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Methodenartikel

Labormaßstab Herstellung und Reinigung eines therapeutischen Antikörpers

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DOI:

10.3791/55153

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24. Januar 2017

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Pharmacy, University of Sydney

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines therapeutischen Antikörpers in einem Säugetier-Expressionssystem. Die beschriebenen Verfahren umfassen Herstellung von Vektor-DNA, stabile Transfektion und Serum-freie Adaption eines menschlichen Linie embryonalen Nieren-293-Zelle, von großen Kulturen und Reinigung unter Verwendung von Affinitätschromatographie eingerichtet.

Zusammenfassung

Die erfolgreiche Produktion eines therapeutischen Antikörpers beginnt bereits früh im Entwicklungsprozess. Die erste Stufe ist die Vektorexpression der Antikörpergene, gefolgt von einer stabilen Transfektion in eine geeignete Zelllinie. Die stabilen Klone werden einem Screening unterzogen, um diejenigen Klone mit den gewünschten Produktions- und Wachstumseigenschaften auszuwählen. Dies ist ein kritischer, wenn auch zeitaufwändiger Schritt in diesem Prozess. Dieses Protokoll berücksichtigt die Vektorauswahl und die Beschaffung von Antikörpersequenzen für die Expression eines therapeutischen Antikörpers. Die Verfahren beschreiben die Präparation von Vektor-DNA für die stabile Transfektion einer Suspensionsvariante der humanen embryonalen Nierenzelllinie 293 (HEK-293) unter Verwendung von Polyethylenimin (PEI). Die Zellen werden als adhärente Zellen in serumhaltigen Medien transfiziert, um die Transfektionseffizienz zu maximieren, und anschließend an serumfreie Bedingungen angepasst. Die Produktion im großen Maßstab, die als Batch-Overgrow-Kulturen eingerichtet ist, wird verwendet, um Antikörperprotein zu gewinnen, das durch Affinitätschromatographie mit einem automatisierten FPLC-Instrument (Fast Protein Liquid Chromatography) aufgereinigt wird. Die mit dieser Methode erzeugten Antikörperausbeuten können ausreichend Protein liefern, um mit der ersten Charakterisierung des Antikörpers zu beginnen. Dies kann die Entwicklung von In-vitro-Assays oder die physikalisch-chemische Charakterisierung umfassen, um die zeitaufwändige Aufgabe des klonalen Screenings nach Leitkandidaten zu erleichtern. Diese Methode kann auf die Entwicklung eines Expressionssystems zur Herstellung von Biosimilar-Antikörpern übertragen werden.

Einleitung

Der Erfolg von therapeutischen Antikörpern weiterhin erhebliche Investitionen in die Antikörperentwicklung zu fahren, als eine Welle der nächsten Generation Therapeutika beginnt. Der Antikörper - Markt wird erwartet , dass durch Antikörperfragmente 1, Antikörper-Wirkstoff - Konjugate 2, bispezifische Antikörper 3 und manipulierte Antikörper mit günstigen Eigenschaften 4 neu gestaltet werden. Eine andere Klasse pharmazeutischem Interesse zu gewinnen sind Biosimilars. Biosimilar-Antikörper sind "sehr ähnlich" replizieren Produkte eines therapeutischen Antikörper, der bereits die Zulassung erhalten hat. Eine vorgeschlagene Biosimilar muss mit dem Absender Antikörper in Bezug auf seine Struktur, Funktion, Tier Toxizität, klinische Sicherheit und Wirksamkeit, Pharmakokinetik beim Menschen (PK), Pharmakodynamik (PD) und Immunogenität 5, 6 vergleichbar sein.

Die Zulassung rAtes von Biosimilar-Antikörper auf die endgültige Qualität des Produkts aufgrund der strengen Einschränkungen langsam. Die genauen Herstellungsverfahren, wie spezifische Zelllinien und Kulturbedingungen bis hin zu den letzten Verarbeitungsschritte können proprietäre bleiben. Was mehr ist, beinhaltet die Herstellung von Antikörpern inhärent einen Grad an Variabilität, die einen sehr ähnlichen Produkt zur Herstellung der Herausforderung hinzufügen. Eine umfassende physikalisch - chemischen und biophysikalischen Charakterisierung und Vergleich ist ziemlich schwierig, noch eine Reihe von Studien die Merkmale biosimilar Antikörper entstehen in der Literatur 7, 8, 9 demonstriert.

einen therapeutischen Antikörper zu erzeugen beginnt mit Transfektion von Säugerwirtszellen mit einem Vektor, der die Gene für die jeweiligen Antikörper trägt. Vector Design, Zelllinie und Kulturbedingungen sind wichtige Überlegungen für die Ex-Einrichtungpression System.

