140122 | |
| anti-mouse monoclonal Notch1 antibody^ | BD Pharmingen | 552466 | |
| anti-rat polyclonal Dll1 antibody^* | N/A | N/A | |
| Lfng intronic anti-sense RNA probe^* | N/A | N/A | |
| 16% paraformaldehyde | Pierce (ThermoFischer Scientific) | PI28908 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche (Sigma-Aldrich) | 31158 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Made in house | N/A | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Normal goat serum (NGS) (heat-treated) | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 16210072 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFischer Scientific | H3570 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 46139 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Saline-sodium citrate (SSC) | Sigma-Aldrich | 93017 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | |
| tRNA | Roche (Sigma-Aldrich) | 101095 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Tris-buffered saline (TBS) | Made in house | N/A | |
| Blocking Buffer Reagent | Roche (Sigma-Aldrich) | 11096176001 | |
| anti-DIG horseradish peroxidase (HRP) conjugated antibody | Roche (Sigma-Aldrich) | 11207733910 | |
| Tyramide signal amplification (TSA) kit | Perkin Elmer | NEL744001KT | |
| *The Dll1 antibody and RNA probe used in this study are not commercially available. Please see acknowledgements for sources. | |||
| ^Antibodies/RNA probes should be sourced which are applicable to the research interests of the reader. | |||
References
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