Die DNA-Sequenzen von Antikörpern aus Drug Bank (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) oder Research-Publikationen einschließlich Patente bezogen werden. Beispielsweise ist die Sequenz von Trastuzumab erhältlich durch Drug Bank (DB ID: DB00072). Die Aminosäuresequenz der variablen Regionen können Gen-Design und die Optimierung für die Synthese in die gewünschten Wirtsspezies unterziehen. Es ist wichtig, für eine biosimilar Antikörper, der keine Modifikation der Aminosäuresequenz vorgenommen wird. Einmal synthetisiert, können Antikörpergene subkloniert in den entsprechenden Vektor der Wahl werden.

Humane IgG-Antikörper bestehen aus zwei identischen schweren Ketten und zwei identischen leichten Ketten. Eng regulierte Expression beider Ketten 10 für eine optimale Produktion von heterologen IgG - Protein in Säugerzellen wesentlich. Intra- als auch Inter-Ketten-Disulfidbindungen, so ausgebildet und eine Reihe von post-translationalen Modifikationen werden müssen, werden inwährend der Proteinbiosynthese eingeführt. Eine Reihe von Vektoren zur Verfügung, die speziell zum Ausdruck Antikörpergene (siehe Tabelle der Materialien) entwickelt wurden. Diese Antikörper-spezifischen Vektoren Express in der Regel die konstanten Regionen für die schweren und leichten Ketten, so dass nur die variablen Regionen jeder Kette Klonen erfordern.

Die Transfektion von Zellen mit zwei unabhängigen Konstrukte (Co-Transfektion) ist die am häufigsten verwendete Ansatz für die Bereitstellung von schweren und leichten Kette kodierenden Gene. Das heißt, jedes Gen mit seinem eigenen Promotor transkribiert und als getrennte Antikörperketten angetrieben, bevor sie in das endoplasmatische Retikulum montiert. Auf der anderen Seite haben Mehr cistronische Vektoren IRES (IRES) -Elemente eingebaut , das mit Übersetzung aus dem inneren Regionen der mRNA 11 erlaubt die Expression von mehreren Genen als eine einzelne mRNA - Transkripts zu ermöglichen. In diesem Fall werden die schwere und leichte Kette kodierenden Gene in einer arrang gekoppeltenement Coexpression beider Antikörperketten zu erreichen , 10, 12.

Während transient transfizierten Zellen ausreichend Protein ergeben eine begrenzte Anzahl von Versuchen durchzuführen, stabil transfizierten Zelllinien, die höhere Ausbeuten liefern Selektion für Genom-Integration unterzogen wurden. Höhere Proteinmengen ermöglichen Entwicklung Assay in - vitro - Charakterisierung im Zusammenhang und kann einen Hinweis auf Antikörper Qualität als Gegenleistung für Downstream - Anwendungen wie klonalen Zelllinie und Blei Kandidatenauswahl bieten.

Das Ziel dieses Artikels ist die stabile Expression und Reinigung eines therapeutischen Antikörpers in einem Säugerexpressionssystem zu beschreiben. Tatsächlich kann dieses Verfahren auf die Expression eines Antikörpers biosimilar angewendet werden. Das Verfahren kann für die anfängliche Charakterisierung von Antikörpern vor dem Fortfahren auf den kritischen, wenn auch zeitraubend Ste verwendet werdenps eines gewünschten Klon für größere Fertigungs identifizieren. Darüber hinaus kann dieses Verfahren verwendet werden, um andere Proteine ​​zu exprimieren und nicht nur Antikörper.

Die folgende detaillierte Protokoll beschreibt die Expression therapeutischer Antikörper Trastuzumab. Diese besteht aus Zubereitung DNA des Vektors durch stabile Transfektion in HEK-293-Zelllinie und Reinigung von Antikörperprotein durch ein automatisiertes chromatographische Verfahren gefolgt.

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Protokoll

HINWEIS: Eine geeignete Säugetier-Expressionsvektor muss für dieses Protokoll verwendet werden. Hier wird ein einziges Konstrukt , das zwei Expressionskassetten verwendet wird (dh schweren und leichten Kette Ausdruck wird durch separate Promotoren gesteuert). Trastuzumab schweren und leichten Ketten wurden zuvor in den Vektor geklont. Dieser Vektor war ein Geschenk von Andrew Beavil, 13 durch eine nicht-for-Profit - Plasmid - Repository erhalten.

1. Wiederherstellung und Scale-up von Vektor-DNA

HINWEIS: Die Vektor - DNA wurde als Weichagar Stichkultur in Escherichia coli XL-1 Blue Stamm erhalten; Vektor trägt Hygromycinresistenz.

  1. Legen Sie eine sterile Inokulation Stich- oder Schleife in den Weichagar der Stichkultur dann Streifen ein Luria Bertani (LB) Agar-Platte hergestellt mit 75 ug / ml für isolierte Kolonien Hygromycin. Die Platte bei 37 ° C für 18-24 Stunden.
  2. Impfen eine einzige Kolonie in 5 ml Terrific Broth (TB) 75 & mgr; g / ml Hygromycin enthält. IncuBATE die Kultur bei 37 ° C für 18 bis 24 Stunden mit 225 Umdrehungen pro Minute schütteln.
  3. Verwenden Sie die Nacht-Kultur ein Glycerolstammlösung von Vektor-DNA herzustellen, indem man sanft in einem Kryoröhrchen und gefrier bei -80 ° C mit 200 & mgr; l 80% Glycerin 800 ul Kultur mischen.
    1. 100 l der über Nacht - Kultur zu 100 ml TB mit 75 ug / ml Hygromycin in einem verwirrte Schüttelkolben (dh 1/1000 - Verdünnung). Inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C für 18 bis 24 Stunden mit 225 Umdrehungen pro Minute schütteln.
  4. Nachdem über Nacht Kultur, extrahieren und die DNA gemäß den Anweisungen des Herstellers von midi / maxi Vorbereitung Kit mit folgender Ausnahme zu reinigen; während der letzte Schritt, eluieren oder resuspendieren DNA mit Wasser (pH 7,0-8,5).
  5. Überprüfen Konzentration und Reinheit der DNA wurde durch Absorptionsablesungen bei 260 und 280 nm dann DNA bei -20 ° C.
    HINWEIS: Optional (empfohlen): DNA-Sequenz unter Verwendung von Vektor-spezifische Primer Identität zu bestätigen.

2. Stabile Transfektion von HEK-293-Zellen

  1. HEK-293-Zellen (Suspensionszellen) nach Standardprotokollen in serumfreiem Medium, supplementiert mit 0,1% nichtionisches Tensid in Erlenmeyerkolben wachsen und zu warten. Pflegen bei 2 x 10 5 Zellen / ml und Subkultur jeden vierten Tag. Kulturzellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 und 120 rpm Rotation.
    HINWEIS: Die Zellen sollten für nicht weniger als 4 Tagen in Kultur gewesen sein und nicht mehr als 4 Wochen vor der Transfektion. HEK-293-Zellen als Monoschichten in serumhaltigen Medien gezüchtet können auch für dieses Verfahren eingesetzt werden.
  2. Am Tag vor der Transfektion seed HEK-293 - Zellen bei 3 x 10 5 Zellen / ml in Wells einer 12-Well - Platte in 2 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle - Medium (DMEM) mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum ( FBS). Am Tag der Transfektion überprüfen, dass die Zellen 80-90% Konfluenz erreicht haben
  3. Verdünnen DNA und Polyethylenimin (PEI) separat in Transfektionsmedien dann zusammen mischen.
    1. Verdünnen 1,25 ug Vektor-DNA pro Vertiefung (15 & mgr; g für 12 Wells) in 300 & mgr; l Transfektionsmedien. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min.
    2. Verdünne 2,5 ul 1 mg / ml PEI - Lösung (30 & mgr; l für 12 Vertiefungen, dh 1: 2 - Verhältnis von DNA zu PEI) in 300 & mgr; l Transfektionsmedium. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min.
    3. In verdünnter DNA zu verdünnter PEI, vorsichtig mischen und für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
  4. Zugabe von 50 & mgr; l DNA / PEI-Mischung tropfenweise zu jeder Vertiefung der Platte. Schaukeln Sie die Platte vorsichtig das Transfektionsgemisch dann legen Sie die Platte bei 37 ° C, 5% CO 2 für 24 Stunden zu verteilen.
  5. In 50 ug / ml B pro Vertiefung Hygromycin und Rückplatte auf 37 ° C, 5% CO 2 für 10 Tage.
    HINWEIS: Mit dem 10. Tag, un-transfizierten Zellen werden von der Oberfläche der Platte sind gestorben und freistehend, während stabil transfizierten Zellen an der Platte lebens- und befestigt werden.
  6. Ersetzen Sie die Medien in Brunnen mit1/4 Volumen Serum-freie Medien und 3/4 Volumen DMEM mit 10% FBS (dh 0,5 ml Serum-freien Medien + 1,5 ml DMEM = 7,5% endgültige Serumkonzentration) , ergänzt und für 4 Tage inkubiert.
  7. Ersetzen Sie die Medien in den Vertiefungen mit 1/2 Volumen Serum-freie Medien und 1/2 Volumen DMEM , das mit 10% FBS (dh 1 ml Serum-freien Medien + 1 ml DMEM = 5% endgültige Serumkonzentration) und Inkubation für 4 Tage.
  8. Ersetzen Sie die Medien in den Vertiefungen mit 3/4 Volumen Serum-freie Medien und 1/4 Volumen DMEM , das mit 10% FBS (dh 1,5 ml Serum-freien Medien + 0,5 ml DMEM = 2,5% endgültige Serumkonzentration) und Inkubation für 4 Tage.
  9. Ersetzen Sie die Medien in den Vertiefungen mit 2 ml Serum-freien mit 0,1% nicht-ionisches Tensid (dh 0% endgültige Serumkonzentration) ergänzten Medium und Inkubation für 4 Tage.
    HINWEIS: Pflegen 50 ug / ml Hygromycin B selektiven Druck auf Zellen während der Serum-freie Adaption. Zellen angepasst serumfreien Medien von der Oberfläche der Vertiefungen trennen und i clustern kannn Suspension. Siehe Schritt 2.1 für Kulturbedingungen mit der zusätzlichen Aufschlag von 50 ug / ml Hygromycin B.
  10. Mit einer Pipette vorsichtig mischen die Suspensionskulturen in der 12-Well-Platte und Pool-Zellen in einem separaten Röhrchen.
    1. Verwendung eines Hämocytometer, aufzuzählen gepoolt Zellen und Samen in 30 ml serumfreiem Medium in einem Erlenmeyerkolben bei 2 x 10 5 Zellen / ml. Kulturzellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 und 120 rpm Rotation. Subculture und jeden vierten Tag erweitern.
  11. Weiterhin Kulturgröße erforderlich Zelldichte zu erweitern , auf 1 x 10 7 Zellen 10 zu erhalten Vials / Fläschchen zur Kryokonservierung in flüssigem Stickstoff. Einfrieren der Zellen in serumfreiem Medium, enthaltend 10% Dimethylsulfoxid (DMSO).
    HINWEIS: Die konditionierten Medien Antikörper enthalten, können bei jeder Subkultur geerntet werden Proteinproduktion zu bestätigen oder verwendet, um Reinigungsbedingungen zu optimieren. Zur Ernte konditionierten Medien und pflegen Zellen für Subkultur, Zentrifuge, die Kultur bei300 xg für 5 min, dann filter sterilisieren Überstand durch ein 0,22 um-Filter. Filtrierte Überstand bei 4 ° C für 1-2 Wochen und -20 ° C für die längerfristige Lagerung gehalten werden.

3. Große Antikörperproduktion von Batch überwuchern Kultur

HINWEIS: Die Antikörperproduktion von Schritt folgt auf werden können 2,11 wo vorhandene Zellen auf die gewünschte Zelldichte auf der Charge überwuchern Kulturvolumen auf Basis erweitert werden eingerichtet werden. Andernfalls Zellen, die aus der Kryokonservierung aufgetauten wurden zu diesem Zeitpunkt beginnen, wenn auf eine geeignete Zelldichte und das Volumen expandiert. Verschiedene Kultur Ergänzungen können Antikörper zur Optimierung der Produktion verwendet werden; die Verwendung von Trypton zu erhöhen Antikörper Ausbeute in diesem Protokoll demonstriert.

  1. Samenzellen bei 2 x 10 5 Zellen / ml in 100 ml serumfreiem Medium in zwei Erlenmeyerkolben (Antikörper Ausbeuten aus un-supplementierten und nährstoff ergänzt Kulturen zu vergleichen). Kultur bei 37 ° C, 5% CO 2 und 120 Umdrehungen pro Minute.
  2. Nach 24 Stunden Trypton bis zu einer Endkonzentration von 0,5% bis nährstoff ergänzten Kultur hinzuzufügen. Abgleichen Volumen von un-ergänzten Kultur mit Serum-freien Medien.
  3. Von Tag 8-Zellzahl der Kulturen täglich eine Zählkammer die Lebensfähigkeit der Zellen zu überwachen, ausführen. Ernte der Kulturüberstände, sobald die Lebensfähigkeit der Zellen weniger als 80%.
    1. Ernteüberstand durch Zentrifugation der Kulturen bei 3.000 xg für 15 min, dann filter sterilisieren den Überstand (enthaltend Antikörper) durch ein 0,22 um-Filter. Lagern Sie die Überstände bei 4 ° C (kurzfristig) oder einfrieren bei -20 ° C (langfristig).

4. Reinigung der Antikörper durch Affinitätschromatographie unter Verwendung eines automatisierten Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) -System

HINWEIS: Das folgende Verfahren kann in der Regel auf den meisten automatisierten Systemen angewendet werden. Die Reinigung kann bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C durchgeführt werden (wenn FPLC-System wird in einem kühlen Raum aufbewahrt).Eine Reihe von Scouting-Tests durchgeführt werden, um die optimale Reinigungsbedingungen einschließlich geeigneter Säulenmatrix, Bindungspuffer, Elutionspuffer und pH-Wert zu identifizieren maximale Rückgewinnung von gereinigtem Antikörper aus konditionierten Medien zu gewährleisten (zur Übersicht siehe Abschnitt). Die optimalen Bedingungen sind abhängig von der Antikörper oder das Protein gereinigt wird. Aufreinigungen wurden auf einem automatisierten FPLC-System durchgeführt. Aufreinigungen wurden bei Raumtemperatur unter Verwendung einer 5 ml Protein A-Säule durchgeführt.

  1. Bereiten Sie die folgenden Puffer Reinstwasser mit und stellen Sie dann mit dem empfohlenen pH-Wert ein 0,22 um Filter filtriert durch.
    1. Vorbereitung 1 l Phosphat - gepufferter Salzlösung (PBS) pH 7,4 (Bindungspuffer) durch Vermischen der folgenden: 0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,01 M Na 2 HPO 4 und 0,001 M KH 2 PO 4. Der pH-Wert, falls erforderlich, bevor die Puffer Filterung.
    2. Bereiten 500 ml 0,1 M Glycin-HCl pH 2,7 (Elutionspuffer). Der pH-Wert vor den Buff Filterunger.
    3. Vorbereitung 50 ml 1 M Tris pH 9,0 (Neutralisationspuffer).
  2. Stellen Sie sicher, alle Systemleistung und Kommunikationsverbindungen mit dem Computer hergestellt werden. Die Geräte müssen in der Software unter "Systemsteuerung" Modul sichtbar sein. Stellen Sie sicher, UV-Zelle bei 280 nm Wellenlänge eingestellt. Optional: Kalibrieren pH-Meter falls angeschlossen und verwendet werden.
  3. Tauchen Einlassrohre von A, B und Probenpumpe in Reinstwasser, um das System zu waschen. Spülen Sie die Pumpen mit einer Spritze, wenn Luft in den Schlauch oder ein Verdacht auf Luft im System ist. Waschen Sie das System mit Wasser durch eine manuelle Bedienung über die Systemsteuerung oder über ein automatisiertes Verfahren. Beachten Sie, dass der Druck, Leitfähigkeit, UV280 Verfolgung und pH-Wert konsistent bleiben und dass die Druckgrenze für die Spalte nicht überschritten wird laut Herstellerangaben.
    HINWEIS: Abnormalitäten kann Luft oder Verstopfung im System anzuzeigen, dass, bevor Sie fortfahren angegangen werden sollte.
  4. Bei dem System-Controller-Modul, starten Sie den Durchfluss, bei 1ml / min manuell über Pumpe A in jeder Last (unter Umgehung Probenschleife) oder (durch die Probenschleife) Position, um die Säule zu beginnen injizieren verbindet. Disconnect System Schlauch an der Spaltenposition Einlass und entfernen Sie den Stopfen mit dem Säuleneingang verbunden.
    1. Lassen Sie Wasser fließt aus dem System Schlauch tropfenweise auf der Oberseite der Kolonne dann schließen Sie den Systemschlauch an die Säule. Säuleneingang und Einlass Armatur mit Wassertropfen überfüllt sorgt für eine Verbindung frei von Luftblasen.
  5. Bringen Sie den Säulenausgang am stromabwärtigen Auslass und überprüfen alle Befestigungen fest angezogen sind. Mit der Säule jetzt an das System angeschlossen, nicht überschreiten Grenzwerte für maximale Druckgrenze und Fließgeschwindigkeit wie in Spalte Spezifikationen beschrieben.
  6. Waschen Säule mit 5 Säulenvolumina (CV) Wasser. Falls erforderlich, weiterhin Spalte Wäsche bis UV280 Tracing stabilisiert hat.
  7. Tauchen Einlassrohre von A in Bindungspuffer, B in Elutionspuffer und Probenpumpe in Bindungspuffer to das System in der richtigen Puffer ins Gleichgewicht. Füllen Sie die Einlassrohre mit Puffer PumpWash durch manuelle Bedienung verwendet wird.
  8. In dem Modul der Software "Method Editor", verwenden Sie die Methode Assistenten zur Einrichtung einer Affinitätschromatographie Methode für die Spalte, die verwendet werden soll.
    HINWEIS: Automatisierte FPLC Systeme kommen mit Methoden vorausgefüllt mit den empfohlenen Einstellungen (dh Fließgeschwindigkeit und Druckgrenze) und Stufen führen auf der Basis der Säule (Hersteller, Matrix und Größe) für die Reinigung ausgewählt.
    1. Verwenden Sie die folgenden Laufschritte für die Protein-A-Affinitätschromatographie:
      1. Äquilibrieren System mit 5 CV Bindungspuffer und sammeln Durchfluss in Abfallbehälter.
      2. Last Probe auf die Säule (Volumen geladen werden angegeben wird manuell in dem Verfahren) und zu sammeln Durchflußleistung in einen separaten Behälter.
      3. Wash-System mit 5 CV Bindungspuffer und Durchfluss in einen separaten Behälter zu sammeln.
      4. Eluieren Säule mit 5 CV isocratic-Fraktionierung unter Verwendung von Elutionspuffer und gereinigte Antikörper Probe als Fraktionen von Fraktionssammler sammeln.
      5. Äquilibrieren System mit 5 CV Bindungspuffer und sammeln Durchfluss in Abfallbehälter.
  9. Sobald das Verfahren aufgebaut ist, geben das Volumen der konditionierten Medien auf die Säule aufgebracht werden, und das Verfahren zu speichern.
    HINWEIS: Die angegebene Volumen in dem Verfahren sollte 5-10 ml kleiner als das tatsächliche Volumen Einführung von Luft während des Probelaufs zu vermeiden. Das angegebene Volumen in diesem Protokoll verwendet 90-120 ml.
  10. Tauchen Sie die Probenpumpenschlauch in das Gefäß die konditionierten Medien enthalten.
  11. Bereiten Sie einen separaten Behälter Probe Durchfluss über den angegebenen Ablaufschlauch zu sammeln.
    Hinweis: Es ist wichtig, den Durchfluss in dem Fall ein Fehler auftritt, während des Laufs oder die Bindungskapazität der Säule zu sammeln, um den Durchfluss überschritten erfordert an der Säule oder der Reinigung r erneut angewendet werdenepeated.
  12. Bereiten Sammelröhrchen in dem Fraktionssammler. 100 l Neutralisationspuffer pro 1 ml Fraktionsvolumen. Die FPLC-System automatisch die Fraktionen in den Sammelröhrchen eluieren.
  13. Im Modul "Systemsteuerung" der Software, öffnen Sie das Verfahren ausgeführt werden.
    HINWEIS: Die Methode Lauf wird in einer Reihe von Seiten initiiert, die die Variablen des Verfahrens, Fraktionssammler-Setup und die Definition Ergebnis Dateinamen und den Speicherort einschliessen.
  14. Klicken Sie auf Start, um den Lauf zu initiieren. Der Lauf kann in der "Systemsteuerung" Modul überwacht werden.
  15. Bei der Beendigung der Reinigung beginnen, prüfen Sie das resultierende Chromatogramm in der "Bewertung" Modul in der Systemsoftware.
  16. Kombinieren Sie alle Protein enthaltenden Fraktionen in einem separaten Röhrchen, Pufferaustausch und konzentrieren sich in PBS eine zentrifugale Filtervorrichtung mit 30 kDa Molekulargewicht unter Verwendung abgeschnitten. Führen Zentrifugationsschritte nach HerstellerAnleitung.
  17. Messung der Antikörperkonzentration unter Verwendung von Bicinchoninsäure (BCA) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  18. Wenn eine andere Reinigungslauf durchgeführt werden soll, Prime die Probenpumpenschlauch in Bindungspuffer und wiederholen Sie die Schritte 4,9-4,14.
  19. Bei der Beendigung der Reinigung läuft, tauchen Einlassrohre von A, B und Probenpumpe in Reinstwasser und waschen Sie das System und die Säule, wie in Schritt 3 durchgeführt.
  20. Versenken A, B und Probenpumpenschlauch in 20% Ethanol und wiederholen Waschverfahren für die Lagerung des Systems und Spalte.
  21. Ziehen Sie die Spalte aus der nachgeschalteten Auslass und Spalten Stopper ersetzen, trennen Sie dann Spalte am Eingang und dem Stopfen verschließen, schließen Schlauch an das System. Lagern Sie die Säule bei 4 ° C.

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Ergebnisse

Stabile Produktion von Trastuzumab durch transfizierte HEK-293 - Zellen wurde unter Verwendung von bio-Schicht Interferometrie bestätigt (BLI) , wie in Abbildung 1 dargestellt. Eine IgG - Standardkurve wurde durch Messung der Bindungsrate zwischen einer IgG - Antikörper und Protein A - Standard Biosensor (1A) erzeugt wird . Der rohe Überstand - Probe wurde in ähnlicher Weise gemessen, dann seine Konzentration aus der Standardkurve (1B) i...

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Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die Transfektion eine stabile Expression und Reinigung eines therapeutischen Antikörpers in HEK-293-Zellen. Eine stabile Expression von Antikörpergenen ist der erste Schritt eine Antikörper-produzierende Zelllinie für die Entwicklung und Herstellung eines therapeutischen Antikörpers bei der Erzeugung. Während Eizellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) die Expressionsplattform der Wahl für therapeutische Proteine ​​verbleiben, wird die HEK-293-Zelllinie Prominenz mit der Erkenntnis zu gew...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Die Forschung wurde von der University of Sydney unterstützt. pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ war ein Geschenk von Andrew Beavil (Addgene Plasmid # 61883). Wir danken Tihomir S. Dodev für die nützlichen Diskussionen bezüglich pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
pFUSE VektorserieInvivoGenN/ASchwere und leichte Antikörpergene, die in separaten Vektoren exprimiert werden und eine Co-Transfektion erfordern.
mAbXpress VektorserieACYTE Biotech Pty Ltd.Schwere und leichte Antikörpergene, die in getrennten Vektoren exprimiert werden und eine Co-Transfektion erfordern. Siehe: Jones, M. L. et al. Eine Methode zur schnellen, ligationsunabhängigen Reformatierung von rekombinanten monoklonalen Antikörpern. J Immunol-Methoden. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
pVITRO1-VektorN/AN/AGene für schwere und leichte Antikörper werden jeweils von einem separaten Promotor in einem einzigen Vektor gesteuert. Siehe: Dodev, T. S. et al. Ein Toolkit für die schnelle Klonierung und Expression rekombinanter Antikörper. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
GS-VektorserieLonzaMulti-cistronic Vektor mit schweren und leichten Antikörpergenen, die als einzelnes Transkript koexprimiert und translatiert werden.
Multi-cistronische Vektorreihe 1N/AN/AMulti-cistronischer Vektor mit schweren und leichten Antikörpergenen, die als einzelnes Transkript koexprimiert und translatiert werden. Siehe: Li, J. et al. Eine vergleichende Studie verschiedener Vektordesigns für die Säugetierexpression von rekombinanten IgG-Antikörpern. J Immunol-Methoden. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Multi-cistronischer Vektor Serie 2N/AN/AMulti-cistronischer Vektor mit schweren und leichten Antikörpergenen, die als einzelnes Transkript koexprimiert und translatiert werden. Siehe: Ho, S. C. et al. IRES-vermittelte Tricistronic-Vektoren zur Verbesserung der Bildung von hochgradig monoklonalen Antikörpern, die CHO-Zelllinien exprimieren. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κAddgene61883Säugetier-Expressionsvektor, der Trastuzumab-Antikörpergene mit Hygromycin-Resistenzgen enthält; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ war ein Geschenk von Andrew Beavil.
Fast-Media Hygro-AgarJomar Life Researchfas-hg-sWird zur Herstellung von salzarmem LB-Agar mit 75 & Mikro; g/ml Hygromycin.
Fast-Media Hygro TBJomar Life Researchfas-hg-lWird zur Herstellung von salzarmer TB-Brühe mit einem Gehalt von 75 &; micro; g/ml Hygromycin. 
Glycerin, BioXtra, ≥ 99%Sigma-AldrichG6279Zu 80% mit Wasser und Autoklav zubereiten. Bei Raumtemperatur lagern.
Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi KitAstral ScientificG221020Plasmid Maxi Prep Kit; Eluieren oder Resuspendieren von DNA in Wasser (pH 7,0-8,5).
FreeStyle 293-F CellsLife TechnologiesR790-07HEK-293 Zelllinie, angepasst an die Suspensionskultur in serumfreien Medien.
FreeStyle 293 Expression MediumLife Technologies12338-018Serumfreies Medium, das speziell für die Aufrechterhaltung der 293-F-Zelllinie und eine hohe Proteinexpression entwickelt wurde.
Kolliphor P188Sigma-AldrichK4894Nichtionisches Tensid; pluronisch F-68; auf 10 % in Wasser vorbereiten und mit 0,22 μm filtrieren-sterilisieren; m Filter. Bei 4 °C lagern.
DMEM, hoher Glukose Life Technologies11995-065
Hitzeinaktiviertes fötales RinderserumLife Technologies10082-147
Polyethylenimin, linear, MW 25.000 Polysciences, Inc.23966In Wasser auf 1 mg/ml auffüllen. Mit 1 M HCl auf pH 7,0 einstellen (Lösung wird klar) und mit 0,22 μm filtrieren; m Filter. Bei -80 Grad lagern; C bis zum Gebrauch.
OptiPro SFMLife Technologies12309-050Transfektionsformuliertes serumfreies Medium
Hygromycin B Lösung JomarLife Researchant-hg-1
Dimethylsulfoxid (DMSO)Thermo Fisher ScientificAJA2225
Trypton (Kasein, Pepton)Thermo Fisher ScientificLP0042BBereiten Sie auf 20 % PBS vor und sterilisieren Sie mit 0,22 μm; m Filter. Bei 4 °C lagern.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) Tabletten, pH 7,4, 100ml Astral Scientific09-2051-100
HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml SäuleSigma-AldrichGE17-0403-01
AKTApurifier 100GE Healthcare28406266Automatisiertes FPLC-System, das eine P-960-Probenpumpe und einen Frac-920-Fraktionssammler umfassen kann.
Glycin-HClSigma-AldrichG2879
Zitronensäure, MonohydratAstral ScientificBIOC2123
Natriumcitrat, Trinatriumsalzdihydrat Astral ScientificBIOCB0035
1 M Tris-HCl-Lösung pH 9,0Astral ScientificBIOSD8146
Amicon Ultra Zentrifugalfilter (30 MWCO)Merck MilliporeUFC803008/UFC903008Wird zum Puffern, Austauschen und Konzentrieren von gereinigtem Protein verwendet.
Pierce Bicinchoninsäure (BCA) Assay KitThermo Fisher Scientific23227
BLItz Systemforté BIO45-5000Gerät für Messungen der Bioschichtinterferometrie (BLI).
Protein A Biosensorenforté BIO18-5010
Acrylamid/Bisacrylamid (37,5:1), 40%ige LösungAstral Scientific786-502
Ammoniumpersulfat (APS)Astral ScientificAM0486
TEMEDAstral ScientificAM0761
Coomassie Brilliant Blue R-250Astral Scientific786-498
Precision Plus Dual-Color Protein StandardBio-Rad1610374

Referenzen

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